Un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y In Vitro Fertilización

Hola, soy Bruce Draper de la Universidad de California Davis, departamento de Biología Molecular y Celular, y soy Cecilia Moans de la División de Ciencias Básicas del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson en Seattle. Hoy, Cecilia y yo vamos a demostrar el protocolo de preservación del llanto del esperma del pez cebra, que es una modificación del protocolo original de Brian Harvey. Le mostraremos que, trabajando en equipos de dos, es posible criopreservar esperma de 100 hombres individuales en menos de dos horas.

Si bien existe una amplia gama de fertilidad al descongelar, en promedio, recibimos un 25% de fertilidad, y esto es de una biblioteca que ha sido criopreservada durante más de siete años. Así que comencemos. Antes de realizar este procedimiento, primero, prepare las soluciones de congelación de espermatozoides.

La solución de timbre de pescado de Ginsburg se hace fresca cada tres días, y el medio de congelación se hace fresco diariamente con y sin metanol. La composición de estas soluciones se puede encontrar en la información complementaria en línea que acompaña a este protocolo. Los materiales utilizados en este procedimiento pueden afectar la tasa de congelación y descongelación, lo que a su vez puede afectar la fertilidad del esperma congelado.

Por esta razón, también se proporciona una lista de materiales recomendados como información complementaria en línea. Es mejor congelar el esperma en hielo seco finamente picado en lugar de gránulos de hielo seco. Una forma sencilla de triturar hielo seco es envolverlo en una toalla y pulverizarlo con un martillo.

Un método más eficiente es usar un molinillo de hielo seco como garras y modelo RE dos para congelar el esperma de pez cebra. Primero marque 10 tubos capilares de microlitros con un bolígrafo de laboratorio a nivel de 3,33 microlitros o unos 16,7 milímetros desde el fondo para anestesiar a los machos, coloque de dos a cuatro machos en un vaso de precipitados que contenga trica diluida y agua de pescado. La receta se puede encontrar en el libro del pez cebra.

Una vez anestesiado, levante al pez del anestésico con una cuchara de plástico y séquelo suavemente con una toalla de papel. Presta especial atención al dibujo del lado ventral. El agua activa los espermatozoides, por lo que es fundamental secar completamente alrededor de la ika.

Coloque el pez en el soporte de la esponja con el lado ventral hacia arriba. Si la región alrededor de las aletas pélvicas aún está húmeda, séquela suavemente con una toallita Kim. Coloque el tubo capilar marcado en un adaptador de pipeta de boca de goma que se incluye con los tubos capilares.

El adaptador es una manguera de goma que tiene una boquilla en un extremo y un soporte capilar en el otro. Alternativamente, el tubo capilar se puede conectar a una jeringa Hamilton de 50 microlitros. Usando un trozo corto de tubo de tigón del diámetro apropiado, coloque al macho debajo del endoscopio y exponga la abertura urogenital separando cuidadosamente las aletas pélvicas.

Usando el extremo del tubo capilar, extraiga los espermatozoides acariciando suavemente los lados del pez con pinzas lisas o apretando suavemente los lados del pez con el dedo índice y el pulgar, recoja el esperma en un tubo capilar a medida que se expulsa mediante una succión suave. Evite las heces que puedan ser expulsadas con los espermatozoides. El volumen objetivo de espermatozoides es de 3,3 microlitros.

La cantidad mínima de espermatozoides aceptable varía en función de la calidad de los espermatozoides. Los espermatozoides buenos son blancos y opacos, mientras que los espermatozoides porosos parecen acuosos. En general, la cantidad mínima aceptable de espermatozoides es un microlitro de espermatozoides buenos o un tercio del objetivo, y dos microlitros de espermatozoides de poro o dos tercios del objetivo.

Si el volumen de espermatozoides no alcanza el volumen objetivo de 3,3 microlitros, entonces es necesario normalizar el volumen a la marca de la pluma utilizando medio de congelación sin metanol. Si el volumen de espermatozoides ya alcanza o supera la marca del bolígrafo en el tubo capilar, continúe con el siguiente paso. Ahora agregue el crioprotector a los espermatozoides.

Aspire el medio de congelación con metanol hasta la marca naranja. El volumen total aproximado es ahora de 20 microlitros. Expulse la mezcla de esperma y crioprotector en un área limpia de un vidrio de reloj, mezclado suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas cuatro veces y evite introducir burbujas.

Alícuota el esperma en dos viales criogénicos pipeteando 10 microlitros de la solución crioprotectora de esperma en el fondo de cada vial etiquetado. Moviéndose rápidamente, tape los viales y coloque cada vial criogénico en un tubo de halcón separado de 15 mililitros. A temperatura ambiente, tape los tubos de halcón e insértelos en hielo seco finamente pulverizado.

Los tubos deben insertarse lo suficientemente profundos para que solo se vean las tapas para realizar un seguimiento de los tubos del halcón. Numéralos y registra el tiempo que cada tubo entra en el hielo seco. Deje que el esperma se congele en el hielo seco durante 20 minutos.

Después de congelar el esperma, transfiera los dos viales criogénicos a un matraz que contenga nitrógeno líquido. Para almacenamiento temporal. Coloque la caja del congelador en un baño de nitrógeno líquido para que las muestras no se calienten.

Utilice pinzas metálicas largas para recuperar los viales del matraz y manipule con guantes criogénicos. Alternativamente, los viales criogénicos se pueden transferir directamente del hielo seco al congelador. Si la caja del congelador se mantiene sumergida en nitrógeno líquido en un recipiente de espuma de poliestireno para su almacenamiento a largo plazo, coloque los viales criogénicos en un congelador criogénico de nitrógeno líquido.

Para mantener la viabilidad de los espermatozoides, es crucial que los viales se almacenen sumergidos en nitrógeno líquido, los viales almacenados en la fase de vapor pueden perder viabilidad con el tiempo. La velocidad también es fundamental para mantener la viabilidad de los espermatozoides. El tiempo entre la adición del crioprotector y la colocación de los viales de esperma en hielo seco no debe ser superior a 30 segundos de fertilización in vitro.

El uso de esperma criopreservado funciona mejor con dos personas. Una persona exprime los óvulos de las hembras mientras que la otra persona descongela el esperma. Pon un baño de agua a 33 grados centígrados.

Retire un vial criogénico del congelador de nitrógeno líquido y transfiéralo a un matraz o matraz que contenga nitrógeno líquido hasta que esté listo para descongelar. Exprima los huevos de las hembras anestesiadas en una placa de Petri de plástico de 35 milímetros. Esto se describe en detalle en el protocolo de JoVE titulado Making Gyno Genetic desplegó el pez cebra por presión temprana, que proporciona una descripción detallada del pez cebra.

En la fecundación in vitro, una buena nidada contiene más de 150 huevos uniformes y amarillentos. Cualquier residuo blanco es indicativo de degradación. Si es posible, trate de obtener tres nidadas de huevos y combinarlos en un plato.

Si no se obtienen tres buenas embragues dentro de un minuto después del primer embrague, continúe con el siguiente paso. Mantenga el plato tapado mientras se descongelan los espermatozoides. Mientras tanto, retire el vial del nitrógeno líquido y retire la tapa.

Sumerja rápidamente el vial hasta la mitad en un baño de agua a 33 grados durante ocho a 10 segundos. Agregue rápidamente 70 microlitros de solución salina tamponada de Hank a temperatura ambiente al vial y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo, agregue inmediatamente a los huevos en la placa de Petri y mezcle suavemente con la punta de la pipeta. A continuación, active inmediatamente el esperma y los óvulos añadiendo 750 microlitros de remolino de agua de pescado para mezclar e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Después de cinco minutos, llene el plato con pescado, agua e incube a 28 grados centígrados. Después de dos o tres horas, cuente y transfiera los embriones viables a placas de 100 milímetros a 50 embriones por placa. Contar también con óvulos fecundados para poder determinar la fertilidad de la muestra de semen.

La fertilidad de los espermatozoides es la relación entre los embriones viables y el número total de óvulos que se utilizaron para la fertilización in vitro. Los óvulos se pueden clasificar en cualquier momento entre dos y seis horas después de la fertilización in vitro. Cuando los óvulos infértiles se distinguen fácilmente de los embriones viables, los óvulos infértiles son transparentes e indivisibles.

Cuando se observa con iluminación trans en un microscopio estereoscópico, la fertilidad promedio de los espermatozoides criopreservados varía ampliamente. Sin embargo, debería ser posible obtener un promedio de 25% de fertilidad que sea estable durante varios años. Este gráfico muestra el porcentaje promedio de fertilidad de los espermatozoides congelados entre 2001 y 2003 y se cree que en 2008.

Acabamos de demostrar un método de alto rendimiento para preservar el llanto sin esperma de pez. Al realizar este protocolo, es importante utilizar todo el desgaste y el equipo de plástico recomendados, así como utilizar hielo seco picado pulverizado en lugar de pellets de hielo seco. Es fundamental utilizar espermatozoides y óvulos de muy alta calidad, y en el caso de los óvulos al hacer la fertilización in vitro, al deshojar los espermatozoides, es importante utilizar el mayor número posible de óvulos para mejorar el número de embriones fértiles que se obtienen en el otro extremo, lo que podría llevar de tres a cuatro hembras. ¿Derecha?

Otro componente clave del protocolo es la velocidad. Nunca debería tomar más de un minuto pasar de extraer el esperma del macho a ponerlo en el hielo seco. Bueno, creo que eso es todo.

Buena suerte con tus experimentos.