Name: Un In vitro Tumor FluoroBlok invasión de ensayo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprende a medir la invasión de células tumorales mediante ensayos fluorescentes in vitro con membranas de matrigel. Este método permite evaluar la capacidad invasiva de diferentes líneas celulares en investigación oncológica.

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Post-etiquetado y la medición con BD calceína AM tinte fluorescente Las células están etiquetados para la cuantificación después de haber invadido a través de la matriz BD Matrigel y pasa a través de la membrana BD FluoroBlok. Como resultado, sólo medición de la variable de la invasión de células se pueden obtener. <ol><li> Se cultivan las células en la confluencia ~ 80%. </li><li> Preparar y rehidratar el sistema de inserción. <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Retire el paquete de -20 ° C de almacenamiento y permitir que llegue a temperatura ambiente. </li><li> Abra el paquete de aluminio y añadir 500 l tibia (37 ° C) los medios de comunicación al interior de los pozos de inserción. Dejar la placa para rehidratar durante 2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Nota: No es necesario rehidratar la BD Falcon sin recubrimiento FluoroBlok 24 Multiwell sistema de inserción que se utilizará como control de la migración celular. </li><li> Después de la rehidratación, retire con cuidado el medio de los pozos de inserción sin afectar la capa de BD Matrigel matriz de la membrana. El sistema está ahora listo para usar. </li></ol></li><li> Preparar las suspensiones de células por trypsinizing monocapas de células y resuspender las células en DMEM libre de suero de 5 x 10 4 células / ml. Nota: Si utiliza un tipo de células diferentes que usted necesita para determinar la densidad de siembra óptima. Para determinar la densidad de siembra óptima para su tipo de célula en una superficie porosa crecimiento, utilizan una gama de densidades de siembra (células / cm 2) que pone entre paréntesis la densidad de siembra utilizado en superficies no porosas (por ejemplo, frascos, platos y bandejas). Por ejemplo, si actualmente las semillas de 2,5 x 10 5 células / cm 2, la semilla en las concentraciones de células, entre 5 x 10 4 y 5 x 10 5 células / cm 2 para determinar la densidad óptima de siembra inicial. </li><li> Añadir 500 l de suspensión de células (2,5 x 10 4 células) de las cámaras apical. </li><li> Añadir 750 l de quimioatrayente (5% de SFB en DMEM) a cada una de las cámaras basal, utilizando los puertos de muestreo para el acceso. </li><li> Incubar la BioCoat BD tumor del sistema y la invasión sin recubrimiento BD Falcon FluoroBlok 24 Multiwell Plate de Inserción de 20-22 horas a 37 ° C, 5% de CO2 la atmósfera. </li><li> Después de la incubación, retire con cuidado medio de las cámaras apical. Esto se puede lograr simplemente accionando el contenido en un recipiente de residuos. No toque la superficie inferior del sistema de inserción. </li><li> Transferir el sistema de insertar en un segundo 24 y placa con 500 l / pocillo de 4 mg / mL calceína AM en HBSS. Incubar durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO 2. La solución calceína AM no se elimina de la cámara baja antes de la lectura de fluorescencia, ya que es un colorante no fluorescente vital que se convierte en calceína verde fluorescente por las esterasas citosólicas. </li><li> Fluorescencia de las células invadidas se lee en longitudes de onda de 494/517 nm (Ex / Em) en un lector de placas de abajo hacia la lectura fluorescente. El ajuste de la ganancia posible que tenga que ser determinada empíricamente, pero una ganancia del punto medio debe ser un punto de partida suficiente. Un ajuste de la ganancia que es demasiado alto puede conducir a la saturación del detector con una muestra altamente fluorescente, lo que puede impedir la adquisición de resultados significativos. El uso de AutoGain (si es compatible en el lector) no es recomendable. Un microscopio de fluorescencia invertido se puede utilizar para comprobar los resultados, es especialmente útil para ello la primera vez que ejecute esta prueba. Nota: Es de suma importancia que los sistemas de inserción se leen con el mapa de la placa correcta. Para obtener información sobre mapas de placa de carga BD ver Boletín Técnico N º 436 de www.bdbiosciences.com o póngase en contacto con BD de Apoyo Técnico (labware@bd.com). Orientación de la placa adecuada es con el pocillo A1 en la esquina superior izquierda y el logotipo de BD Flacon orientada a la derecha de la placa se introduce en el lector. </li></ol> Reducción de datos Los datos se expresan como en la siguiente ecuación: <img src="/files/ftp_upload/1475/1475eqa.jpg" alt="Ecuación" /> De fondo se puede restar antes de la invasión de cálculo del porcentaje de células RFU = fluorescentes unidades relativas.

<ol><li>Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol%2C+a+novel+triterpene%2C+potentiates+TNF-induced+apoptosis+and+suppresses+invasion+of+tumor+cells+by+inhibiting+NF-%CE%BAB-regulated+gene+products+and+TAK1-mediated+NF-%CE%9AB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation.</a> Blood. 109, 2727-2735 (2007).</li>
<li>Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evodiamine+Aboloishes+Constitutive+and+Inducible+NF-%CE%BAB+Activation+by+Inhibiting+I%CE%BAB%CE%B1+Kinase+Activation%2C+Thereby+Suppressing+NF-%CE%BAB-regulated+Antiapoptotic+and+Metastatic+Gene+Expression%2C+Up-regulating+Apoptosis%2C+and+Inhibiting+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion.</a> J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).</li>
<li>Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+cysteini+residues+in+I%CE%BAB%CE%B1+kinase+and+NF-%CE%BAB+%28p65%29+by+xanthohumol+leads+to+suppression+of+NF-%CE%BAB-regulated+gene+products+and+potentiation+of+apoptosis+in+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells.</a> Blood. , 113-2003 (2009).</li>
<li>Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. eguelin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+Akt+Inhibitor%2C+Suppresses+I%CE%9AB%CE%B1+Kinase+Activation+Leading+to+Suppression+of+NF-%CE%BAB-Regulated+Gene+Expression%2C+Potentiation+of+Apoptosis%2C+and+Inhibition+of+Cellular+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion.</a> J. Immunol. , 177-5612 (2006).</li>
<li>Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. 2005 Sept 11-15, Geneva, Switzerland, , (2005).</li>
<li>An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. , 6,740,501,B2 (2004).</li>
<li>Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Fluorescent+Cell+Labeling+on+Tumor+Invasion+and+Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Mole.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds.</a> Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).</li>
<li>Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. 2005 Mar 12-16, San Diego, CA, , (2005).</li>
<li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. 1999 Sept 13-16, Edinburgh, SC, UK, , (1999).</li>
</ol>

Los autores son empleados de BD Biosciences, que produce los reactivos y las herramientas utilizadas en este artículo.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Invasión Tumoral BD BioCoat</td><td>BD Biosciences</td><td>354165 o 354166</td><td></td></tr><tr><td>Células HT-1080 y NIH/3T3</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;Medio Dulbecco de Eagle modificado (DMEM; sin suero)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Solución salina tamponada con fosfato, sin calcio ni magnesio (DPBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema BD Falcon FluoroBlok de 24 pocillos con insertos para su uso como control de migración celular</td><td>BD Biosciences</td><td>351157 o 351158</td><td></td></tr><tr><td>5% suero bovino fetal en DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Calcein AM Colorante Fluorescente</td><td>BD Biosciences</td><td>354216 o 354217</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solución salina equilibrada (HBSS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas BD Falcon de 24 pocillos para la etiqueta posterior a la invasión celular</td><td>BD Biosciences</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas de fluorescencia con capacidad de lectura por la parte inferior</td><td>PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un in vitro tumor fluoroblok invasión de ensayo

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

La característica distintiva de las células metastásicas es su capacidad para invadir a través de la membrana basal y migrar a otras partes del cuerpo. Las células deben ser capaces de secretar tanto proteasas que rompen la membrana basal, así como la migración con el fin de ser invasivo. BD tumor BioCoat Sistema invasión provee a las células con las condiciones que permitan la evaluación de sus propiedades invasivas<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Se trata de un FluoroBlok BD Falcon 24 Multiwell Plate de Inserción con una membrana de 8,0 micras de poro PET tamaño que ha sido uniformemente cubierto con BD Matrigel matriz. Esta capa uniforme de BD Matrigel matriz sirve como una membrana basal reconstituida<em&gt; In vitro</em&gt; Ofrecer una verdadera barrera para no invasiva, mientras que las células que presentan una estructura de la proteína adecuada para estudiar la invasión. El proceso de recubrimiento obstruye los poros de la membrana, el bloqueo no invasiva las células migren a través de la membrana. En contraste, las células invasoras son capaces de desprenderse de y migran a través de la membrana de recubrimiento. La cuantificación de la invasión de células se puede lograr ya sea por invasión de etiquetado antes o después de las células con un tinte fluorescente como DiIC<sub&gt; 12</sub&gt; (3) o calceína AM, respectivamente, y la medición de la fluorescencia de las células invasoras. Ya que la membrana BD FluoroBlok efectivamente bloquea el paso de la luz desde 490 hasta 700 nm con una eficiencia&gt; 99%, con fluorescencia células marcadas que no han invadido no son detectados por un lector de placas de abajo a la lectura de fluorescencia. Sin embargo, las células que han invadido a la parte inferior de la membrana ya no están protegidos de la fuente de luz y son detectados con el lector de placas respectivas. Este video muestra una celda de punto final de la invasión de ensayo, utilizando calceína AM para detectar células invadidas.

Este video muestra la forma de medir la invasión de las células a través de insertos de cultivo celular utilizando una metodología basada en fluorescencia.

Un In vitro Tumor FluoroBlok invasión de ensayo

La característica distintiva de las células metastásicas es su capacidad para invadir la membrana basal y migrar a otras partes del cuerpo. Las células deben ser capaces de...

La invasión celular es un paso importante en la progresión del cáncer y la angiogénesis. Los ensayos de invasión in vitro evalúan típicamente la capacidad de las células para degradar la membrana basal reconstituida, como la matriz BD, la matriz de gel, y migrar a través de insertos para cultivo celular. El ensayo de invasión tumoral comienza cuando se añaden células a insertos Fluor block recubiertos con matri gel.Se añade un agente quimioatractivo de membrana basal reconstituida a la cámara basal y el sistema se incuba. Durante la noche, las células invasivas serán capaces de degradar la barrera de gel de matriz y atravesar la membrana del bloque de flora, una membrana especializada que protege al Fluor de la luz ambiental. Se descarta el contenido de la cámara apical y el inserto de múltiples pozos se añade a una segunda placa que contiene un Fluor.Tras la incubación, las células viables se tiñen y pueden detectarse visualmente y mediante un lector de microplacas. Hola, soy Jeff Partridge de BD Biosciences Discovery LabWare. Hoy les mostraremos un procedimiento para el ensayo de invasión de tumores en bloque de suelo.Utilizamos este procedimiento para estudiar la invasión de células tumorales a través de una membrana basal hacia el quimioatractivo. Comencemos. Cultive las células para el ensayo de invasión tumoral hasta alcanzar aproximadamente el 80 % de confluencia.En este experimento, utilizaremos las líneas celulares HT 10 80 y N NIH three T three. Se ha demostrado que las células HT 10 80 migran e invaden la barrera de matrigel en el sistema, por lo que sirven como buenos controles positivos para el ensayo. Las células NIH three T three no son invasivas, pero sí migran, y por lo tanto sirven como buenos controles negativos para este procedimiento.Para comenzar, rehidrate el sistema mediante la extracción del paquete del sistema de invasión tumoral BD BioCoat del almacenamiento a menos 20 grados Celsius y permita que alcance la temperatura ambiente. Dado que el ensayo requiere técnica estéril, deje que el inserto alcance la temperatura ambiente dentro de la cabina de cultivo celular. Una vez que el paquete alcance la temperatura ambiente, ábralo para rehidratar la membrana basal a través de la cual pueden pasar sus células de interés.Añada 500 microlitros de medio tibio al interior de los pocillos del inserto y permita que la placa se rehidrate durante dos horas a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono. No es necesario rehidratar la placa de inserto multipozo BD Falcon Flora Block 24 sin recubrir, ya que se utilizará como control de migración celular para preparar las células para el ensayo de invasión. Despegue las monocapas celulares con tripsina y resuspenda las células en DMEM sin suero a una concentración de cinco por diez a la cuatro células por mililitro.Si se utiliza un tipo celular diferente, la densidad de siembra óptima debe determinarse empíricamente. Después de la rehidratación de la placa recubierta, retire cuidadosamente el medio de los pozos del inserto sin perturbar la capa de gel de MA sobre la membrana. El sistema ya está listo para ser utilizado.No permita que la capa de gel MA se seque. Para comenzar el ensayo de invasión celular, agregue 500 microlitros de cada suspensión celular a las cámaras apicales del sistema de invasión tumoral en ambas configuraciones, recubiertas y sin recubrir con matrigel. A continuación, utilizando los puertos de muestra para acceder, agregue 750 microlitros de quimioatractante a las cámaras basales dentro de las placas recubiertas y sin recubrir.Es extremadamente importante no introducir burbujas al llenar las cámaras basales. Como control de migración, agregue cada suspensión celular así como el quimioatractivo a la placa de inserción BD Falcon Flora Block 24 Multi WA sin recubrir. Incube el sistema de invasión tumoral y la placa de inserción Falcon Flora Block 24 Multi WA sin recubrir durante 20 a 22 horas a 37 grados Celsius, en atmósfera de dióxido de carbono al 5% al día siguiente.Una vez finalizada la incubación, las células están listas para ser marcadas con un colorante fluorescente de calcio am. Retire cuidadosamente el medio de las cámaras apicales agitando suavemente el contenido hacia un recipiente de desecho. A continuación, transfiera inmediatamente el sistema de insertos a una segunda placa de 24 pocillos que contenga 500 microlitros por pocillo de cuatro microgramos por mililitro.Calcio am en solución salina balanceada de Hank. Repita estos pasos con el control de migración. Incube las placas durante una hora a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono.No toque la superficie inferior del sistema de insertos. Al final de la incubación de una hora con calcio, se puede medir la fluorescencia de las células invasoras. Es de suma importancia que los sistemas de insertos se identifiquen utilizando el mapa de placas correcto.La orientación correcta de la placa es con el pocillo A1 en la esquina superior izquierda y el logotipo de BD Falcon orientado hacia la derecha mientras se inserta la placa en el lector. La fluorescencia se lee a longitudes de onda de 494 y 517 nanómetros en un lector de placas fluorescente con lectura por la base. Debe verificar sus resultados con un microscopio de fluorescencia invertido para asegurarse de que los datos del lector de placas coincidan con los resultados visuales. Estos son datos típicos del lector de placas procedentes de una placa recubierta y una placa control sin recubrir, obtenidos a partir de ensayos de invasión celular de las dos líneas celulares HT 10 80 y NIH 3T3.Los datos de los pocillos sin células representan el fondo que puede restarse antes del cálculo del porcentaje de invasión celular. Calcule el porcentaje de invasión utilizando la siguiente ecuación. El porcentaje de invasión es igual a la media de las unidades relativas de fluorescencia o rfu de las células que han atravesado la membrana recubierta con matrigel hacia el quimioatractivo.Esto se divide por el valor medio de RFU de las células que han migrado a través de la membrana del bloque VD sin recubrir hacia el quimioatractivo. Luego, este valor se multiplica por 100. Este gráfico muestra la comparación del porcentaje de invasión celular entre las células HT 10 80 y las células NIH 3T3, y como se puede observar, las células HT 10 80 son invasivas mientras que las células NIH 3T3 no lo son.Cuando se observan las células bajo un microscopio fluorescente invertido, los resultados son consistentes con los obtenidos mediante el lector de placas. Las células invasivas HT 10 80 atravesaron el matrigel y también migraron a través de la membrana no recubierta. En contraste, las células no invasivas NIH three T three no invadieron a través del matrigel, pero sí migraron a través de la membrana no recubierta.Acabamos de mostrarle cómo realizar un ensayo de invasión tumoral con bloque floral. Al realizar este procedimiento, es importante mantener las placas en posición horizontal y minimizar la formación de burbujas. Estas podrían afectar sus resultados.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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