Hacer pez cebra Gynogenetic diploides por presión inicial

Hola, soy Charlene Walker del laboratorio de Charles Kimmel en la Universidad de Oregón, Instituto de Neurociencia. Y yo soy Gregory Walsh. Trabajo en el laboratorio de Cecilia Moens en la División de Ciencias Básicas del Centro de Investigación Oncológica Fred Hutchinson.

Hoy les mostraremos un procedimiento para obtener peces cebra diploides mediante el método de presión temprana. Este método utiliza presión hidrostática para despolimerizar los microtúbulos en un huevo fertilizado con espermatozoides irradiados con UV. Realizado con la sincronización adecuada.

Esto evita la expulsión del segundo cuerpo polar, generando un embrión diplonte cuyos cromosomas homólogos son los dos productos de la meiosis uno. Esta técnica se desarrolló a principios de la década de 1970, cuando trabajaba en el laboratorio de George Reisinger en la Universidad de Oregón. En nuestro laboratorio, utilizamos este procedimiento en dos cribados genéticos de cuarta generación.

Los gametos de peces mutagénicos F1 pueden analizarse directamente para detectar mutaciones recesivas que causen fenotipos del desarrollo en descendientes homocigotos, gino, diploides genéticamente. Dado que los peces cebra presentan alta interferencia genética, también utilizamos este método para mapear mutaciones a cromosomas y para estimar la distancia a la que se encuentran dichas mutaciones respecto al centrómero. Comencemos: durante la tarde anterior al experimento, prepare el material para la recolección de esperma separando los machos y hembras que serán exprimidos; pueden usarse machos viejos ya que no aportarán material genético alguno.

Las hembras deben verse grandes y con el vientre grueso, mientras que los machos deben verse amarillos y ágiles. Mantenga los machos y las hembras durante la noche en tanques de contención separados, donde puedan accederse fácilmente por la mañana. Por la mañana del experimento, prepare la solución de Hank y agregue bicarbonato de sodio.

Lleve al laboratorio de peces en un cubo con hielo. La solución de Hank's trica un temporizador y tubos para la recolección de esperma. Finalmente, una vez en el laboratorio de peces, diluya la trica en agua para peces.

Esto se utilizará para anestesiar a los peces en el siguiente paso. Para comenzar la recolección de esperma, prepare un vial transparente con solución de Hank sobre hielo. La solución debe estar lo suficientemente fría y se necesitan aproximadamente 50 microlitros por macho a extraer; anestesie uno o dos machos a la vez.

Mediante inmersión y trica, pueden sacarse del anestésico con una cuchara de plástico. Enjuague los machos y el agua de los peces, y seque ligeramente sobre una toalla de papel. Esto es muy crítico porque el agua activa los espermatozoides.

Una vez secos, monte los peces en un soporte de espuma bajo un microscopio estereoscópico con iluminación episcópica y baja magnificación. Separe las aletas pélvicas con pinzas y coloque una microcapilar en la abertura de la cloaca para comenzar a recolectar el esperma. Presione suavemente pero firmemente los costados del pez con pinzas lisas de millado mientras el esperma lechoso sale del poro genital; recoja el esperma en la microcapilar mediante succión suave y extraiga el esperma de varios machos sobre hielo.

Solución salina fría de Hanks. El esperma de cinco a 10 machos es suficiente para fertilizar los huevos de 20 a 30 hembras. El esperma se mantiene frío. La solución de Hanks permitirá que el esperma siga fertilizando eficazmente los huevos durante varias horas.

Recolecte suficiente esperma para obtener una suspensión turbia para la inactivación por UV. Comience llenando la base de una placa de Petri de vidrio con hielo. Coloque un vidrio de reloj encima del hielo dentro de la placa.

A continuación, utilice la pipeta para transferir el esperma desde el tubo de ensayo hacia el vidrio de reloj. Asegúrese de recoger la mayor cantidad posible de esperma en la pipeta sin aspirar burbujas de aire. Es fundamental evitar la formación de burbujas en el esperma; expulse el esperma en una capa fina y uniforme sobre el vidrio de reloj y deseche la pipeta.

Después de que se haya transferido el esperma, coloque la placa de Petri en un cruzador UV. Encienda el cruzador y ajústelo para que entregue una energía de 900 JUULs. Después del reticulado, use una pipeta limpia para retirar el esperma del vidrio de reloj y transfiéralo a un tubo fendor marcado como esperma UV y colóquelo en hielo.

Para comenzar la recolección de huevos, primero anestesie dos hembras a la vez. En trica, es fundamental no mantener los peces en trica demasiado tiempo, ya que una anestesia prolongada puede matar a los peces. A continuación, enjuague los peces con agua para peces y séquelos ligeramente con una toalla de papel.

Esto es crítico porque el exceso de agua hinchará los huevos y evitará la fertilización. Coloque la hembra en una placa de Petri plástica de 35 milímetros con los dedos húmedos pero no mojados. Presione suavemente pero con firmeza sobre el vientre.

Si está lista para poner huevos, estos saldrán fácilmente; reúna los huevos con una espátula y devuelva a la hembra al agua. Los buenos huevos tienen un color amarillento y translúcido, mientras que los huevos que han permanecido demasiado tiempo dentro de la hembra son blancos y acuosos. Para asegurar la obtención de huevos de buena calidad, recójalos durante las primeras dos horas después de que se enciendan las luces en el acuario, y mantenga los huevos cubiertos para evitar que se sequen.

Después de recolectar los huevos, agregue de 30 a 50 microlitros de la suspensión de espermatozoides UV a los huevos y mezcle suavemente con la punta de una pipeta. Inmediatamente añada aproximadamente un mililitro de agua para peces e inicie el cronómetro. Los huevos que se dejen desarrollar a partir de este momento serán haploides.

Los siguientes pasos deben realizarse dentro de los 90 segundos posteriores a la fertilización. Inicie el cronómetro en el momento en que los huevos se activen mediante la adición de agua.

El momento exacto de la metafase de la meiosis uno depende de la temperatura. El momento de aplicar y retirar la presión está optimizado para 28,5 grados Celsius. Después de iniciar el temporizador, espere unos momentos, luego agregue más agua y mueva los huevos hacia el centro del recipiente.

Utilizando una pipeta de pasteur con el extremo cortado y pulido, transfiera los huevos fertilizados a los viales de presión si es necesario, agregue más agua para huevos al vial hasta que esté casi desbordándose, dejando una gota de agua en la curvatura del vial. A continuación, coloque una tapa de hule sobre la gota de agua y asegure la tapa de plástico sobre el hule.

Coloque los viales boca abajo en el cilindro de presión, añadiendo más agua de huevo. Para rellenar el cilindro, coloque la tapa firmemente. Una vez cerrado, coloque el cilindro en la prensa con el émbolo hacia arriba y aplique una presión de 8.000 libras por pulgada cuadrada.

Deje el cilindro en la prensa hasta seis minutos después del momento de la activación, durante un tiempo total de 4,5 minutos de presión. Seis minutos después de la activación, retire el cilindro de la prensa. Retire los viales del cilindro y séquelos cuidadosamente para evitar el enfriamiento de los embriones.

Reajuste el cilindro y vuélvalo a llenar con agua de huevo. Prepare los siguientes viales llenándolos parcialmente con agua de huevo según sea necesario. Repita estos pasos para todos los lotes de huevos.

El cilindro puede contener hasta dos viales a la vez, por lo que puede ser conveniente retrasar la fertilización de los huevos de uno a dos minutos para verificar si otras hembras ya presentes en la trica producen huevos. Esto ayudará a agilizar el proceso al tratar más lotes al mismo tiempo. Además, si se exprime a los peces mientras se utiliza la prensa, los huevos podrían quedar demasiado secos y no ser viables para cuando se pueda usar nuevamente la prensa. Veinticuatro horas después de la fertilización, un embrión haploide de pez cebra tendrá un cuerpo corto y robusto, una cola corta y un cerebro menos definido.

Sin embargo, todos tendrán las mismas partes del cuerpo, como somitas, cordón neural, ojos y oídos. Como diploides, haploides y diploides, todos exhiben movimientos de flexión sin inhibición alrededor de las 24 horas posteriores a la fecundación. Los hermanos diploides EP tienen colas largas, cerebros bien formados y deberían tener una viabilidad de aproximadamente entre el 60 y el 70 %.

Estos se parecen mucho a los controles desplegados no tratados. Por lo general, un lote de embriones haplo presentará una mezcla de embriones con buen aspecto, embriones muertos y todo tipo de estados intermedios. La proporción entre embriones con buen aspecto y embriones defectuosos refleja los genes perjudiciales presentes en el genoma femenino.

Las mutaciones son relativamente fáciles de identificar incluso con este fondo, porque habrá varios individuos, hasta un 50 %, con el mismo fenotipo característico. Es importante asegurarse de que los embriones producidos mediante este método sean verdaderos tic OIDs, ya que los controles generan una postura de huevos normales desarrollados apartando algo del esperma sin inactivación por UV, y una postura de embriones haploides apartando una postura de huevos fertilizados con esperma UV sin someterlos al procedimiento EP; los haploides no son viables después de dos o tres días. Los embriones EP desarrollados deben parecerse a diploides normales.

Aunque pueden aparecer algunos monstruos EP irregulares, las posturas de diplodes EP deberían ser en gran parte viables, alrededor del 70 al 90%. La presencia de haploides en la postura obtenida mediante EP sugiere un fallo en el proceso de EP, por ejemplo, que la prensa no haya mantenido la presión. La presencia de diplodes en la postura de haploides sugiere una inactivación incompleta del espermatozoide, por ejemplo, un fallo en el agente reticulante.

Acabamos de mostrarle lo fácil que es realizar la fertilización in vitro con pez cebra y cómo obtener embriones diploides de pez cebra derivados genéticamente por partenogénesis al inhibir la segunda división meiótica. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que el momento de la presión temprana es preciso y que la prensa mantiene una presión constante de 8.000 libras por pulgada cuadrada durante todo el tratamiento. Asegúrese de tener su prensa calibrada.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte en sus experimentos.