Name: Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-12T23:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Aprende fosfoproteómica cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae mediante criólisis, fraccionamiento HILIC y enriquecimiento IMAC. Este método robusto permite analizar mecanismos de señalización celular por espectrometría de masas.

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Nos gustaría dar las gracias al Dr. Rich Rogers para la asistencia técnica con análisis de espectrometría de masas y sus útiles comentarios, y los Dres. Rob Moritz, Ranish Jeff, y Hamid Mirzai útil para los debates. Este trabajo fue financiado por el NIH Centros de Excelencia.

Crecimiento de las células y los medios de comunicación <ol><li> Una sola colonia de BY4742Δarg4Δlys1 células durante la noche en 100 ml de medio rico para un OD 600 de 1,0 después de semillas en dos litros de una cultura medio levadura mínima (0,17% de levadura base de nitrógeno, sin sulfato de amonio o aminoácidos, 0,5% de sulfato de amonio) que contiene una complemento completo de aminoácidos, complementada con 20 mg / L de la arginina normal o isótopos pesados ​​(13 C 6 15 N 4; Isotec) y lisina (13 C 6 15 N 2; Isotec). </li><li> Las células fueron cultivadas durante 18 horas, a una OD 600 de 1,8. Es muy importante que las células pasan por lo menos 9 generaciones para lograr la plena incorporación de los isótopos marcados. La muestra de la luz se sedimentaron, se lava con agua estéril, resembrado en un medio que contiene oleato (isótopos normales arginina y la lisina, un 0,2% Oleato (Sigma Chemicals) y el 0,5% de Tween 40 (Sigma Chemicals)) y estimulada por otros 85 minutos. El resultado es un isotópicamente ligero, con respecto a la arginina y la lisina, oleato estimulada por la muestra y una isótopos pesados ​​de glucosa crecido muestra de referencia. </li></ol> Lisis celular, aislamiento y fraccionamiento de los péptidos <ol start="3"><li> Pesar botella de centrífuga. Muestras de la cosecha por centrifugación durante 3 minutos. Eliminar los medios de comunicación y aspirar el exceso de líquido. Pesar de pellets y la botella (por lo general producirá entre 2.1 gramos) y luego congelar flash en nitrógeno líquido. Añadir un volumen equivalente al peso del pellet &#39;rectificado&#39; buffer a los sedimentos congelados en nitrógeno líquido (tampón fosfato salino (PBS, Gibco), 10% de glicerol, inhibidores de la proteasa (SigmaFAST comprimidos inhibidor de la proteasa, Sigma) y inhibidores de la fosfatasa HALT (Thermo Scientific )). </li><li> Congelar el recipiente de molienda en nitrógeno líquido. Espere hasta que el nitrógeno líquido deja hervir. La transferencia de la pastilla a la nave de molienda, con rodamientos de bolas congeladas. </li><li> Molienda a 600 rpm con un 1 minuto 20 segundos con un ciclo de inversión de la dirección durante 3 minutos. Vuelva a congelar el recipiente de molienda en nitrógeno líquido. Repetir cuatro veces más de 15 minutos de tiempo total de molienda. </li><li> Recoger el grindate congelado en un hielo de 50 ml Falcon tubo lugar seco. Almacenar a -80 ° C hasta su utilización. </li><li> Prepare una solución de 10 ml de urea 8 M, bicarbonato de amonio 0,1 M, 0,1 M Tris pH 8,6. Añadir 3 volúmenes de tampón de urea a un volumen de la grindate congelados (por ejemplo 3mls del buffer de urea añade una pastilla de 1 gramo con 1 ml de tampón PBS). Inmediatamente sonicar la mezcla con un baño de ultrasonidos punta de la sonda (2 - 10 pulsos de segundo). Mantener la punta en la parte inferior del tubo para evitar la formación de espuma de la solución. El grindate debe ir inmediatamente a la solución. </li><li> Borrar el lisado por centrifugación durante 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante a tubos nuevos. </li><li> Hacer una alícuota de 0,5 M Tris [2-carboxietil] fosfina (TCEP). Añadir a la muestra a 1:100 para una concentración final de 5 mm. Se incuba a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Alquilación de cisteína reducidos. Dejar enfriar a temperatura ambiente. Hacer una parte alícuota de la yodoacetamida 1M. Mantener en la oscuridad (que envuelve el tubo en papel de aluminio). Añadir a una concentración final de 20 mM. Incubar en la oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Apagar la yodoacetamida con 20 mM DTT de una reserva de 1 millón a temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Cuantificar la proteína de Bradford con un estándar o ensayo de BCA (no se describe). Tomar una muestra para su análisis por SDS-PAGE a continuación. </li><li> Para validar la incorporación de los isótopos pesados, utilice 100 l de lisado reducida y alquilada. Diluir 1:4 con dH 2 O, ultrasonidos y añadir tripsina a 50:1 proteína a la tripsina. De digerir para un mínimo de 4 horas, muestra seca en un Speed ​​Vac y desalar luego con un Ultramicrospin columnas C18 (El Grupo de nido). <ol><li> Columna de hidratarse con 100 l de acetonitrilo </li><li> Equilibre con 200 l TFA 0,1%. </li><li> Resuspender la muestra seca en 200 l TFA 0,1%. De carga sobre la columna. Centrifugar a 200 xg ~ o de la velocidad mínima necesaria para el flujo a través de la columna. </li><li> Lavar dos veces con 200 l TFA 0,1%. </li><li> Eluir con dos veces con 50 l de acetonitrilo 60%, 0,1% de TFA. </li><li> Muestra seca en un Speed ​​Vac. </li><li> Resuspender la muestra en 20 l de ácido fórmico al 0,1%. Ejecutar 2 l de un espectrómetro de masas. Compruebe la incorporación de la arginina y la lisina isótopos pesados ​​por un turno de 10 y 8 Dalton en los respectivos m / z espectros. La incorporación de cada aminoácido debe estar entre 96 a 98%. </li></ol></li><li> Mezcle cantidades equivalentes (mg de proteínas) de las muestras de isótopos pesados ​​y ligeros. </li><li> Diluir la muestra 1:4 con 20% de metanol. </li><li> Añadir a la tripsina 1:200. Incubar toda la noche a 37 ° C. </li><li> Compruebe que la digestión se ha ido hasta el final por SDS-PAGE. De ejecución 2 y 4 l de la muestra predigestión y un 8d 16 l de la digestión después de la tripsina. Visualizar por tinción Coomassie que la digestión es completa. Si no está completo, sonicar la muestra con un breve sonda sonicador punta y digerir de nuevo con tripsina. </li><li> Secar la muestra en un Speed ​​Vac. Cuando se seca añadir 200 l de filtrado dH 2 O y agitar hasta que el precipitado se disuelve. Muestra seca en un Speed ​​Vac. Volver a suspender de nuevo con dH 2 O. Muestra seca de nuevo. </li><li> Resuspender el pellet en 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA, Sigma). Comprobar que el pH es de alrededor de 3 con tiras de pH. Si es necesario acidificar con 10% de TFA. </li><li> Pellet cualquier precipitado. </li><li> Desalinizar las muestras en una Waters Sep-Pak Vac 500 mg columna C18. No sobrecargue las columnas. La cantidad máxima es de 5 mg, pero es mejor para cargar un poco menos. Dividir la muestra entre varias columnas si es necesario. <ol><li> Hidratar la columna con 5 ml de acetonitrilo al 100%. Centrifugar a 200 xg ~ o de la velocidad mínima necesaria para el flujo a través de la columna. </li><li> Equilibrar la columna con 5 ml de TFA 0,1%. Carga de la muestra. Recoge el flujo y la carga de nuevo. </li><li> Lavar con 5 ml de TFA 0,1%. Repetir. </li><li> Eluir con 2 ml de acetonitrilo al 60%, 0,1% de TFA. </li><li> Muestra seca en un Speed ​​Vac. </li></ol></li></ol> Fraccionamiento de péptidos y aislamiento de fosfopéptidos <ol><li> Los péptidos son fraccionados en una columna HILIC. Utilizamos un TOSOH TSK-Gel Amida-80 4,6 mm x 25 cm columna analítica con una columna de seguridad. Tómese su tiempo con este paso, ejecute la columna durante 2 horas a 90% A continuación, ejecute dos gradientes en blanco antes de cargar la muestra. La carga máxima de una columna se considera que el tamaño en alrededor de XX, por lo general no se carga más de 5 mg por ciclo. </li><li> Disolvente A - 98% ACN/0.1% TFA Disolvente B - 2% ACN/0.1% TFA De carga en un 90% más de 20 &#39;, 90% A 85% A más de 5&#39;, un 85% al ​​60% más de 40 &#39;, 60% A 0% A más de 5, 0% a un 90% más de una 5 &#39;. </li><li> El caudal es 1ml/min y las fracciones se recogieron a intervalos de 2 minutos a partir de el 85% a 60% A un gradiente. </li><li> Combinar fracciones de reducir el número de fracciones a 10. El aumento de las fracciones es probable que el rendimiento mayor cobertura de la phosphoproteome. </li></ol> Enriquecimiento de fosfopéptidos <ol><li> Fosfopéptidos se enriquecen con fosfato de hierro Seleccione gel de afinidad. Nos alícuota nuestra resina IMAC para evitar congelamiento repetido descongelación. Hacer 50 ml de ácido acético 250 mM, 30% de solución de carga de ACN. Llevar el pH a 2.7 con HCl. Volver a suspender las pastillas en 500 l de solución de carga. Verifique el pH, ajustar con HCl o NaOH según sea necesario. </li><li> Prelavado 200 l de bolas de IMAC en una columna adecuada. Nosotros usamos las columnas Molbiotec giro. Añadir 15 l de una mezcla del 50% (gel para cargar la solución) a cada fracción, y se incuban las muestras durante 30 &#39;con el extremo final sobre la rotación. Mantener el flujo para el análisis. </li><li> Lavar las muestras 3 veces con solución de carga y una vez con 500 l filtrado dH 2 O. </li><li> Péptidos eluir con 2 - 3 min con 400 l de 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8,4) de amortiguación. Transferir a un frasco de vidrio. </li><li> Acidificar a pH 3 con ácido 5-l fórmico al 100%, la congelación de flash en nitrógeno líquido, y la muestra seca en un Speed ​​Vac. </li><li> Fosfopéptidos Resuspender en 200 l de 0,1% de TFA y C18 limpia como se describe anteriormente. Secan las muestras eluidas en un Speed ​​Vac. </li><li> Resuspender péptidos en 20 l de 0,1% de ácido fórmico. Use 2 l por el análisis de espectrometría de masas o como sea necesario. </li></ol> Notas Durante gran parte de este protocolo que va a trabajar &quot;a ciegas&quot;. La lisis celular puede ser controlado por el Western Blot y ensayos de Bradford o BCA, y la digestión de la tripsina también se puede evaluar fácilmente. La columna HILIC se dio una huella similar a esta, o como se ve por otros [1, 2] en función de la máquina de cromatografía de líquidos que se utiliza. Las muestras son supervisados ​​por espectrometría de masas, las pruebas de las muestras en las máquinas de bajo costo, como LCQs o Maldis antes de ir a los análisis de costos de alta precisión en una gran masa, máquina de alta resolución. Por último, si un secado por una muestra con ácido en el mismo, el uso de cristal.

<ol><li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li>
<li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li>
<li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li>
<li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCX%2FIMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li>
<li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li>
<li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS%2FMS+and+titanium+oxide+precolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li>
<li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li>
<li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+distinct%2C+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li>
</ol>

Este método producirá un enriquecimiento de fosfopéptidos que puede ser analizada cuantitativamente. Una serie de parámetros pueden ser alterados en este protocolo, pero el aspecto más importante a recordar es el de preservar su fosforilación. Preparación de las células para la cuantificación se puede lograr de varias maneras diferentes, por ejemplo, si no se puede etiquetar las células in vivo, las etiquetas, como ICAT [3] o iTRAC [4] se puede utilizar después de la extracción de etiquetar diferencialmente dos...

<table><tbody><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Arginina-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Lisina-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>609021</td><td></td></tr><tr><td>GIBCO&amp;#8482; Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 7,4 (10X) líquida</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Tabletas SigmaFAST de inhibidores de proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de fosfatasas Pierce Halt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Molinillo de bolas Retsch PM100</td><td>Retsch</td><td>20.540.0001</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de molienda de acero inoxidable Retsch de 125 ml</td><td>Retsch</td><td>01.462.0148</td><td></td></tr><tr><td>Columna ultramicrospin C18</td><td>The Nest Group</td><td>SUM SS10</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td><td>Waters</td><td>WAT043395</td><td></td></tr><tr><td>Columna analítica TSK-Gel Amide-80 de 4,6 mm x 25 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>13071</td><td>Esta es la columna cromatográfica HILIC.</td></tr><tr><td>Columna de protección de 4,6 mm de diámetro interno x 1 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>19021</td><td>Recomendamos esta columna de protección para prolongar la vida útil de su columna HILIC.</td></tr><tr><td>Gel de afinidad por hierro PHOS-Select&amp;#8482;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9740</td><td>Esta es la resina IMAC. Aliquotar y almacenar.</td></tr></tbody></table>

phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada saccharomyces cerevisiae</em

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Este protocolo describe el crecimiento y la estimulación, con el oleato de ácidos grasos, de las células de Saccharomyces isótopos pesados ​​y ligeros S.. Las células son de tierra mediante un procedimiento cryolysis en un molinillo de molino de bolas y el grindate resultante llevó a la solución de solubilización urea. Este procedimiento permite la lisis de las células en un estado metabólicamente inactiva, la preservación de la fosforilación y la prevención de la reorientación de la phosphoproteome durante la lisis celular. Tras la reducción, alquilación, digestión con tripsina de las proteínas, las muestras se desala en las columnas C18 y la complejidad de la muestra reducida por fraccionamiento utilizando cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC). Columnas HILIC preferentemente retener moléculas hidrofílicas, que es muy adecuado para phosphoproteomics. Péptidos fosforilados suelen eluir más adelante en el perfil cromatográfico de las contrapartes no fosforilada. Después de fraccionamiento, fosfopéptidos se enriquecen mediante cromatografía de inmovilizado de metal, que se basa en la base de carga para el enriquecimiento de fosfopéptidos afinidades. Al final de este procedimiento las muestras están listos para ser analizada cuantitativamente por espectrometría de masas.

Descripción de un procedimiento de fosforilación cuantitativos utilizando cryolysis, solubilziation urea, fraccionamiento HILIC y enriquecimiento IMAC de péptidos fosforilados.

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

Este protocolo describe el crecimiento y la estimulación, con el ácido graso oleato, de células de S. cerevisiae isotópicamente pesadas y ligeras. Las células se trituran...

La fosforilación es un mecanismo clave de señalización celular que regula procesos desde la localización de proteínas hasta la transcripción del ADN, y el estudio del fosfoproteoma mediante espectrometría de masas es un avance novedoso y prometedor en el estudio de la señalización y la proteómica. Las células con marcado diferencial se lisaron mediante lisis en un molino de bolas, luego se redujeron, alquilaron, mezclaron y digirieron. Los péptidos digeridos se fraccionaron mediante cromatografía de interacción hidrofílica y los péptidos fosforilados se enriquecieron a partir de las fracciones mediante enriquecimiento con iMac.Las fracciones enriquecidas en péptidos fosforilados luego se identifican mediante msm. Ms. Hola, soy Ramsey Celine del grupo E del Instituto de Biología de la Persistencia. Hoy les mostraremos un procedimiento para la extracción de péptidos fosforilados marcados metabólicamente.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cuantitativamente el proteoma de la fossa. Comencemos. Este procedimiento comienza con el cultivo de células de levadura isotópicamente ligeras y pesadas.Primero, inocule 100 mililitros de medio rico con una sola colonia de células de levadura. Incube esta cultura durante la noche hasta alcanzar una DO 600 de 1,0. Luego, utilícela para sembrar dos cultivos de un litro de medio mínimo que contenga un complemento completo de aminoácidos y esté suplementado con 20 miligramos por litro de isótopos.Cultive en paralelo un litro de cultivos con arginina y lisina normales o con isótopos pesados durante 18 horas hasta alcanzar una DO 600 de 1,8. Es fundamental que las células atraviesen al menos nueve generaciones para lograr la incorporación completa de los isótopos marcados. Cuando las células hayan incorporado completamente los isótopos marcados, centrifugue las células que se cultivaron en el medio con arginina y lisina isotópicamente normales.Para obtener un pellet celular, lave el pellet con agua estéril y resuspenda en un medio que contenga oleato con arginina y lisina isotópicamente normales, y estimule durante 85 minutos. Esto produce una muestra estimulada con oleato isotópicamente ligera. La otra cultura, crecida en medios con arginina y lisina isotópicamente pesadas, no se estimula con oleato y servirá como muestra de referencia crecida en glucosa isotópicamente pesada.Para recolectar un litro, se distribuye el cultivo entre cuatro botellas de centrífuga de 250 mililitros. Después de la centrifugación, las células se recogen en un solo tubo eliminando o dejando solo 100 mililitros del medio y resuspendiendo las células, luego se transfiere a otro tubo. Al final, se obtiene un gran pellet en un solo tubo, que se centrifuga durante tres minutos a 4.000 RPM.Tras eliminar el medio, se compara el peso del frasco de centrífuga y del precipitado con el de un frasco de centrífuga vacío. Después de la centrifugación, retire el medio y aspire el exceso de líquido de los frascos, pese los precipitados y un rendimiento típico está entre uno y dos gramos. A continuación, congele rápidamente los precipitados en nitrógeno líquido y agregue tampón de molienda que contiene inhibidores de proteasas y fosfatasas a los precipitados.El volumen de tampón de molienda añadido debe ser equivalente al peso del pellet. Congele el recipiente de molienda en nitrógeno líquido. Cuando el nitrógeno líquido haya dejado de hervir.Utilice una espátula para desmenuzar el pellet y transfiéralo al recipiente de molienda que contiene bolas de acero congeladas. Muela los pellets a 600 RPM con un ciclo de un minuto y 22 segundos y reversión de dirección durante tres minutos. Vuelva a congelar el recipiente de molienda en nitrógeno líquido.Repita la molienda cuatro veces más para un total de 15 minutos. Tiempo de molienda cuando la molienda esté completa para ambas muestras. Recolecte la fecha de molienda congelada en tubos falcon de 50 mililitros y manténgalos congelados ya sea en nitrógeno líquido o en hielo seco.Guarde la fecha de molienda a menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para su uso. El aislamiento y la fraccionación de los péptidos comienzan con su alquilación. El primer paso consiste en solubilizar su muestra en la solución de urea.Lleve cada fecha de molienda a solución añadiendo tres volúmenes de tampón de urea a un volumen de fecha de molienda congelada. Por ejemplo, se añaden tres mililitros de tampón RIA a un pellet de un gramo. Con un mililitro de tampón PBS.Sonicar inmediatamente la mezcla con la sonda. Usar la punta de la sonda. Mantener la punta cerca del fondo del tubo para evitar la formación de espuma en la solución.La fecha de molienda debe pasar inmediatamente a la solución. Clarifique los lisados mediante centrifugación a 6.000 RPM durante cinco minutos. A cuatro grados Celsius, transfiera el SUPINATE a tubos frescos.Para iniciar la reacción de reducción, agregue tris recién preparado 0,5 molar, dos carboxil LITAL FOSFINA o TCEP a cada muestra en una dilución de uno a 100. Para alcanzar una concentración final de TCEP de cinco milimolar, incube las muestras a 37 grados Celsius durante una hora. Después de la incubación a 37 grados Celsius, deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente.Luego, agregue iodoacetamida recién preparada 1 M a una concentración final de 20 milimolares, incube a oscuras durante una hora a temperatura ambiente. Tras la incubación de una hora, detenga la reacción de la iodoacetamida con DTT 20 milimolar. Deje a temperatura ambiente durante una hora.Los lisados reducidos y alquilados ya están listos para la digestión con tripsina. En este punto, se pueden tomar muestras de los lisados para la cuantificación proteica, análisis en gel SDS-PAGE para verificar la lisis celular y análisis por espectrometría de masas para validar la incorporación de los isótopos pesados. Para iniciar la digestión con tripsina, mezcle cantidades equivalentes de las muestras isotópicamente pesadas y ligeras.Diluya la muestra una parte en cuatro con metanol al 20 % y agregue tripsina en una dilución de una parte en 200. Incube la muestra durante la noche a 37 grados Celsius al día siguiente. Después de verificar la digestión completa mediante electroforesis SDS-PAGE y tinción con comassie, seque la muestra en un evaporador al vacío cuando esté seca.Añada 200 microlitros de agua destilada filtrada y vortexee hasta que el precipitado pase a solución. Seque la muestra en un evaporador al vacío y resuspenda nuevamente con agua destilada. Después de secar la muestra, una vez más, resuspenda el precipitado en ácido trifluoroacético al 0,1% o TFA, y verifique que el pH sea aproximadamente tres utilizando tiras de pH si es necesario. Acidifique con TFA al 10% y precipite cualquier material insoluble.La muestra digerida con tripsina se desalará ahora utilizando una columna VAC C18 de 500 miligramos. Para comenzar, hidrate la columna con cinco mililitros de acetonitrilo al 100 % y centrifugue a aproximadamente 200 × g o a la velocidad mínima necesaria para que el líquido pase a través de la columna. A continuación, equilibre la columna con cinco mililitros de TFA al 0,1 % y cargue la muestra.Tenga cuidado de no sobrecargar la columna y, si es necesario, divida la muestra entre varias columnas. Recopile el flujo en un recipiente de desecho y cargue la columna nuevamente si es necesario; lave con cinco mililitros de TFA al 0,1 %. Repita este lavado y eluya con dos mililitros de acetonitrilo al 60 % en TFA al 0,1 %. EEU debe recogerse mediante centrifugación.Seque la muestra en un evaporador al vacío y resuspenda la muestra seca en 200 microlitros de disolvente B. La muestra resuspendida ya está lista para la fraccionamiento de péptidos. Fraccione los péptidos en una columna analítica TSK gel AMIDE 80 con una columna de protección. Tómese su tiempo con este paso.Corra la columna durante dos horas al 90 % del solvente A, luego realice dos gradientes en blanco antes de cargar su muestra. Por lo general, no cargamos más de cinco miligramos por corrida en una columna de este tamaño, tanto en cromatografía líquida moderna como no tan moderna. Los equipos permiten la inyección automatizada de muestras, la recolección de fracciones, el control del flujo y las mezclas en gradiente.Estos se establecen al inicio del análisis, como se describe. Cargar con 90%A durante 20 minutos, de 90%A a 85%A en cinco minutos, de 85%A a 60%A en 40 minutos, de 60%A a 0%A en cinco minutos y de 0%A a 90%A en cinco minutos. Establezca el caudal en un mililitro por minuto y recoja las fracciones a intervalos de dos minutos.Comenzando en el gradiente de 85%A a 60%A, combine las fracciones para reducir el número de fracciones a 10; es probable que fracciones aumentadas proporcionen una mayor cobertura del fosfoproteoma. Los péptidos fosforilados se enriquecen mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados. Utilizamos el gel de afinidad por hierro phos select como la resina iMac.Primero, suspender los pellet en 500 microlitros de solución de carga. A continuación, añadir 15 microlitros de una suspensión al 50 % a cada fracción e incubar las muestras durante 30 minutos con rotación de extremo a extremo. Mantener el flujo para el análisis.Lave la muestra tres veces con la solución de carga y una vez con 500 microlitros de agua destilada filtrada después de los lavados; eluya los péptidos durante dos a tres minutos con 400 microlitros de tampón de fosfato sódico 50 milimolar. Transfiera los péptidos eluidos a un vial de vidrio. Añada cinco microlitros de ácido fórmico al 100 % para acidificar hasta pH tres, resuspenda los péptidos fosforilados en 200 microlitros de TFA al 0,1 % y desaline nuevamente con una columna C18 como se describió previamente; seque las muestras eluidas en un evaporador rápido.Finalmente, re suspenda los péptidos fosforilados en 20 microlitros de ácido fórmico al 0,1 %. Las muestras ya están listas para ser analizadas cuantitativamente mediante espectrometría de masas. A continuación se muestra un trazado cromatográfico de la fraccionación de péptidos celulares totales utilizando cromatografía H-I-L-I-C.Puede observarse en este cromatograma que, aunque los péptidos fosforilados se encuentran a lo largo de todo el perfil de elución, la mayor parte de los residuos fosforilados se retienen hasta cerca del final del perfil de elución. Acabamos de mostrarle cómo desintegrar células, digerir proteínas, fraccionar péptidos y enriquecer péptidos fosforilados mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados. Al realizar este procedimiento, es importante recordar preservar la fosforilación y verificar el pH de las soluciones Beer.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

Aquí se describe una nueva técnica de proteómica cuantitativa para la identificación de complejos de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. En este estudio, hemos utilizado el método de SILAC junto con la purificación de afinidad seguida de espectrometría de masas para identificar con una alta especificidad de la unión de compañeros de una proteína del RE, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Se describe un nuevo método cuantitativo para la identificación de lipidómica numerosas especies de lípidos en la levadura con la encuesta de exploración de ionización electrospray espectrometría de masas (ESI / MS). Este método supera actualmente los métodos disponibles para la identificación y cuantificación de los lípidos en la capacidad de resolver diferentes formas moleculares de los lípidos, la sensibilidad y la velocidad.

Una evaluación cuantitativa de la Lipidome levadura utilizando la espectrometría de masas de ionización por electrospray

Dos métodos complementarios basados ​​en citometría de flujo y microscopía se presentan que permiten la cuantificación, a nivel de una sola célula, de la dinámica de la expresión génica inducidos por la activación de una vía MAPK en la levadura.

La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

Este artículo describe un ensayo basado en el crecimiento de levaduras para la determinación de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas. También demuestra un método para la extracción rápida de proteínas de levadura, adecuado para la transferencia de Western para confirmar bioquímicamente los requisitos de degradación. Estas técnicas se pueden adaptar para monitorear la degradación de una variedad de proteínas.

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Muchas de las (fosfo)lipasas predichas están mal caracterizadas con respecto a sus especificidades de sustrato y funciones fisiológicas. Aquí proporcionamos un protocolo para optimizar las actividades enzimáticas, buscar sustratos naturales y proponer funciones fisiológicas para estas enzimas.

La definición de Sustrato especificidades para la lipasa y la fosfolipasa candidatos

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Enriquecimiento de fosfopéptidos acoplada con espectrometría de masa libre de etiqueta cuantitativa para investigar la Phosphoproteome en cáncer de próstata

Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem para identificar y cuantificar los principales lípidos celulares en Saccharomyces cerevisiae. El método descrito para una evaluación cuantitativa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es versátil, robusto y sensible.

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

Aquí se presenta un enfoque fosfoproteómico, a saber, detener e ir extracción a base de punta fosfoproteómica, que proporciona alto rendimiento y cobertura profunda de arabidopsis fosfoproteoma. Este enfoque delinea la visión general de la señalización de estrés osmótico en Arabidopsis.

Estrategia fosfoproteómica para perfilar la señalización de estrés osmótico en Arabidopsis

Presentamos un protocolo para la identificación y cuantificación de las principales clases de metabolitos solubles en agua en la levadura Saccharomyces cerevisiae. El método descrito es versátil, robusto y sensible. Permite la separación de isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de metabolitos solubles en agua entre sí.

Metabolómica cuantitativa de Saccharomyces cerevisiae mediante cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en tándem

Aquí, se presenta un protocolo para el etiquetado metabólico de levaduras con ácido 14C-acético, que se combina con cromatografía de capa delgada para la separación de lípidos neutros.

Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada

Aquí, presentamos un protocolo para el uso de sustratos de levadura mostrados en la superficie para ensayos de modificación enzimática. La plataforma se demostró utilizando el análisis de la actividad de desfosforilación de la tirosina fosfatasa SHP-2 frente a uno de sus sustratos como ensayo representativo de modificación enzimática.

Modificación enzimática y evaluación por citometría de flujo de proteínas mostradas en la superficie de la levadura

Aprende fosfoproteómica cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae mediante criólisis, fraccionamiento HILIC y enriquecimiento IMAC. Este método robusto permite analizar mecanismos de señalización celular por espectrometría de masas.

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae

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