Visualizar el corazón latiendo en Drosophila

Aquí se presentarán dos técnicas para la visualización de un corazón latiendo en Drosophila para la disección del corazón adulto. En primer lugar, se extrae la cabeza y el tórax mediante un solo corte a lo largo de la línea indicada. A continuación, se extirpan los genitales y se abre la cavidad corporal abdominal con pinzas en el intestino y, en el caso de una mosca hembra, se extirpan los ovarios.

El cuerpo de grasa abdominal en los segmentos abdominales tres y cuatro se succiona cuidadosamente para exponer el corazón adulto para la inmovilización del corazón larval. Una sola larva colocada en una solución tampón se fija aplicando primero pegamento acral histo alrededor de la región de la cabeza de la larva. Las larvas se estiran suavemente y se aplica más pegamento en el extremo posterior y luego en los flancos de la pared del cuerpo de la larva.

Hola, soy GI Fler. Hola, soy Karen er. Ambos somos miembros del programa de Desarrollo y Envejecimiento del Instituto Burnham de Investigación Médica.

Hoy te mostraremos los procedimientos que hemos desarrollado para visualizar el corazón palpitante de Laval y drosófila adulta. Utilizamos estas dos preparaciones como una forma de visualizar, examinar y cuantificar los parámetros de los latidos del corazón en la mosca de la fruta. Drosophila. Antes de comenzar, primero preparamos una solución de hemolinfa artificial.

Esta solución contiene entrada de sacarosa, helo, que debe agregarse a la hemolinfa artificial a partir de soluciones madre refrigeradas justo antes de su uso. Para evitar la contaminación bacteriana, lleve la hemolinfa artificial a temperatura ambiente y oxigene la solución burbujeando con aire durante al menos 15 minutos. A continuación, extraiga varios capilares finos con un extractor de pipeta estándar, que será necesario para la eliminación de los cuerpos de grasa de la mosca.

Una vez que todo se ha preparado, las moscas adultas deben ser anestesiadas. Esto se puede hacer usando una breve exposición a la siesta de mosca de dos a cinco minutos, pero tenga cuidado de no dejar a las moscas en la siesta más de cinco minutos. La exposición a corto plazo al frío también se puede utilizar para anestesiar moscas, pero no se recomienda el dióxido de carbono, ya que tiene efectos más duraderos sobre la frecuencia cardíaca y la hospitalidad.

A continuación, las moscas anestesiadas se colocan con el lado dorsal hacia abajo en una placa de Petri recubierta con una fina capa de vaselina. La cutícula hidrofóbica de las alas y el cuerpo debe adherirse de forma reversible a la gelatina, pero la mosca se puede reposicionar si es necesario. Se realiza un corte inicial con un par de tijeras de resorte curvas.

Esto se hace colocando las hojas de tijera debajo de las patas de la mosca y en ángulo hacia la superficie dorsal cerca del cuello. La cabeza, el cordón nervioso ventral y las patas se retiran con un solo corte una vez cortados. A continuación, la preparación se sumerge en la solución de hemolinfa artificial oxigenada con unas tijeras de resorte.

La punta posterior del abdomen, que está compuesta por los segmentos abdominales siete y ocho, se extirpa con un solo corte. Esto proporciona acceso para hacer cortes laterales a lo largo de ambos bordes del abdomen y sirve para cortar la conexión entre el intestino posterior y la cutícula abdominal. Inserta las hojas de las tijeras en la pequeña abertura en la punta del abdomen y corta la cutícula lateralmente.

Esto libera un borde de la cutícula ventral. Agarre el colgajo con pinzas y haga una incisión similar a lo largo del borde lateral opuesto del abdomen. Ahora se puede quitar el colgajo liberado de la cutícula abdominal ventral.

Por lo general, el intestino y otros órganos abdominales se pueden extirpar como una sola masa con pinzas de joyero y tirones suaves. La extirpación de los órganos internos revela el tubo cardíaco latente, que todavía está unido a la cutícula dorsal por pequeños músculos aéreos y está rodeado de cuerpos grasos. Los capilares extraídos se insertan en un tubo de plástico de 16 pulgadas conectado a una fuente de vacío.

La fuerza de succión es proporcional al diámetro de la punta, por lo que las pipetas con puntas de más de 40 micras de diámetro no deben usarse una vez configuradas. Este sistema de succión se utiliza para succionar el exceso de grasa alrededor del tubo cardíaco. También se puede utilizar para eliminar las burbujas de aire que se acumulan alrededor de la cutícula y cualquier residuo.

Se debe tener mucho cuidado para evitar tocar el corazón mismo, y debido a que la porción posterior del corazón es muy frágil, esa región debe evitarse junta. El tubo cardíaco de Drosophila adulta ahora está expuesto y debe latir si es necesario. La cutícula y el corazón adherido se pueden reposicionar levantando suavemente la cutícula de la vaselina y volviéndola a apisonar con cuidado.

Evitar cualquier contacto con el tejido cardíaco. En este punto, la solución que baña la preparación debe reemplazarse con hemolinfa artificial fresca. Esta preparación debe dejarse equilibrar durante 20 a 30 minutos con oxigenación antes de cualquier manipulación.

Si la preparación se va a mantener durante más de 60 minutos, debe reperfundirse con hemolinfa artificial fresca. Esta preparación ya está lista para ser utilizada para el registro óptico y también se puede utilizar para el registro electrofisiológico o para manipulaciones histológicas. Se requiere una técnica diferente para visualizar el corazón latiendo intra larvas.

Primero, prepare las hojas de cubierta el día antes del procedimiento. Esto se hace mediante el uso de un palillo de dientes para transferir alrededor de 50 a 70 microlitros de solución de Sard a un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros. Deje que la protección syl se endurezca a 65 grados centígrados durante la noche.

A continuación, haga que el tampón Brody y Bates una vez preparado, las alícuotas se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados y descongelar cuando sea necesario. Por último, prepare las herramientas necesarias para aplicar el pegamento acral histo. Primero, tire de varios capilares finos.

A continuación, conecte una punta de pipeta de 1,5 mililitros con un pequeño tubo de plástico de aproximadamente 32 pulgadas de diámetro. Al insertar el extremo más pequeño en el tubo, inserte un capilar con su amplia abertura hacia el otro extremo. Una vez configurado, cargue el capilar con pegamento histo sumergiendo el capilar en una gota de pegamento y succionándolo suavemente en la punta de plástico.

Al trabajar con el pegamento, se debe tener a mano un segundo capilar de vidrio para eliminar el exceso de pegamento de la punta del capilar de pegamento. El pegamento es líquido hasta que entra en contacto con solución salina tamponada, donde se endurecerá en un par de segundos. Sin embargo, por lo general permanece plástico el tiempo suficiente para ser retirado de la punta capilar del pegamento o mientras se aplica a la muestra.

Ahora, para comenzar la inmovilización de las larvas, coloque una gota de pegamento histo acral cerca de cada esquina del protector de silo. Los cubreobjetos agregan 50 microlitros de tampón B y B a las gotas de pegamento, que se endurecerán instantáneamente y llenarán el espacio entre los puntos pegados con b y b. El pegamento mantendrá el tampón en el portaobjetos.

Tome una larva L tres errantes y colóquela sobre un trozo de papel de seda húmedo sobre hielo durante dos minutos. Esto ralentizará su movimiento. A continuación, transfiera las larvas al tampón y oriéntelo con el lado dorsal hacia arriba.

Este es el lado de las larvas que carece de los cinturones idénticos. Aplique rápidamente un poco de pegamento entre la región de la cabeza y el protector del umbral. El pegamento se endurecerá muy rápidamente y evitará que la cabeza de las larvas se mueva.

Con pinzas, agarre con cuidado al animal por los destellos posteriores y estírelo suavemente. Fije las larvas en esta posición aplicando el pegamento a lo largo de ambos lados de las larvas en la mitad posterior. Para reducir el movimiento adicional de la cutícula por los músculos de la pared del cuerpo, agregue más pegamento a los flancos del animal.

La larva ahora está fija en esta posición. El cubreobjetos se puede colocar en una pequeña placa de Petri llena de hemolinfa artificial o PBS, los latidos del corazón ahora se pueden registrar sin interferencia de los movimientos de la pared del cuerpo. El corazón semiintacto de Drosophila adulta latirá rítmicamente durante horas después de la disección cuando se mantiene en hemolinfa artificial oxigenada fresca.

Un ejemplo representativo se muestra aquí y en la película suplementaria uno corazones de tercero en larvas estrella que se muestran aquí, y las moscas jóvenes de una a tres semanas después de elo generalmente exhiben un latido cardíaco regular a tasas entre uno y tres hercios, las moscas mayores de tres semanas generalmente son más arrítmicas. Sin embargo, estos corazones todavía son capaces de latir espontáneamente durante horas en corazones de hemolinfa artificiales oxigenados y las moscas adultas que se dañan como resultado del procedimiento de disección suelen mostrar regiones localizadas de constricción extrema que no pueden relajarse y, a menudo, son incontrolables. Las frecuencias cardíacas más lentas que un hercio rara vez se observan en moscas menores de tres semanas de edad.

En consecuencia, tales preparaciones se consideran dañadas y se descartan. Acabamos de demostrar cómo preparar corazones de moscas de la fruta adultos y nivelados para la obtención de imágenes ópticas. Recuerde, al hacer la preparación semi intacta nunca toque el corazón en sí.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.