El agotamiento de las poblaciones de células específicas por el agotamiento del complemento

La depleción del complemento es un método rápido, eficaz y económico para purificar las poblaciones de células inmunitarias. La depleción del complemento comienza cuando se agregan anticuerpos monoclonales IGM o IgG a una población celular, que se dirigen a un tipo específico de célula. En este ejemplo, nos centraremos en las células T para su agotamiento.

A continuación, se añade el sistema de complemento iniciando una cascada proteolítica, que da lugar a la muerte de las células T. A continuación, la población de células se lava y filtra por centrifugación para eliminar las células muertas y los residuos. Este método de depleción del complemento suele dar lugar a la eliminación del 95 al 100% de la población celular objetivo.

Hola, soy Bonnie Dittle. Soy investigadora en el Instituto de Investigación de la Sangre del Centro de Sangre de Wisconsin, ubicado en Milwaukee. Hoy os voy a enseñar la técnica de la depleción del complemento, un método rápido y barato para el agotamiento de poblaciones celulares específicas.

Utilizamos esta técnica en mi laboratorio para enriquecer en gran medida las poblaciones de células inmunitarias que luego utilizamos para una serie de bioensayos, incluidos los que implican la activación celular y el análisis de la expresión de proteínas. Así que comencemos. Antes de comenzar el experimento, prepare alícuotas de 0,5 o un mililitro de complemento de conejo y guárdelo en un congelador a menos 20 o menos 80 grados.

Asegúrese de ajustar el complemento a una dilución óptima entre uno a 10 y uno a 20. Una excelente fuente comercial de complemento que utilizamos habitualmente es Pereze biologicals para este procedimiento, los anticuerpos monoclonales de ratón y rap son generalmente eficaces en la activación del complemento, pero no todos los anticuerpos serán adecuados. Los anticuerpos IgM son generalmente los más eficientes para la lisis celular inducida por el complemento.

Los anticuerpos IgG son los segundos más eficientes y se utilizan normalmente porque la mayoría de los anticuerpos monoclonales son titulados IgG de cada anticuerpo para un uso óptimo en una densidad celular de 10 a la séptima células por mililitro, que se determina empíricamente. La mayoría de los anticuerpos se utilizan en el rango de 0,1 a 10 microgramos por mililitro. Para la depleción de las células T esplénicas, utilizamos un anticuerpo monoclonal específico para TH one.

Para comenzar la depleción del complemento, diluya las células en un medio de cultivo celular que contenga un 5% de suero de ternero fetal inactivado por calor, de modo que la población celular inicial sea dos veces 10 a la séptima células por mililitro. Por ejemplo, cinco veces 10 a la séptima celdas deben diluirse en 2,5 mililitros de medio. Este volumen de células es la mitad del volumen final y, por lo tanto, el doble de la concentración de células utilizada durante el agotamiento, que será de una vez 10 a las siete células por mililitro.

En este momento, guarde hasta una vez 10 a las seis celdas para que el agotamiento se pueda cuantificar al final del experimento. Además, descongele la cantidad requerida de complemento a temperatura ambiente. Hemos encontrado que una dilución de uno a 15 es apropiada cuando se usa el complemento de conejo pereze biologicals para cinco veces 10 a las siete células, 1,5 mililitros de Eloqua congelado es suficiente.

Ahora agregue la cantidad adecuada de anticuerpo a la suspensión celular y mezcle. Para esterilizar el complemento, utilice un filtro de punta de jeringa de baja unión a proteínas. Llene la jeringa con uno o dos mililitros de medio.

Antes de añadir el complemento por cinco veces 10 a las siete células, necesitaremos 340 mililitros de complemento para una dilución de uno a 15. A continuación, filtre el complemento directamente en el tubo que contiene las células y el anticuerpo. Ahora ajuste el volumen final en el tubo para que las células estén en una concentración de una por 10 a la séptima células por mililitro.

A continuación, deje que las células se incuben a 37 grados centígrados en un baño de agua durante una hora. Recuerde mezclar las celdas cada 15 minutos mediante una inversión suave. Después de la incubación, centrifugar las células a una velocidad que no afecte la viabilidad.

Luego, de vuelta en el capó, deseche el sobrenadante. A continuación, lave las células dos veces con 10 mililitros de medio. Observe cómo se acumulan los restos de las celdas y algunos se adhieren a los lados de los tubos de poliestireno.

Después del último lavado, filtre las células a través de un drenador de células de nailon estéril de 70 micras. Por último, comprueba la pureza de la célula. Comparando la población celular de interés antes y después del flujo de agotamiento.

La citometría y la inmunohistoquímica son los métodos preferidos para determinar la pureza celular antes de la experimentación. Cuando se usa un anticuerpo monoclonal que es altamente eficiente en la activación del complemento, la primera ronda de depleción del complemento agotará las células en más del 95%Como ejemplo, utilizando la citometría de flujo para medir el porcentaje de células T alfa beta en una preparación de células de ple citos de ratón, descubrimos que contenían un 32,2% de células T alfa beta después de la depleción del complemento con anti cinco uno, que es expresado por todos los linfocitos T, pero no por otros leucocitos. La población beta de TCR se redujo en un 95% a una concentración final de 1,56%.

Acabo de mostrarles un método rápido y eficaz para agotar poblaciones celulares específicas utilizando anticuerpos específicos de antígeno en la depleción del complemento. Al realizar este procedimiento, recuerde probar la efectividad de cada anticuerpo y ajustar su complemento en un experimento piloto antes de comenzar. Eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.