Name: Un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y In Vitro Fertilización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-06T19:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprende un protocolo de crioconservación de esperma de alto rendimiento en Danio rerio para biología reproductiva. Este método permite almacenar muestras viables durante más de siete años con una fertilidad media del 25%.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH R01 HG002995 &quot;cultivar el pez cebra genoma: un enfoque inverso Genética&quot; de CBM.

Parte A: Soluciones de congelar el semen 1. Ginsberg timbres de pescado (fresco hacer cada 3 días; Ginsburg, 1963) NOTA: el orden de adición ES IMPORTANTE para prevenir la precipitación En 450 ml de agua estéril ddH2O disolver: <ul><li> NaCl 3,25 g </li><li> KCl 0,125 g </li><li> • 2 H2O CaCl2 0,175 g A continuación, añadir: </li><li> NaHCO3 0,10 g </li></ul> Alcanzar un volumen final de 500 ml con ddH2O estéril y se almacenan a 4 ° C. 2. Medio de congelación (Haga fresco todos los días) <ol style="list-style-type:lower-roman"><li> SIN metanol <ul><li> Pescado Ginsburg Ringers 10 ml (temperatura ambiente). </li><li> Leche descremada en polvo 1,5 g </li></ul></li><li> Con metanol NOTA: el orden de adición ES IMPORTANTE para prevenir la precipitación <ul><li> Pescado Ginsburg Ringers 9 ml (temperatura ambiente). </li><li> 1 ml de metanol </li><li> Leche descremada en polvo 1,5 g </li></ul> Después de montar los medios de congelación, se mezcla bien durante 20 minutos. en un agitador orbital o una mecedora. Antes de usar, alícuota de 1 ml en tubos eppendorf, evitando las burbujas de la superficie. </li></ol> Parte B: Material necesario para la congelación de los espermatozoides Materiales necesarios para la congelación de los espermatozoides <ol><li> 10 pipetas desechables l (gato Fisherbrand # 22 a 358.697) </li><li> Vasos de 250 ml para los peces de agua que contiene MESAB / tricaína </li><li> Vidrios de reloj (gato Pyrex # 9985-75) </li><li> P20 Pipetman (o equivalente) y consejos </li><li> Esponja titular de los peces (para mantener hombres al momento de apretar) </li><li> Microscopio de disección con la iluminación del escenario por encima de </li><li> Pinza plana (por ejemplo, tipo Millipore) </li><li> 2,0 ml viales criogénicos (Corning cat # 430488) </li><li> 10X10 Cajas criogénicas (Nalgene gato # 03-337-7AA) </li><li> Espuma de poliestireno recipiente con unos 15 cm de ICE1 finamente molidas en seco </li><li> 15 ml tubos cónicos (Falcon # 352099) </li><li> Dewar frasco que contiene nitrógeno líquido </li><li> Pinzas largas (por ejemplo, CMS Fisher gato Cuidado de la Salud # 10-316B) </li><li> Cryogloves </li><li> Tanque de recuperación para los hombres </li><li> Un tubo eppendorf llena de medios de congelación sin metanol </li><li> Un tubo eppendorf llena de medios de congelación con metanol </li><li> Cryofreezer (por ejemplo, Taylor-Warton K-series) </li></ol> 1 Un método simple para la fabricación de hielo seco finamente triturada es envolverlo en una toalla y pulverizar con un martillo. Un método más eficiente es el uso de un molino de hielo seco, por ejemplo, el modelo Clawson RE-2. Parte C: Método de congelación de esperma <ol><li> MARK tubos capilares: Antes de comenzar, marcar los tubos capilares 10μl con una pluma de laboratorio en el nivel de 3,33 l (es decir, 16,7 mm de fondo, véase la Fig. 1.1.). </li><li> Anestesiar MASCULINO: masculino Lugar (s) en el vaso que contiene MESAB / tricaína diluido en agua de pescado (ver receta en &quot;El Libro de pez cebra&quot;) </li><li> Secar el pescado: Una vez anestesiado, levantar un pez fuera del anestésico con una cuchara de plástico y suavemente pescado seco en una toalla de papel, prestando especial atención al secado de la parte ventral. El agua activa el esperma lo que es importante que se seque completamente alrededor de la cloaca. Posición de los peces en el titular de la esponja, hasta la parte ventral (Fig. 1.2). Si la región alrededor de la aleta anal está todavía húmeda, ligeramente seco, con una Kimwipe. Tenga cuidado de no apretar el esperma antes de tiempo! </li><li> Lugar marcado en el tubo capilar adaptador de goma pipetear con la boca que se incluye con los tubos capilares. El adaptador es un tubo de goma que tiene una boquilla en un extremo y un soporte capilar en el otro. Alternativamente, el tubo capilar puede ser conectado a una jeringa Hamilton 50μl a través de un pequeño trozo de tubo Tygon con el diámetro apropiado. </li><li> Lugar en el ámbito masculino y exponer la apertura urogenital con cuidado la difusión de las aletas pélvicas separadas usando el extremo del tubo capilar. </li><li> Juntar esperma: expulsar esperma por acariciar suavemente los lados del pescado con unas pinzas suaves (por ejemplo, Millipore), o apretando suavemente los lados de los peces entre el dedo índice y el pulgar. Recoger los espermatozoides en un tubo capilar, ya que es expulsado con una suave succión (Fig. 1.2). Evitar que las heces pueden ser expulsados ​​con el esperma. </li><li> Normalizar el volumen de esperma A l 3.3: Si el volumen de esperma alcanza o sobrepasa la marca pluma en tubo capilar (es decir, 16,7 mm o más), continúe con el paso 8. Si el volumen de esperma no llegue a volumen de destino, normalizar el volumen de la marca pluma usando Medio de congelar sin metanol (Fig. 1.3). Mínima cantidad de esperma que es aceptable varía con la calidad de los espermatozoides. Espermatozoide bueno es blanco y opaco. Pobre de la esperma se ve aguada. En general, se acepta como mínimos: 1 l de esperma bien (o 1 / 3 de destino) y 2 l de esperma pobres (o 2 / 3 de destino). Volumen se ha normalizado a 3,3 l. </li><li> AÑADIR crioprotector a los espermatozoides: Aspire medio de congelación con Metanol para la marca naranja (aprox. volumen total es ahora de 20 l;. Figura 1.4). Expulsar a la mezcla de esperma y crioprotector en la zona limpia de un vidrio de reloj, con especial atención a no introducir burbujas. Mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo ~ 4 veces (evitar la introducción de burbujas). </li><li> LUGAR 10μl esperma en cada uno de 2 crioviales: Introducir 10 l de los espermatozoides: la solución de crioprotectores en la parte inferior de dos crioviales separadas que han sido etiquetados con la información relevante (Figura 1.5). Moviéndose rápidamente, los viales de la tapa y colóquelos en la parte inferior de la temperatura ambiente de 15 ml tubos Falcon, uno criovial / tubo. Cap Falcon tubo e insertar el par de criovial que contienen los tubos Falcon en hielo seco triturado. </li><li> Congelar el esperma durante 20 minutos. En hielo seco: El hielo seco debe ser en forma de polvo fino, no pellets. Los tubos se insertan en el hielo seco lo suficientemente profundo que sólo muestran sus límites (Fig. 1.6). Con el fin de realizar un seguimiento de los tubos en hielo seco, dar a cada par de tubos Falcon de un número de 1-20 (escrita en las tapas) y registrar el momento en que entra en el hielo seco. </li><li> LUGAR crioviales en nitrógeno líquido:. Después de que el esperma ha sido congelado en hielo seco durante 20 minutos, transferirlos a un átomo de nitrógeno líquido que contiene frasco de Dewar. Los espermatozoides se almacenan aquí hasta el momento de colocar en el congelador de nitrógeno líquido. Al colocar en las cajas del congelador, coloque el cuadro congelador en un baño de nitrógeno líquido para que las muestras no se calientan. Utilice pinzas largas de metal para recuperar frascos de vaso Dewar y manejar con cryogloves. Por otra parte, crioviales se pueden transferir directamente de hielo seco en el congelador si el congelador se mantienen sumergidas en nitrógeno líquido en un recipiente de espuma de poliestireno. </li><li> Crioviales almacenar a largo plazo en un congelador de nitrógeno líquido criogénico. Para mantener la viabilidad de los espermatozoides, es importante que los viales se almacenan sumergidos en nitrógeno líquido. En nuestra experiencia, los frascos almacenados en la fase de vapor pierden su viabilidad en el tiempo. La velocidad es importante! El tiempo entre la adición del crioprotector y la colocación de los viales de esperma en hielo seco (es decir, los pasos 6-10) no debe ser mayor de 30 seg. </li></ol> Parte D: En el método de fertilización in vitro con esperma criopreservados Nos parece que esto funciona mejor con dos personas. Una persona aprieta los huevos de las hembras, mientras que la otra persona se descongela el semen. <ol><li> Establecer un baño de agua a 33 ° C. </li><li> Quitar criovial del congelador de nitrógeno líquido y la transferencia de nitrógeno líquido que contiene frasco Dewar hasta que esté listo para descongelar. </li><li> Apriete los huevos de las hembras en el plato de plástico de 35 mm de Petri. Si es posible, tratar de obtener tres nidadas de huevos y se combinan en un plato. Si usted no puede conseguir tres garras bien dentro de 1 minuto de su primera nidada, a continuación, proceder al paso 4 (un embrague bueno es suficiente). Definición de embrague bien:&gt; 150 huevos en busca de manera uniforme bonito (amarillo, es decir, sin residuos blancos indicador de una degradación). Mantenga plato cubierto mientras que el esperma descongelado. </li><li> Retire el vial de nitrógeno líquido y se quite la tapa. Vial rápidamente sumergirse ~ 1 / 2 camino a 33 ° C baño de agua de 8.10 seg. </li><li> Añadir rápidamente a temperatura ambiente 70 l Hanks al vial y mezclar pipeteando arriba y hacia abajo. Inmediatamente agrega a los huevos y mezclar suavemente con la punta de la pipeta. </li><li> Sin demora, activar esperma y los óvulos mediante la adición de 750 peces de agua l. Agitar para mezclar. Incubar 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Después de 5 minutos, llenar con agua los peces plato y plato se incuba a 28 ° C. Después de 2-3 horas, el recuento y la transferencia de embriones fértiles a los platos de 100 mm (50/dish). Conteo de huevos infértiles para que la frecuencia de fertilización se puede determinar. </li><li> Tenga mucho cuidado de las larvas! Durante los primeros 5 días, el cambio diario del agua y eliminar embriones muertos. Ponga las larvas sólo tienen vejigas natatorias en vivero en el día 5. </li></ol> Parte E: Resultados Representante Hemos utilizado esta metodología crypreservation para hacer una biblioteca de 8.600 muestras de semen congelado para la labranza, entre los años 2001 y 2003. Hemos descongelado 106 de estas muestras y se determinó su fertilidad. La fertilidad es la proporción de embriones viables producidos en una fertilización in vitro, dividido por el número total de huevos que fueron fecundados con el esperma congelado. Fresco (no cryporeserved) esperma normalmente tiene la fertilidad&gt; 95%; espermatozoides criopreservados ha fertilidad mucho más baja: un promedio de 29% (n = 106 viales). La variabilidad de vial a vial de la fertilidad es muy grande, que van desde menos del 1% hasta un máximo de 62%. Esta variabilidad está representada por las barras de error grande que representa la desviación estándar de la figura. 2. Sin embargo, en 106 muestras de semen descongelado hasta la fecha sólo hemos experimentado una vez la fertilidad del 0% en las muestras de esperma de ambos y no logró recuperarse de la mutación labranza correspondiente. Por el deshielo frascos de esperma de la biblioteca a lo largo de varios años (2001-2008) se ha encontrado que el promedio de fertilidad de las muestras de esperma congelado por este método sigue siendoestable en el tiempo (Fig. 2). La fecundidad promedio de las muestras de esperma congelado se descongela en 2001 fue del 23,5% (basado en 11 muestras de semen) y en 2008 fue del 25% (basado en 21 muestras de semen). Un número de otros investigadores están usando este protocolo de congelación de esperma en sus laboratorios. Algunos han reportado buenos resultados con las tasas de fecundidad y la variabilidad de la muestra a la muestra similar a lo que hemos observado. Otros no han logrado convencer para que este protocolo de trabajo en sus manos. Creemos que las posibles fuentes de problemas son: <ol><li> Si no se utiliza la crioviales exacta o tubos cónicos que hemos sugerido en el protocolo, lo que lleva a un ritmo diferente de la hipotermia cuando en hielo seco; </li><li> Si no se utiliza hielo seco en polvo, dando lugar a una velocidad de enfriamiento debajo del nivel óptimo; </li><li> Utilizando los peces machos de baja fertilidad: usted debe obtener al menos 1 l de esperma de un macho. También puede probar la fertilidad masculina haciendo una fertilización in vitro con semen fresco, sin embargo esto puede ser engañoso ya que tiene muy poco semen fresco para obtener casi el 100% de fertilidad. </li><li> Utilizando debajo de los estándares de calidad en los huevos de la fecundación in vitro. Usando nada más que perfecto garras siempre lleva a cerca de 0% de fertilidad, aunque a partir de muestras de semen que en realidad tienen una buena fertilidad (sobre la base de la fertilidad del vial duplicado). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquema de la metodología de congelar el semen. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Fertilidad del semen criopreservadas se mantiene estable en el tiempo. Fertilidad por ciento es el número de embriones viables producidos en una fertilización in vitro, dividido por el número total de huevos que fueron fecundados con el esperma congelado. &quot;N&quot; se refiere al número de viales de semen crioconservado cuya fertilidad ha sido probado en el año correspondiente. Las barras de error representan la desviación estándar. Dado que cada vial de esperma es de un hombre diferente, vial a vial variabilidad que se observa.

<ol><li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li>
<li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zoology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li>
</ol>

Un número de otros investigadores están usando este protocolo de congelación de esperma en sus laboratorios. Algunos han informado de la fertilidad similar y la misma muestra de la muestra de la variabilidad que hemos observado. Otros no han logrado convencer para que este protocolo de trabajo en sus manos. Creemos que las posibles fuentes de problemas son: <ol><li> Si no se utiliza la crioviales exacta o tubos cónicos que hemos sugerido en el protocolo, lo que lleva a un ritmo diferente de la hipotermia cuando en hielo seco; </li><li> Si no se utiliza hielo seco en polvo, dando lugar a una velocidad de enfriamiento debajo del nivel óptimo; </li><li> Utilizando los peces machos de baja fertilidad: usted debe obtener al menos 1 l de esperma de un macho. También puede probar la fertilidad masculina haciendo una fertilización in vitro con semen fresco, sin embargo esto puede ser engañoso ya que tiene muy poco semen fresco para obtener casi el 100% de fertilidad. Más grandes, los machos con mayor fuerza de color suelen dar más espermatozoides de mayor calidad. </li><li> Utilizando debajo de los estándares de calidad en los huevos de la fecundación in vitro. Usando nada más que perfecto garras siempre lleva a cerca de 0% de fertilidad, aunque a partir de muestras de semen que en realidad tienen una buena fertilidad (sobre la base de la fertilidad del vial duplicado). </li></ol>

<table><tbody><tr><td>10 &amp;mu;l de pipetas desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-358697</td><td></td></tr><tr><td>Placas de reloj</td><td>Pyrex</td><td>9985-75</td><td></td></tr><tr><td>Viales criogénicos de 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Cajas criogénicas de 10 x 10</td><td>Nalge Nunc international</td><td>03-337-7AA</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 15 ml</td><td>Falcon BD</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Tenazas</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316B</td><td></td></tr><tr><td>Criofrigorífico</td><td>Taylor-Wharton</td><td>K-series</td><td>Por ejemplo</td></tr></tbody></table>

un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y in vitro fertilización

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Este es un método para la crioconservación de esperma de pez cebra que es una adaptación del método de Harvey (Harvey et al., 1982). Hemos introducido dos cambios en el protocolo original que tanto simplificar el procedimiento y la uniformidad de la muestra aumenta. En primer lugar, normalizar todos los volúmenes de los espermatozoides utilizando medios de congelación que no contiene el crioprotector. Espermatozoides en segundo lugar, se almacenan criopreservadas en crioviales en lugar de los tubos capilares. Las tasas de congelación y descongelación de espermatozoides (δ ° C / hora) son probablemente las dos variables más importantes para el control de este procedimiento. Por esta razón, no pueden sustituir los tubos diferentes a los especificados. Trabajando en equipos de 2, es posible congelar el esperma de 100 hombres por equipo en ~ 2 hrs. Espermatozoides criopreservados utilizando este protocolo tiene un promedio de 25% de la fertilidad (medida como el número de embriones viables generado en una fertilización in vitro, dividido por el número total de huevos fecundados) y esta fertilidad por ciento es estable durante muchos años.

Este es un protocolo de esperma de alto rendimiento para la criopreservación de pez cebra. Espermatozoides criopreservados utilizando este protocolo tiene un promedio de 25% de la fertilidad en la fertilización in vitro posterior y es estable durante muchos años.

Un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y In Vitro Fertilización

Este es un método para la criopreservación de esperma de pez cebra que constituye una adaptación del método de Harvey (Harvey et al., 1982). Hemos introducido dos cambios en...

Hola, soy Bruce Draper de la Universidad de California Davis, del departamento de Biología Molecular y Celular, y soy Cecilia Moans de la División de Ciencias Básicas del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson en Seattle. Hoy, Cecilia y yo vamos a demostrar el protocolo de criopreservación de esperma de pez cebra, que es una modificación del protocolo original de Brian Harvey. Les mostraremos que, trabajando en equipos de dos personas, es posible criopreservar esperma de 100 machos individuales en menos de dos horas.Aunque existe un amplio rango de fertilidad tras el descongelamiento, en promedio obtenemos una fertilidad del 25 %, y esto proviene de una biblioteca que ha sido criopreservada durante más de siete años. Así que comencemos. Antes de realizar este procedimiento, primero prepare las soluciones para congelación de espermatozoides.La solución de Ginsburg Fish ringer se prepara fresca cada tres días, y el medio de congelación se prepara fresco diariamente, con y sin metanol. La composición de estas soluciones puede encontrarse en la información suplementaria en línea que acompaña a este protocolo. Los materiales utilizados en este procedimiento pueden afectar la velocidad de congelación y descongelación, lo que a su vez puede afectar la fertilidad del esperma congelado.Por este motivo, también se proporciona una lista de materiales recomendados como información complementaria en línea. Es preferible congelar el esperma sobre hielo seco finamente triturado en lugar de usar pastillas de hielo seco. Una forma sencilla de triturar el hielo seco es envolverlo en una toalla y pulverizarlo con un martillo.Un método más eficiente consiste en utilizar un molino de hielo seco, como el modelo RE con garras, para congelar el esperma de pez cebra. Primero marque tubos capilares de 10 microlitros con un rotulador de laboratorio a la altura de 3,33 microlitros o aproximadamente 16,7 milímetros desde el fondo. Para anestesiar a los machos, coloque de dos a cuatro machos en un vaso de precipitados que contenga trica diluida y agua para peces. La receta se puede encontrar en el libro del pez cebra.Una vez anestesiado, levante el pez fuera del anestésico utilizando una cuchara de plástico y séquelo suavemente con una toalla de papel. Preste especial atención a secar el lado ventral. El agua activa los espermatozoides, por lo que es fundamental secar completamente alrededor del ika.Coloque el pez sobre el soporte de esponja con el lado ventral hacia arriba. Si la zona alrededor de las aletas pelvianas aún está húmeda, séquela suavemente con una toallita Kim. Coloque el tubo capilar marcado en un adaptador de pipeta de goma que se incluye con los tubos capilares.El adaptador es una manguera de goma que tiene una boquilla en un extremo y un porta capilares en el otro. Alternativamente, el tubo capilar puede conectarse a una jeringa Hamilton de 50 microlitros. Utilizando un trozo corto de tubo de tigón del diámetro adecuado, coloque el macho bajo el microscopio y exponga la abertura urogenital separando cuidadosamente las aletas pélvicas.Utilizando el extremo del tubo capilar, exprese el esperma acariciando suavemente los costados del pez con pinzas lisas o apretando suavemente los costados del pez con el dedo índice y el pulgar; recoja el esperma en un tubo capilar a medida que se expulsa, aplicando succión suave. Evite las heces que podrían expulsarse junto con el esperma. El volumen objetivo de esperma es de 3.3 microlitros.La cantidad mínima de espermatozoides aceptable varía según la calidad del esperma. Un buen esperma es blanco y opaco, mientras que el esperma deficiente tiene aspecto acuoso. En general, la cantidad mínima aceptable de espermatozoides es un microlitro de esperma de buena calidad o un tercio del objetivo, y dos microlitros de esperma deficiente o dos tercios del objetivo.Si el volumen de espermatozoides no alcanza el volumen objetivo de 3,3 microlitros, es necesario normalizar el volumen hasta la marca del rotulador utilizando medio de congelación sin metanol. Si el volumen de espermatozoides ya alcanza o supera la marca del rotulador en el tubo capilar, continúe con el siguiente paso. Ahora agregue el crioprotector al esperma.Absorber medio congelante con metanol hasta la marca naranja. El volumen total aproximado ahora es de 20 microlitros. Expulsar la mezcla de espermatozoides y crioprotector sobre un área limpia de un vidrio de reloj, mezclando suavemente mediante pipeteo ascendente y descendente aproximadamente cuatro veces y evitando introducir burbujas.Aliquotar el esperma en dos viales criogénicos pipeteando 10 microlitros de la solución crioprotectora de espermatozoides en el fondo de cada vial etiquetado. Tapar rápidamente los viales y colocar cada vial criogénico en un tubo Falcon separado de 15 mililitros. A temperatura ambiente, tapar los tubos Falcon e introducirlos en hielo seco finamente pulverizado.Los tubos deben insertarse lo suficientemente hondo como para que solo se vean las tapas, a fin de llevar un control de los tubos falcon. Numérelos y registre la hora a la que cada tubo se coloca en el hielo seco. Deje que el esperma se congele en el hielo seco durante 20 minutos.Después de congelar el esperma, transfiera los dos viales criogénicos a un frasco Dewar que contenga nitrógeno líquido para almacenamiento temporal. Coloque la caja congeladora en un baño de nitrógeno líquido para que las muestras no se calienten.Utilice pinzas met&aacute;licas largas para recuperar los viales del matraz y manip&uacute;lelos con guantes criog&eacute;nicos. Alternativamente, los viales criog&eacute;nicos pueden transferirse directamente del hielo seco al congelador. Si la caja del congelador se mantiene sumergida en nitr&oacute;geno l&iacute;quido dentro de un recipiente de poliestireno para almacenamiento a largo plazo, coloque los viales criog&eacute;nicos en un congelador criog&eacute;nico de nitr&oacute;geno l&iacute;quido.Para mantener la viabilidad de los espermatozoides, es fundamental que los viales se almacenen sumergidos en nitrógeno líquido; los viales almacenados en la fase de vapor pueden perder viabilidad con el tiempo. La rapidez también es fundamental para mantener la viabilidad espermática. El tiempo entre la adición del crioprotector y la colocación de los viales de espermatozoides en hielo seco no debe superar los 30 segundos. Fecundación in vitro.El uso de espermatozoides criopreservados funciona mejor con dos personas. Una persona exprime los óvulos de las hembras mientras la otra descongela el esperma. Ajuste un baño de agua a 33 grados Celsius.Retire un vial criogénico del congelador de nitrógeno líquido y transfiéralo a un recipiente D o matraz que contenga nitrógeno líquido hasta que esté listo para descongelarse. Exprese los huevos de hembras anestesiadas dentro de una placa de Petri plástica de 35 milímetros. Esto se describe en detalle en el protocolo de JoVE titulado Producción de pez cebra gino-genético mediante presión temprana, que proporciona una descripción detallada del pez cebra.En la fertilización in vitro, una buena postura contiene más de 150 huevos que son uniformes y de color amarillento. Cualquier residuo blanco indica degradación. Si es posible, intente obtener tres posturas de huevos y combínelas en un solo recipiente.Si no se obtienen tres buenos grupos en el transcurso de un minuto a partir del primer grupo, continúe con el siguiente paso. Mantenga el recipiente cubierto mientras se descongela el esperma. Mientras tanto, retire el vial del nitrógeno líquido y quite la tapa.Sumerja rápidamente el vial hasta la mitad en un baño de agua a 33 grados durante ocho a 10 segundos. Añada rápidamente 70 microlitros de solución salina tamponada de Hank a temperatura ambiente al vial y mezcle pipeteando arriba y abajo; inmediatamente añada la mezcla a los huevos en la placa de Petri y mezcle suavemente con la punta de la pipeta. Luego active inmediatamente los espermatozoides y los huevos añadiendo 750 microlitros de agua para peces, agite para mezclar e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente.Después de cinco minutos, llene el recipiente con peces, agua e incube a 28 grados Celsius. Después de dos a tres horas, cuente y transfiera los embriones viables a placas de 100 milímetros, con 50 embriones por placa. También cuente los huevos fertilizados para poder determinar la fertilidad de la muestra de esperma.La fertilidad del espermatozoide es la proporción entre embriones viables y el número total de óvulos utilizados para la fertilización in vitro. Los óvulos pueden clasificarse en cualquier momento entre dos y seis horas después de la fertilización in vitro. Cuando los óvulos infértiles se distinguen fácilmente de los embriones viables, los óvulos infértiles son claros y no divididos.Cuando se observa con iluminación transmitida en un microscopio estereoscópico, la fertilidad promedio del esperma criopreservado varía ampliamente. Sin embargo, debería ser posible obtener un promedio de fertilidad del 25 % que se mantenga estable durante varios años. Este gráfico muestra el porcentaje promedio de fertilidad del esperma congelado entre 2001 y 2003 y analizado tan recientemente como en 2008.Acabamos de demostrar un método de alto rendimiento para la criopreservación de esperma de pez cero. Al realizar este protocolo, es importante utilizar todo el equipo y utensilios plásticos recomendados, así como hielo seco triturado pulverizado en lugar de pellets de hielo seco. Es fundamental utilizar esperma y óvulos de muy alta calidad, y en el caso de los óvulos, al realizar la fertilización in vitro, tras activar el esperma, es importante utilizar el mayor número posible de óvulos para mejorar la cantidad de embriones fértiles obtenidos al final, lo que podría requerir tres o cuatro hembras, ¿verdad?Otro componente clave del protocolo es la velocidad. Nunca debería tomar más de aproximadamente un minuto pasar de extraer el esperma del macho a colocarlo en hielo seco. Bueno, creo que eso es todo.Buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El pez cebra es un poderoso sistema modelo para la biología del desarrollo y la investigación de enfermedades humanas debido a su similitud genética con los vertebrados superiores. Este protocolo describe una metodología para crear embriones haploides de pez cebra que se pueden utilizar para estrategias de detección directa para identificar mutaciones recesivas en genes esenciales para la embriogénesis temprana.

La producción de embriones de pez cebra mediante haploide<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilización

Este protocolo describe un método para aislar células individuales de embriones de pez cebra, enriquecer para obtener células de interés, capturar células de pez cebra en sistemas multiplex de células individuales basados en microfluidos y evaluar la expresión génica de células individuales.

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

Un protocolo modificado para la manipulación de ploidía utiliza un choque de calor para inducir una parada de un ciclo en la citocinesis en el embrión temprano. Este protocolo se demuestra en el pez cebra, pero puede ser aplicable a otras especies.

La manipulación de ploidía de embriones de pez cebra con el Heat Shock Treatment 2

El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Además, se evaluó la repetibilidad del método en cinco cepas diferentes de pez cebra.

Criopreservación de espermatogonios de pez cebra por todo los testículos aguja inmerso enfriamiento ultra rápido

Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

Pez cebra han utilizado recientemente como un sistema de modelo en vivo para el estudio de tiempo de replicación del ADN durante el desarrollo. Aquí está detallada de los protocolos para el uso de embriones de pez cebra para sincronización de replicación de perfil. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para el estudio de la sincronización de replicación en mutantes, tipos de células individuales, modelos de la enfermedad y otras especies.

Perfiles de sincronización de replicación de ADN utilizando el pez cebra como un sistema de modelo en Vivo

Este protocolo demuestra la inmunofluorescencia secuencial y la inmunohistoquímica en criosecciones de embriones de pez cebra en etapa temprana que permiten análisis precisos de la colocación en poblaciones celulares específicas.

Inmunofluorescencia secuencial e inmunohistoquímica en embriones de pez cebra crioseccionados

Aquí se presenta un protocolo para el análisis de hibridación de ARN in situ de montaje completo en ensayos de formación de peces cebra y tubos en células endoteliales derivadas de células madre inducidas por el paciente para estudiar el papel de la endoglina en la formación vascular.

Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

Aquí, presentamos un protocolo para la detección de proteínas mediadas por anticuerpos fluorescentes en preparaciones enteras de embriones y larvas de peces cebra.

Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

Este protocolo describe cómo obtener imágenes combinando hibridación in situ e inmunohistoquímica de secciones embrionarias de pez cebra. La hibridación in situ se realizó antes de la criosección, seguida de tinción de anticuerpos. Es útil detectar los patrones de expresión de dos genes en el pez cebra si hay escasez de anticuerpos.

In situ Hibridación combinada con inmunohistoquímica en embriones crioseccionados de pez cebra

Este protocolo describe un método de microscopía óptica de bajo costo para evaluar la morfología y función cardíaca en embriones de pez cebra, lo que permite una evaluación reproducible de la cardiotoxicidad del desarrollo sin la necesidad de sistemas de imágenes avanzados.

Imágenes cardíacas funcionales en embriones de pez cebra mediante microscopía estándar y análisis de video: aplicaciones en investigación ambiental y biomédica

Aprende un protocolo de crioconservación de esperma de alto rendimiento en Danio rerio para biología reproductiva. Este método permite almacenar muestras viables durante más de siete años con una fertilidad media del 25%.

Un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y In Vitro Fertilización

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