El agotamiento de las poblaciones de células específicas por el agotamiento del complemento

El agotamiento del complemento es un método rápido, eficaz y económico para purificar poblaciones de células inmunitarias. El agotamiento del complemento comienza cuando se añaden anticuerpos monoclonales IgM o IgG a una población celular, los cuales dirigen su acción contra un tipo celular específico. En este ejemplo, dirigiremos la eliminación contra los linfocitos T.

El sistema del complemento se añade entonces, iniciando una cascada proteolítica, lo que resulta en la muerte de las células T. La población celular se centrifuga luego y se lava por filtración para eliminar las células muertas y los restos celulares. Este método de agotamiento por complemento generalmente provoca la eliminación del 95 al 100 % de la población celular diana.

Hola, soy Bonnie Dittle. Soy investigadora en el Instituto de Investigación de la Sangre del Centro de la Sangre de Wisconsin ubicado en Milwaukee. Hoy les mostraré la técnica de agotamiento por complemento, un método rápido y económico para el agotamiento de poblaciones celulares específicas.

Utilizamos esta técnica en mi laboratorio para enriquecer altamente poblaciones de células inmunitarias que luego empleamos en varios bioensayos, incluidos aquellos que implican la activación celular y el análisis de la expresión de proteínas. Comencemos. Antes de iniciar el experimento, prepare alícuotas de 0,5 o un mililitro de complemento de conejo y almacénelas en un congelador a menos 20 o menos 80 grados.

Asegúrese de titular el complemento a una dilución óptima entre uno a 10 y uno a 20. Una excelente fuente comercial de complemento que utilizamos habitualmente es de Pereze Biologicals; para este procedimiento, los anticuerpos monoclonales de ratón y los anticuerpos monoclonales de conejo suelen ser eficaces en la activación del complemento, aunque no todos los anticuerpos serán adecuados. Los anticuerpos IgM generalmente son los más eficientes para la lisis celular inducida por complemento.

Los anticuerpos IgG son los segundos más eficientes y se utilizan típicamente porque la mayoría de los anticuerpos monoclonales son IgG; se debe titular cada anticuerpo para su uso óptimo en una densidad celular de 10 a la séptima células por mililitro, lo cual se determina empíricamente. La mayoría de los anticuerpos se usan en un rango de 0,1 a 10 microgramos por mililitro. Para el agotamiento de linfocitos T esplénicos, utilizamos un anticuerpo monoclonal específico para TH uno.

Para comenzar la eliminación del complemento, diluya las células en medio de cultivo celular que contenga 5% de suero fetal inactivado por calor, de modo que la población celular inicial sea de dos veces 10 a la séptima células por mililitro. Por ejemplo, cinco veces 10 a la séptima células deben diluirse en 2,5 mililitros de medio. Este volumen de células representa la mitad del volumen final, y por lo tanto tiene una concentración dos veces mayor que la utilizada durante la eliminación, que será de una vez 10 a la séptima células por mililitro.

En este momento, guarde hasta un vez 10 a la seis células para que el agotamiento pueda cuantificarse al final del experimento. Además, descongele la cantidad necesaria de complemento a temperatura ambiente. Hemos encontrado que una dilución de uno a 15 es adecuada al usar complemento de conejo de Pereze Biologicals para cinco veces 10 a la siete células; 1,5 mililitros de Eloqua congelado son suficientes.

Ahora agregue la cantidad adecuada de anticuerpo a la suspensión celular y mezcle. Para esterilizar el complemento, utilice un filtro de punta de jeringa de baja unión a proteínas. Llene la jeringa con uno o dos mililitros de medio.

Antes de agregar el complemento para cinco veces 10 a la siete células, necesitaremos 340 mililitros de complemento para una dilución de uno a 15. Luego, filtre el complemento directamente en el tubo que contiene las células y el anticuerpo. Ahora ajuste el volumen final en el tubo para que las células tengan una concentración de una vez 10 a la siete células por mililitro.

A continuación, incube las células a 37 grados Celsius en un baño de agua durante una hora. Recuerde mezclar las células cada 15 minutos mediante inversión suave. Tras la incubación, centrifugue las células a una velocidad que no afecte la viabilidad.

Luego, nuevamente en la cabina, deseche el sobrenadante. A continuación, lave las células dos veces con 10 mililitros de medio. Observe cómo los restos celulares se acumulan, con algunos adheridos a las paredes de los tubos de poliestireno.

Después del último lavado, filtre las células a través de un drenaje celular de nailon estéril de 70 micrones. Finalmente, verifique la pureza celular comparando la población celular de interés antes y después del flujo de agotamiento.

La citometría y la inmunohistoquímica son los métodos preferidos para determinar la pureza celular antes de realizar el experimento. Cuando se utiliza un anticuerpo monoclonal altamente eficaz para activar el complemento, la primera ronda de depleción por complemento elimina más del 95 % de las células. Por ejemplo, al usar citometría de flujo para medir el porcentaje de células T alfa-beta en una preparación de células pleurales de ratón, encontramos que contenían 32,2 % de células T alfa-beta tras la depleción con complemento mediante anti-CD51, que se expresa en todas las células T, pero no en otros leucocitos. La población de células TCR beta se redujo en un 95 % hasta una concentración final del 1,56 %.

Acabo de mostrarle un método rápido y eficaz para agotar poblaciones celulares específicas utilizando anticuerpos específicos del antígeno en la depleción por complemento. Al realizar este procedimiento, recuerde probar cada anticuerpo para verificar su eficacia y titularizar su complemento en un experimento piloto antes de comenzar. Eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.