Name: Visualizar el corazón latiendo en Drosophila /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-28T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprende técnicas de visualización del corazón latiendo en Drosophila para estudiar fisiología cardíaca en etapas larvarias y adultas. Estos métodos permiten analizar parámetros del latido en este organismo modelo.

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KO con el apoyo de una beca de la Asociación Americana del Corazón.

Antes de empezar Corazones adultos <ol><li> Recién preparar hemolinfa artificial (IA) solución que contiene 108 mm de Na +, 5 mM K +, 2 mM Ca 2 +, 8 mm de MgCl2, 1 mM NaH 2 PO 4, 4 mm de NaHCO3, sacarosa 10 mM, trehalosa 5 mM, HEPES 5 mM (pH 7.1, todos los reactivos de Sigma Chemicals). La sacarosa y la trehalosa, debe añadirse a la AH de las soluciones madre refrigerados antes de su uso con el fin de prevenir la contaminación bacteriana. </li><li> Traiga AH a temperatura ambiente y oxigenar la solución por vía aérea-burbujas durante al menos 15 min. </li><li> Tire de varios capilares finos (por ejemplo, capilares de vidrio, 100 ul, VWR) necesarios para la eliminación de grasa. </li></ol> Corazones larvas <ol><li> Sylgard recubierto cubreobjetos: con un palillo de dientes, la transferencia de unos 50-70μl de solución Sylgard en un cubreobjetos 22x22mm. Deje que el endurecimiento Sylgard a 65 ° C durante la noche. </li><li> Preparar el Broadie y tampón de Bate (135 NaCl, KCl 5 mM, 4 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, TES 5mM, sacarosa 36 mm;. PH 7,15 Ver Broadie y Bate, 1993). </li><li> Prepare las herramientas necesarias para aplicar el pegamento histoacryl. En primer lugar, tirar de varios capilares finos (por ejemplo, la Ciencia Productos GB100T8P). Conecte una punta de la pipeta 1,5 ml con un tubo de plástico delgado (Tygon, 1 / 32 &quot;) mediante la inserción de la pequeña en el tubo. Insertar un tubo capilar con su amplia apertura hacia el otro extremo. De carga del capilar con pegamento Histoacryl por inmersión de la capilaridad en una gota de pegamento y una succión suave en la punta de plástico. Cuando se trabaja con el pegamento que uno debe tener un vaso capilar segunda mano para quitar exceso de pegamento en la punta de la cola capilar. La cola es un líquido hasta que se entra en contacto con solución salina amortiguada donde se endurecerá en un par de segundos. Sin embargo, por lo general sigue siendo de plástico el tiempo suficiente para ser removido de la punta de la cola capilar o si bien se aplica a la muestra. </li></ol> Semi-intacta Drosophila corazón de la mosca adulta <ol><li> Las moscas adultas de Drosophila se anestesian con siesta Fly (Carolina Biological Supply Co.) por 2-5 minutos. Se debe tener cuidado de no dejar que las moscas de la siesta para volar largas exposiciones. La exposición a corto plazo al frío también puede ser utilizado para anestesiar a las moscas de CO 2, pero no es recomendable ya que tiene más efectos duraderos sobre la frecuencia cardiaca y rítmica. </li><li> Moscas anestesiadas se colocan, cara dorsal hacia abajo, en una placa de Petri revestida con una capa fina de vaselina. La cutícula hidrófoba en las alas y el cuerpo de forma reversible &quot;pegarse&quot; a la gelatina, pero la marcha se puede colocar si es necesario. Esto es especialmente importante durante las manipulaciones posteriores. </li><li> Una reducción inicial se realiza mediante un par de tijeras curvas de primavera (Roboz # 5611). Las cuchillas de tijera se colocan debajo de las piernas en ángulo hacia abajo y hacia la superficie dorsal del tórax cerca del cuello. La cabeza, el cordón nervioso ventral, las piernas se retiran con un solo corte. La preparación se sumerge en un hemolinfa oxigenada, artificial (IA) solución. </li><li> Con la tijera de primavera el extremo posterior del abdomen (compuesto de segmentos abdominales 7 y 8) se elimina con un solo corte. Esto proporciona un acceso lateral para realizar cortes a lo largo de ambos bordes del abdomen y sirve para cortar la conexión entre el intestino posterior y la cutícula abdominal. El colgajo libre de la cutícula ventral de abdomen, luego se retira. </li><li> En los pasos 3 y 4 de las conexiones anteriores y posteriores de la tripa se cortan para los órganos abdominales se encuentran ahora en su lugar gracias tracheols. El intestino y otros órganos abdominales se pueden quitar generalmente como una masa única con las pinzas de joyería (Roboz, # 55) y suave tirón. La eliminación de los órganos internos revela el tubo de corazón que late todavía en la cutícula dorsal rodeada de cuerpos grasos. </li><li> Los cuerpos de grasa son muy opaco en el microscopio de luz en consecuencia a menudo es necesario para eliminar parte de esta grasa con el fin de ver el tubo de corazón claramente. Esto se logra mediante una técnica de liposucción utilizando capilares de vidrio finamente elaborado. Los capilares se hacen usando una pipeta estándar extractor (Por ejemplo, Sutter P-97 con una pipeta asistente de cámara) y se inserta en un tubo de plástico (Tygon, 1 / 16 &quot;) conectado a una fuente de vacío. Este sistema se utiliza para succionar el exceso de grasa alrededor del tubo cardíaco. Fuerza de succión es proporcional al diámetro de la punta para pipetas con puntas superiores a 40 micras de diámetro, no debe ser utilizado. El cuidado extremo se debe tomar para evitar el contacto con el propio corazón y por la parte posterior del corazón es muy frágil que la región debe evitarse por completo. </li><li> El adulto tubo de Drosophila corazón quedará al descubierto y deben ser golpes. Si es necesario el corazón cutícula y adjunto se puede colocar con cuidado, levantando la cutícula de la vaselina y cuidadosamente apisonado de vuelta, de nuevo evitando cualquier contacto con el tejido del corazón. En tsu punto de vista la solución del baño de la preparación debe ser reemplazado por AHL fresco. Esta preparación se debe permitir que se equilibre durante 20-30 minutos con la oxigenación antes de cualquier manipulación. Si la preparación se ha de mantener durante más de 60 minutos que deben ser preservados con AHL fresco. </li></ol> Inmovilización de las larvas de Drosophila para la grabación óptica <ol><li> Coloque una gota de pegamento Histoacryl cerca de cada esquina del cubreobjetos Sylgard. Añadir 50μl de tampón B &amp; B a las gotas de pegamento que se endurece al instante. Llenar el espacio entre los puntos de pegado con B &amp; B - el pegamento se mantenga la memoria intermedia en la diapositiva. </li><li> Tome un vagabundo larva L3 y colocarlo en un pañuelo de papel mojado en hielo durante 2 min. Esto retrasará su movimiento. A continuación, traslado a la larva en el búfer y orientarlo con el dorso hacia arriba (este es el lado de la larva que carece de los cinturones de dentículo). Aplicar rápidamente un poco de pegamento entre la región de la cabeza y el Sylgard. El pegamento se endurece muy rápidamente y evitar que la cabeza de la larva que se mueva. </li><li> El uso de pinzas con cuidado agarra al animal por los espiráculos posteriores y suavemente estirar. Fijar la larva en esta posición mediante la aplicación de la cola a ambos lados de la larva en la mitad posterior. Para reducir aún más el movimiento de la cutícula de los músculos de la pared del cuerpo, agregue más pegamento en los flancos del animal. La larva se ha fijado ahora en esta posición. El cubreobjetos se puede colocar en una pequeña placa de Petri llena de AHL o PBS. Latidos del corazón ahora se puede grabar sin la interferencia de los movimientos de la pared del cuerpo. </li></ol> Los resultados representativos: El semi-intacta corazón adulto de Drosophila se latir rítmicamente durante horas después de la disección cuando se mantiene en el AH fresca y oxigenada (ver datos suplementarios, Ocorr, et al., 2007). Un ejemplo representativo se muestra en la película 1. Corazones desde el 3 de instar de la larva y las moscas jóvenes (1 - 3 semanas después de la eclosión) generalmente presentan un ritmo regular del corazón a un ritmo de entre 1 - 3 Hz. Las moscas más de tres semanas por lo general son más arrítmico, sin embargo, estos corazones son todavía capaces de vencer de forma espontánea durante horas en AHL oxigenada. Corazones en moscas adultas que se encuentren dañados como consecuencia del procedimiento de disección suelen mostrar regiones localizadas de la constricción extrema que no pueden relajarse. Las tasas de latidos del corazón más lento que 1 Hz se observan rara vez en las moscas de menores de 3 semanas de edad y, en consecuencia de estas preparaciones se consideran dañados y se descartan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1425/MOVIE1.avi">Haga clic aquí para descargar la película 1.</a> - A una semana de vida volar tipo salvaje adulto (cepa de laboratorio w 1118) que muestra el tubo expuesto corazón abdominal (anterior a la izquierda). Tenga en cuenta las contracciones regulares y rítmicos. Zonas opacas en la esquina superior derecha están los restantes órganos de la grasa abdominal, células redondas a cada lado del corazón son las células del pericardio.

<ol><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 13, 144-166 (1993).</li>
</ol>

El modelo de Drosophila ha demostrado ser una potente herramienta genética que se ha utilizado para tratar una variedad de problemas científicos que van desde el desarrollo embrionario para el aprendizaje y la memoria. Recientemente, este organismo modelo versátil se ha utilizado para investigar la genética de la función cardíaca en la marcha. Un número de intentos de cuantificar la fisiología del corazón en adultos de Drosophila se han basado en observaciones realizadas en las moscas intacta a través de la cutícula abd...

<table><tbody><tr><td>Tijeras de disección microquirúrgicas de resorte (curvas)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5611</td><td>Adecuadas para cortes gruesos (Paso 3)</td></tr><tr><td>Tijeras de disección microquirúrgicas de resorte (rectas)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont n.º 55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont n.º 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio, 100 µl</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio, finos</td><td>Science Products</td><td>GB100T8P</td><td></td></tr><tr><td>Traccionador de pipetas</td><td>Sutter Equipment</td><td>P-97</td><td>Funcionan tanto los traccionadores horizontales como verticales</td></tr><tr><td>Tubo de plástico</td><td>Tygon</td><td>1/16&amp;#8221; de diámetro interno</td><td>para capilares de 100&amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>Tubo de plástico</td><td>Tygon</td><td>1/32&amp;#8221; de diámetro interno</td><td>para capilares pequeños</td></tr><tr><td>Adhesivo tisular Histoacryl&amp;#174;</td><td>B. Braun Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizar el corazón latiendo en drosophila</em

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

La<em&gt; Drosophila</emCorazón&gt; ha surgido recientemente como un buen modelo de sistema para el examen de los mecanismos genéticos, celulares y moleculares que subyacen a la función en el corazón de miogénica. Un paso clave en el examen de la función del corazón en la mosca es encontrar una manera de acceder al corazón de una manera que preserva su función miogénica al tiempo que permite el órgano corazón que late a ser observados y registrados. Dos métodos diferentes para observar y registrar los latidos del corazón, tanto en larva y adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; A continuación se describen. Nuestros semi-intacta la preparación con las moscas adultas permite una visualización clara del corazón abdominal sin la interferencia de la cutícula pigmentada y que cubre los cuerpos grasos. Para grabar el corazón late larval es necesario inmovilizar a la larva, lo que minimiza los movimientos del cuerpo lo que reduce los movimientos de la pared del corazón que no están asociadas con las contracciones del miocardio. Nuestras metodologías de producción de un adulto estable y preparaciones de larvas del corazón que puede vencer a la hora a un ritmo de 3.1 Hz.

Técnica necesaria para la visualización de los latidos del corazón en adultos y larvas<em&gt; Drosophila</em&gt; Se presentan. Cada etapa de la vida requiere de una metodología diferente.

Visualizar el corazón latiendo en Drosophila</em

El corazón de Drosophila ha surgido recientemente como un buen sistema modelo para examinar los mecanismos genéticos, celulares y moleculares que subyacen a la función en...

Se presentarán aquí dos técnicas para la visualización de un corazón latiendo en Drosophila para la disección del corazón adulto. Primero, se eliminan la cabeza y el tórax mediante un único corte a lo largo de la línea indicada. A continuación, se extraen las gónadas y se abre la cavidad corporal abdominal usando pinzas; se retira el intestino, y en el caso de una mosca hembra, también se eliminan los ovarios.Se aspira cuidadosamente el cuerpo graso abdominal en los segmentos abdominales tres y cuatro para exponer el corazón adulto y así inmovilizar el corazón larvario. Se fija una larva individual colocada en solución tampón aplicando primero cola de histiacrilato alrededor de la región cefálica de la larva. Luego, se estira suavemente la larva y se aplica más cola en el extremo posterior y a continuación en los flancos de la pared corporal larvaria.Hola, soy GI Fler. Hola, soy Karen er. Ambos somos miembros del programa de Desarrollo y Envejecimiento en el Instituto Burnham para la Investigación Médica.Hoy les mostraremos los procedimientos que hemos desarrollado para visualizar el corazón latiendo de Drosophila en etapa larval y adulta. Utilizamos ambas preparaciones como una forma de visualizar, examinar y cuantificar los parámetros del latido cardíaco en la mosca de la fruta, Drosophila. Antes de comenzar, preparamos primero una solución artificial de hemolinfa.Esta solución contiene la entrada de sacarosa, helo, que debe agregarse a la hemolinfa artificial a partir de soluciones stock refrigeradas justo antes de su uso. Para prevenir la contaminación bacteriana, lleve la hemolinfa artificial a temperatura ambiente y oxide la solución mediante burbujeo de aire durante al menos 15 minutos. A continuación, prepare varios capilares finos utilizando un tirador estándar de pipetas, que serán necesarios para la eliminación de los cuerpos grasos en la mosca.Una vez que todo ha sido preparado, las moscas adultas deben anestesiarse. Esto puede hacerse mediante una exposición breve a fly nap durante dos a cinco minutos, pero tenga cuidado de no dejar las moscas en el fly nap más de cinco minutos. También puede utilizarse una exposición a corto plazo al frío para anestesiar a las moscas, pero no se recomienda el dióxido de carbono, ya que tiene efectos más prolongados sobre la frecuencia cardíaca y la ity.A continuación, las moscas anestesiadas se colocan con el lado dorsal hacia abajo en una placa de Petri recubierta con una capa delgada de vaselina. La cutícula hidrofóbica de las alas y del cuerpo debe adherirse reversiblemente a la vaselina, aunque la mosca puede reposicionarse si es necesario. Se realiza un corte inicial utilizando un par de tijeras curvas de resorte.Esto se realiza colocando las hojas de la tijera bajo las patas de la mosca y con un ángulo hacia abajo, en dirección de la superficie dorsal cerca del cuello. El cordón nervioso ventral del cerebro y las patas se eliminan con un solo corte. A continuación, la preparación se sumerge en la solución artificial de hemo-linfática oxigenada utilizando tijeras de precisión.Se elimina el extremo posterior del abdomen, que consta de los segmentos abdominales siete y ocho, con un único corte. Esto permite el acceso para realizar cortes laterales a lo largo de ambos bordes del abdomen y sirve para seccionar la conexión entre el intestino posterior y la cutícula abdominal. Introduzca las hojas de las tijeras en la pequeña abertura del extremo del abdomen y corte la cutícula lateralmente.Esto libera un borde del cutículo ventral. Sostenga la solapa con pinzas y realice un corte similar a lo largo del borde lateral opuesto del abdomen. Ahora se puede retirar la solapa suelta del cutículo abdominal ventral.Los intestinos y otros órganos abdominales generalmente pueden extraerse como una sola masa utilizando fórceps de joyero y tracciones suaves. La eliminación de los órganos internos revela el tubo cardíaco latiente, que aún está unido a la cutícula dorsal por pequeños músculos arteriales y está rodeado por cuerpos grasos. Los capilares extraídos se insertan en un tubo de plástico de una dieciseisava de pulgada de diámetro conectado a una fuente de vacío.La fuerza de succión es proporcional al diámetro de la punta, por lo que no se deben usar pipetas con puntas mayores de 40 micrones de diámetro una vez configuradas. Este sistema de succión se utiliza para aspirar el exceso de grasa alrededor del tubo cardíaco. También puede emplearse para eliminar las burbujas de aire que se acumulan alrededor de la cutícula y cualquier detrito.Debe tenerse extrema precaución para evitar tocar el corazón mismo, y dado que la porción posterior del corazón es muy frágil, también debe evitarse esa región. Ahora está expuesto el tubo cardíaco del drosófila adulto y, si es necesario, debería estar latiendo. La cutícula y el corazón adherido pueden reposicionarse levantando suavemente la cutícula del gel de petróleo y presionándola cuidadosamente de nuevo hacia abajo.Evitando cualquier contacto con el tejido cardíaco. En este momento, la solución que baña la preparación debe reemplazarse por hemolinfa artificial fresca. Se debe permitir que esta preparación se equilibre durante 20 a 30 minutos con oxigenación previa a cualquier manipulación.Si la preparación debe mantenerse por más de 60 minutos, debe reperfundirse con hemolinfa artificial fresca. Esta preparación ya está lista para ser utilizada en grabaciones ópticas y también puede usarse para grabaciones electrofisiológicas o para manipulaciones histológicas. Se requiere una técnica diferente para visualizar el corazón latiendo en larvas intra.Primero, prepare las laminillas el día anterior al procedimiento. Para ello, use un palillo para transferir aproximadamente de 50 a 70 microlitros de solución Sard sobre una laminilla de 22 por 22 milímetros. Deje que el syl guard endurezca a 65 grados celsius durante la noche.A continuación, prepare el tampón de Brody y Bates; una vez preparado, las alícuotas pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius y descongelarse cuando sean necesarias. Por último, prepare las herramientas necesarias para aplicar el pegamento histo acral. En primer lugar, estire varios capilares finos.A continuación, conecte una punta de pipeta de 1,5 mililitros con un pequeño tubo de plástico de aproximadamente un treintaidosavo de pulgada de diámetro. Insertando el extremo más pequeño en el tubo, coloque un capilar con su abertura ancha en el otro extremo. Una vez configurado, cargue el capilar con pegamento histológico sumergiendo el capilar en una gota de pegamento y aplicando succión suave a través de la punta de plástico.Al trabajar con el adhesivo, se debe tener un segundo capilar de vidrio a mano para eliminar el exceso de adhesivo de la punta del capilar de adhesivo. El adhesivo está líquido hasta que entra en contacto con solución salina tamponada, donde se endurecerá en cuestión de segundos. Sin embargo, generalmente permanece plástico el tiempo suficiente para poder retirarlo de la punta del capilar de adhesivo o durante su aplicación sobre la muestra.Ahora, para comenzar la inmovilización de las larvas, coloque una gota de pegamento histo acral cerca de cada esquina del syl guard. Añada 50 microlitros de tampón B y B a las gotas de pegamento, que se endurecerán instantáneamente; rellene el espacio entre los puntos pegados con B y B. El pegamento mantendrá el tampón sobre el portaobjetos.Tome tres larvas en estado de dispersión L y colóquelas sobre un trozo de papel de filtro húmedo sobre hielo durante dos minutos. Esto ralentizará su movimiento. A continuación, transfiera las larvas al tampón y oriente la larva con la cara dorsal hacia arriba.Este es el lado de las larvas que carece de los cinturones idénticos. Aplique rápidamente un poco de pegamento entre la región cefálica y el guardacantos. El pegamento se endurecerá muy rápidamente y evitará que la cabeza de las larvas se mueva.Con pinzas, tome cuidadosamente al animal por las espinas posteriores y estírelo suavemente. Fije las larvas en esta posición aplicando pegamento a lo largo de ambos lados de las larvas en la mitad posterior. Para reducir el movimiento adicional del cutículo por los músculos de la pared corporal, agregue más pegamento a los flancos del animal.La larva ya está fija en esta posición. La laminilla puede colocarse en una pequeña placa de Petri llena de hemolinfa artificial o PBS y ahora pueden registrarse los latidos cardíacos sin interferencias de los movimientos de la pared corporal. El corazón de Drosophila semientero latirá rítmicamente durante horas tras la disección, siempre que se mantenga en hemolinfa artificial oxigenada fresca.Un ejemplo representativo se muestra aquí y en la película suplementaria uno; corazones de larvas de tercer estadio en estrella, mostrados aquí, y moscas jóvenes, de una a tres semanas posteriores a la eclosión, generalmente exhiben un latido cardíaco regular a tasas entre uno y tres hercios. Las moscas mayores de tres semanas generalmente son más arrítmicas. No obstante, estos corazones aún son capaces de latir espontáneamente durante horas en hemolinfa artificial oxigenada. Los corazones y moscas adultas que resultan dañados como consecuencia del procedimiento de disección suelen presentar regiones localizadas de constricción extrema que son incapaces de relajarse y a menudo laten de forma incontrolable. Tasas de latido cardíaco más lentas que un hercio rara vez se observan en moscas menores de tres semanas de edad.Por consiguiente, estas preparaciones se consideran dañadas y se descartan. Acabamos de demostrar cómo preparar corazones de moscas de la fruta adultos y en estado intacto parcial para imágenes ópticas. Recuerde, al realizar la preparación semientera, nunca toque directamente el corazón.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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