Aislamiento de células de ratón cavidad peritoneal
28 de enero de 2010
La cavidad peritoneal de los mamíferos contiene diferentes poblaciones de células inmunes crucial para la respuesta inmune innata. Un método eficaz aislamiento es necesario para los análisis bioquímicos y funcionales de estas células. Aquí le ofrecemos un método integral para el aislamiento de las células en la cavidad peritoneal del ratón.
El aislamiento de células de la cavidad peritoneal comienza con la colocación de un ratón eutanasiado sobre su espalda. Se corta la piel externa del peritoneo y se tira suavemente hacia atrás para exponer la piel interna. Se inyecta PBS con 3% de FBS en la cavidad peritoneal, y se masajea suavemente el peritoneo. El líquido que contiene las células peritoneales se recoge y coloca en un tubo de 15 mililitros sobre hielo.
Las células se lavan una vez y se cuentan en un hemocitómetro. Hola, soy Oji del laboratorio del Dr. Bon en el Instituto de Investigación de la Sangre del Centro de la Sangre de Wisconsin. Hoy les mostraremos un procedimiento para aislar células de la cavidad peritoneal de un ratón.
Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para obtener células destinadas a diversos ensayos fenotípicos, bioquímicos e inmunológicos. Principalmente, estamos interesados en las poblaciones de linfocitos B peritoneales. Así que comencemos.
Antes de comenzar a aislar células inmunitarias de la cavidad peritoneal, prepare todos los materiales necesarios. Comience reuniendo un cubo de hielo, una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 27, una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 25, un bloque de poliestireno, y alfileres para sujetar al ratón. Una bandeja para sostener el bloque de sujeción, tijeras, pinzas y tubos de recolección antes de la disección.
Enfríe previamente PBS que contenga 3% de suero de ternero. Mantenga estos y los tubos de recolección sobre hielo durante todo el experimento tras la administración del anestésico y la eutanasia adecuada; rocíe al ratón con etanol al 70% y colóquelo sobre su espalda encima de un bloque de poliestireno o una almohadilla de disección. Utilizando pinzas y tijeras, corte la piel externa del peritoneo.
Retire suavemente la piel hacia atrás para exponer la capa interna que recubre la cavidad peritoneal. Teniendo cuidado de no perforar ningún órgano, inserte lentamente una aguja de calibre 27 en el peritoneo. Inyecte cinco mililitros de PBS frío con hielo en la cavidad peritoneal.
Ahora masajee suavemente el peritoneo para favorecer la disociación de las células de la pared peritoneal y su caída en la solución de PBS. A continuación, coloque una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 25 con el bisel hacia arriba en este punto e introduzca la aguja en el peritoneo. Recoja tanto líquido como sea posible para aumentar el rendimiento celular.
Mientras realiza esto, mueva suavemente la punta para evitar que el tejido adiposo u otros órganos obstruyan la aguja. Retire la aguja y vacíe la suspensión celular en tubos de recolección de polipropileno. Recoja el líquido restante de la cavidad realizando una incisión en la piel interna del peritoneo.
Utilice pinzas para mantener la piel separada mientras usa una pipeta plástica posterior para recoger cualquier líquido restante. Finalmente, centrifugue la suspensión celular durante ocho minutos a 1500 RPM, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en cinco mililitros de PBS. Recuento de las células en un hemocitómetro.
El uso del ensayo de exclusión con azul de tripan permitirá la determinación del número de células. Típicamente, se pueden aislar entre cinco y diez millones de células de la cavidad peritoneal de un ratón no manipulado. El 50 a 60 % de la población total de células serán células B.
Aproximadamente el 40 % serán macrófagos y granulocitos, y entre el 5 y el 10 % serán células T. Acabamos de mostrarle cómo aislar células de la cavidad peritoneal de un ratón. Al utilizar este procedimiento, es importante limitar la cantidad de sangre en la población de células de la cavidad peritoneal mediante la eutanasia cuidadosa de los ratones y sin perforar ningún órgano dentro de la cavidad peritoneal.
Asegúrese de desechar cualquier muestra que se contamine con sangre. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
Descripción general
Este artículo presenta un método detallado para aislar células de la cavidad peritoneal de ratones, lo cual es esencial para estudiar las respuestas inmunitarias. El procedimiento está diseñado para garantizar la integridad de las poblaciones celulares para análisis posteriores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología celular
- Bioquímica
Antecedentes
- La cavidad peritoneal alberga diversos tipos de células inmunitarias.
- Estas células desempeñan un papel fundamental en las respuestas inmunitarias innatas.
- Los métodos de aislamiento son cruciales para estudios funcionales y bioquímicos.
- Comprender estas células puede contribuir a la investigación inmunológica.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para aislar células de la cavidad peritoneal.
- Facilitar el estudio de poblaciones de células inmunitarias en ratones.
- Mejorar la precisión de los ensayos inmunológicos posteriores.
Métodos Utilizados
- Sacrificar al ratón y prepararlo para la disección.
- Inyectar PBS con 3% de FBS en la cavidad peritoneal.
- Recoger el líquido que contiene las células peritoneales.
- Centrifugar y contar las células aisladas.
Resultados principales
- Se aislaron con éxito entre 5 y 10 millones de células de la cavidad peritoneal.
- Se identificó que entre el 50 y el 60 % de las células son linfocitos B.
- Aproximadamente el 40 % son macrófagos y granulocitos.
- Entre el 5 y el 10 % de las células son linfocitos T.
Conclusiones
- El método es efectivo para aislar células inmunitarias de la cavidad peritoneal.
- La eutanasia y la disección cuidadosas son cruciales para evitar la contaminación con sangre.
- Este procedimiento puede aplicarse a diversos estudios inmunológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de células inmunitarias de la cavidad peritoneal permite la validación temprana de objetivos al proporcionar acceso a subpoblaciones fenotípicamente definidas de linfocitos B y macrófagos. Esto apoya la reducción mecanicista de riesgos en las líneas de descubrimiento al suministrar entradas reproducibles de células primarias para ensayos funcionales. El método mejora la confianza predictiva en la identificación de compuestos activos mediante la recuperación estandarizada de poblaciones inmunitarias relevantes para el cribado de fármacos inmunomoduladores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite el estudio de los subconjuntos de células B1a y B1b para la comprobación de hipótesis terapéuticas en modelos de autoinmunidad e infección.
- Valor científico: Proporciona macrófagos tisulares vírgenes para aclarar vías en estudios de respuesta inmune innata.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante el aislamiento consistente de poblaciones de células inmunitarias para cribado de interacción con el blanco.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para el análisis fenotípico mediante citometría de flujo y ensayos bioquímicos.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad de los ensayos mediante un rendimiento celular controlado (5–10 millones de células por ratón).
- Valor operativo: Permite una evaluación confiable de compuestos mediante la recuperación cuantitativa de linfocitos B (50–60%), macrófagos (40%) y linfocitos T (5–10%).
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización de sistemas relevantes para enfermedades mediante el aislamiento de células B1 autorreactivas y subpoblaciones reguladoras productoras de IL-10.
- Valor operativo: Facilita la alineación traslacional de biomarcadores mediante el aislamiento de células B1 que secretan IgM natural.
- Valor operativo: Permite la continuidad preclínica al proporcionar células inmunitarias primarias para el seguimiento mecanicista en modelos de enfermedad.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar células inmunitarias primarias para la validación de dianas, el desarrollo de ensayos y estudios mecanicistas preclínicos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante el aislamiento de subpoblaciones definidas de linfocitos B y macrófagos.
- Selección: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante el aislamiento estandarizado y la recuperación de poblaciones inmunitarias viables.
- Análisis: Permite la comparación cuantitativa de subpoblaciones celulares utilizando recuentos con hemocitómetro y métodos de exclusión de viabilidad.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica mediante el aislamiento de células B1 asociadas a la inmunidad natural y su regulación.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para el abastecimiento de células inmunitarias en programas de descubrimiento en inmunología y oncología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante el acceso a subpoblaciones inmunitarias caracterizadas fenotípicamente.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante el rendimiento celular definido y la distribución de subpoblaciones.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de continuar o descartar proyectos al reducir la ambigüedad mecanicista en el cribado de inmunomoduladores.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo mediante entradas confiables de células primarias para paneles de ensayos funcionales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección de ratones y técnica aséptica para prevenir la perforación de órganos y la contaminación con sangre.
- Depende de instrumentos como jeringas, agujas, centrífuga y hemocitómetro para el procesamiento y conteo celular.
- Necesita una estandarización entre equipos en la preparación de PBS/FBS y el manejo de la cadena de frío para garantizar la consistencia.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicarse en modelos de enfermedad que alteran la celularidad de la cavidad peritoneal.
- Limitado por la necesidad de una eutanasia y disección cuidadosas para evitar la contaminación con sangre, lo cual compromete la integridad de la muestra.
