Name: Aislamiento de células de ratón cavidad peritoneal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-28T16:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Aprende a aislar células de la cavidad peritoneal en ratones para estudios inmunológicos. Este método permite obtener poblaciones de células B, macrófagos y linfocitos T con alta pureza para análisis funcionales.

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Este trabajo fue apoyado en parte por subvención NIH AI069358 y la Fundación de Investigación BloodCenter.

<ol><li> Antes de iniciar el proceso, los siguientes elementos deben ser recogidos y preparados: <ul><li> Hielo </li><li> Jeringa de 5 ml con aguja 27G </li><li> Jeringa de 5 ml con aguja 25G </li><li> Espuma de poliestireno de bloque y los pernos para el montaje del ratón </li><li> Bandeja en la que se puede colocar el bloque de montaje </li><li> Tijeras y pinzas </li><li> Tubos de recogida de </li><li> 70% de etanol </li><li> PBS con 3% de suero fetal bovino (FCS) (Pre frío y se mantuvo en hielo) </li></ul></li><li> Practicar la eutanasia con el ratón, lo rocía con un 70% de etanol y montarla en el bloque de espuma de poliestireno en la espalda. </li><li> Utilizando unas tijeras y pinzas de cortar la piel exterior del peritoneo y tire de él hacia atrás para exponer la piel interna que recubre la cavidad peritoneal. </li><li> Inyectar 5 ml de PBS enfriado con hielo (con 3% de FCS) en la cavidad peritoneal usando una aguja 27G. Empuje la aguja lentamente en el peritoneo con cuidado de no perforar ningún órgano. </li><li> Después de la inyección, masajear suavemente el peritoneo para desalojar las células adjunto en la solución de PBS. </li><li> Inserte una aguja de 25 g, el bisel hacia arriba, unida a una jeringa de 5 ml en el peritoneo y recoger el líquido mientras se mueve la punta de la aguja con cuidado para evitar la obstrucción por el tejido adiposo u otros órganos. Recoger la mayor cantidad de líquido posible y depósito de la suspensión celular en tubos se mantuvieron en hielo después de retirar la aguja de la jeringa. Opcional: Repita los pasos 4-6 </li><li> Hacer una incisión en la piel interior del peritoneo y mientras mantiene la piel con una pinza de utilizar una pipeta de plástico Pasteur para recoger el líquido residual de la cavidad. </li><li> Si en el paso 6 o 7 contaminación de la sangre visible se detecta la muestra contaminada debe ser descartada. </li><li> Haga girar la suspensión de células recogidas a 1500 rpm durante 8 minutos, descartar el sobrenadante y resuspender las células en los medios de comunicación que desee o PBS para el conteo. </li></ol> Protocolo alternativo para obtener tioglicolato suscitó macrófagos: Este método se utiliza para obtener un mayor rendimiento de los macrófagos. <ol><li> Inyectar 5 ml de 3% (w / v) Brewer tioglicolato medio (7) en la cavidad peritoneal de los ratones. </li><li> Esperar durante 3-5 días, y vaya al paso 1 anterior para la recogida de las células. </li></ol> En comparación con el enfoque nonelicited, aproximadamente 10 veces más macrófagos pueden ser recogidos. La única preocupación es que los macrófagos obtenidos por este procedimiento difieren en algunas de sus propiedades fisiológicas. Los resultados representativos: De un ratón sin manipular, 5-10 millones de células de la cavidad peritoneal se puede obtener con un protocolo de un buen aislamiento. Entre todas las células vivas, el 50-60% son células B, los macrófagos ~ 30% y el 10.5% son células T (Fig. 1). <img src="/files/ftp_upload/1488/1488fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fenotipo de células aisladas de la cavidad peritoneal. Después de aislamiento de las células de la cavidad peritoneal se tiñeron con anti-ratón TCRβ-FITC, B220-PE-Texas rojo, CD11b-azul del Pacífico, CD23-PE-Cy7 y CD5 APC. Parcelas representativas de citometría de flujo muestran los porcentajes de células B y T (a), los macrófagos (b), B1 y B2 células (c) y las células B1a y B1b (d).

<ol><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , (2008).</li>
<li>Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+of+natural+immunoglobulin+M+in+immediate+defense+against+systemic+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection.</a> J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).</li>
<li>Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+clearance+by+anti-phosphocholine+antibodies+as+a+mechanism+of+protection+in+experimental+pneumococcal+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia.</a> J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).</li>
<li>Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B1+B+lymphocytes+play+a+critical+role+in+host+protection+against+lymphatic+filarial+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites.</a> J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).</li>
<li>Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+peritoneum+contains+a+large+population+of+Ly-1%2B+%28CD5%29+B+cells+that+recognize+phosphatidyl+choline%3A+relationship+to+cells+that+secrete+hemolytic+antibody+specific+for+autologous+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes.</a> J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).</li>
<li>O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly-1+B+%28B-1%29+cells+are+the+main+source+of+B+cell+derived+interleukin+10%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10.</a> Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).</li>
<li>Hoover, D. L., Nacy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+to+kill+Leishmania+tropica%3A+Defective+intracellular+killing+of+amastigotes+by+macrophages+elicited+with+sterile+inflammatory+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents.</a> J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).</li>
<li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).</li>
<li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+colony-stimulating+factor%2C+CSF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).</li>
<li>Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+B-1+and+B-2+cells+in+immune+protection+from+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).</li>
<li>Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+and+B-2+cell-derived+immunoglobulin+M+antibodies+are+nonredundant+components+of+the+protective+response+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).</li>
<li>Berland, R., Wortis, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+functions+of+B-1+cells+with+notes+on+the+role+of+CD5%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).</li>
</ol>

El aislamiento de células cavidad peritoneal es una técnica importante para el estudio de diferentes células del sistema inmune, los macrófagos y sobre todo específicos subconjuntos de células B. Aunque este es un proceso sencillo, hay algunos pasos críticos implicados. Presencia de contaminación de la sangre en la muestra recogida se debe evitar para obtener una población pura de células peritoneal cavidad. La eutanasia por dislocación cervical debe hacerse con cuidado para evitar la contaminación de la sangre en la cavidad peritoneal. Por otra parte CO 2 puede ser utilizado. Además, durante el procedimiento adecuado cuidado se debe tomar para evitar perforar la vejiga o de otros órganos en la cavidad peritoneal. La recuperación de la mayoría de los fluido que se inyecta es también importante para el rendimiento celular. Este procedimiento es ampliamente usado para estudiar la biología de los macrófagos ya que un número moderado de residentes, los macrófagos estimulados se puede obtener fácilmente de la cavidad peritoneal, en contraste con la laboriosa tarea de diferenciación de las células mieloides progenitoras en macrófagos maduros in vitro, utilizando el factor estimulante de colonias de macrófagos (8 , 9). El rendimiento de los macrófagos de la cavidad peritoneal puede ser mejorada mediante el método de obtención de tioglicolato, aunque el uso de tioglicolato podría alterar las propiedades fisiológicas de los macrófagos (7). Las células B son una parte importante de nuestro sistema inmunológico juega un papel crucial en la inmunidad innata y adaptativa. Entre las diferentes subpoblaciones de células B, células B1 constituyen un subconjunto único de las células B participan en la inmunidad innata, la autoinmunidad y la regulación inmune. Las células B1 se ubican principalmente en la cavidad peritoneal y la reposición de uno mismo. Se trata de uno de los principales productores de IgM naturales que proporciona la primera línea de protección contra una serie de virus y bacterias (10-12). Las células B1 son también una fuente importante de IL-10 (6), que es una citocina importante implicado en la regulación inmune. Aunque varios estudios han llevado a cabo con las células B1, todavía hay margen para una mayor evaluación de sus funciones, en contraste, en especial su papel regulador. Celular cavidad peritoneal método de aislamiento ofrece la oportunidad única de estudiar las funciones de las células B1.

<table><tbody><tr><td>Medio tioglicolato, modificado por Brewer</td><td>BD Biosciences</td><td>211716</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células de ratón cavidad peritoneal

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

La cavidad peritoneal es una cavidad abdominal a la membrana y lleno de líquido de los mamíferos, que contiene el hígado, el bazo, la mayor parte del tracto gastro-intestinal y otras vísceras. Alberga un número de células inmunes como los macrófagos, células B y células T. La presencia de un gran número de macrófagos ingenuo en la cavidad peritoneal lo convierte en un lugar preferido para la recogida de los macrófagos tisulares residentes ingenua (1). La cavidad peritoneal es también importante para el estudio de las células B debido a la presencia de una única cavidad peritoneal residentes subconjunto de células B, conocidas como células B1, además de las células B2 convencionales. Las células B1 están divididas en las células B1a y B1b, que se distingue por la expresión superficial de CD11b y CD5. Las células B1 son una fuente importante de IgM natural que proporciona la protección temprana de una variedad de agentes patógenos (2-4). Estas células son autorreactivos en la naturaleza (5), pero la forma en que se controlan para evitar la autoinmunidad todavía no se entiende completamente. Por el contrario, CD5<sup&gt; +</sup&gt; Células B1a poseen algunas propiedades reguladoras en virtud de su IL-10 capacidad de producción (6). Por lo tanto, las células peritoneales B1 cavidad son una población de células interesante de estudiar debido a su función diversa y muchas preguntas sin resolver relacionados con su desarrollo y regulación. El aislamiento de la cavidad peritoneal células inmunes residentes es difícil debido a la falta de una estructura definida dentro de la cavidad peritoneal. El protocolo se describe un procedimiento para la obtención de células viables inmune a la cavidad peritoneal de los ratones, los cuales pueden ser utilizados para el análisis fenotípico por citometría de flujo y de diferentes ensayos bioquímicos e inmunológicos.

La cavidad peritoneal de los mamíferos contiene diferentes poblaciones de células inmunes crucial para la respuesta inmune innata. Un método eficaz aislamiento es necesario para los análisis bioquímicos y funcionales de estas células. Aquí le ofrecemos un método integral para el aislamiento de las células en la cavidad peritoneal del ratón.

Aislamiento de células de ratón cavidad peritoneal

La cavidad peritoneal es una cavidad abdominal de los mamíferos, delimitada por membranas y llena de líquido, que contiene el hígado, el bazo y la mayor parte del tracto gastrointestinal...

El aislamiento de células de la cavidad peritoneal comienza con la colocación de un ratón eutanasiado sobre su espalda. Se corta la piel externa del peritoneo y se tira suavemente hacia atrás para exponer la piel interna. Se inyecta PBS con 3% de FBS en la cavidad peritoneal, y se masajea suavemente el peritoneo. El líquido que contiene las células peritoneales se recoge y coloca en un tubo de 15 mililitros sobre hielo.Las células se lavan una vez y se cuentan en un hemocitómetro. Hola, soy Oji del laboratorio del Dr. Bon en el Instituto de Investigación de la Sangre del Centro de la Sangre de Wisconsin. Hoy les mostraremos un procedimiento para aislar células de la cavidad peritoneal de un ratón.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para obtener células destinadas a diversos ensayos fenotípicos, bioquímicos e inmunológicos. Principalmente, estamos interesados en las poblaciones de linfocitos B peritoneales. Así que comencemos.Antes de comenzar a aislar células inmunitarias de la cavidad peritoneal, prepare todos los materiales necesarios. Comience reuniendo un cubo de hielo, una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 27, una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 25, un bloque de poliestireno, y alfileres para sujetar al ratón. Una bandeja para sostener el bloque de sujeción, tijeras, pinzas y tubos de recolección antes de la disección.Enfríe previamente PBS que contenga 3% de suero de ternero. Mantenga estos y los tubos de recolección sobre hielo durante todo el experimento tras la administración del anestésico y la eutanasia adecuada; rocíe al ratón con etanol al 70% y colóquelo sobre su espalda encima de un bloque de poliestireno o una almohadilla de disección. Utilizando pinzas y tijeras, corte la piel externa del peritoneo.Retire suavemente la piel hacia atrás para exponer la capa interna que recubre la cavidad peritoneal. Teniendo cuidado de no perforar ningún órgano, inserte lentamente una aguja de calibre 27 en el peritoneo. Inyecte cinco mililitros de PBS frío con hielo en la cavidad peritoneal.Ahora masajee suavemente el peritoneo para favorecer la disociación de las células de la pared peritoneal y su caída en la solución de PBS. A continuación, coloque una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 25 con el bisel hacia arriba en este punto e introduzca la aguja en el peritoneo. Recoja tanto líquido como sea posible para aumentar el rendimiento celular.Mientras realiza esto, mueva suavemente la punta para evitar que el tejido adiposo u otros órganos obstruyan la aguja. Retire la aguja y vacíe la suspensión celular en tubos de recolección de polipropileno. Recoja el líquido restante de la cavidad realizando una incisión en la piel interna del peritoneo.Utilice pinzas para mantener la piel separada mientras usa una pipeta plástica posterior para recoger cualquier líquido restante. Finalmente, centrifugue la suspensión celular durante ocho minutos a 1500 RPM, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en cinco mililitros de PBS. Recuento de las células en un hemocitómetro.El uso del ensayo de exclusión con azul de tripan permitirá la determinación del número de células. Típicamente, se pueden aislar entre cinco y diez millones de células de la cavidad peritoneal de un ratón no manipulado. El 50 a 60 % de la población total de células serán células B.Aproximadamente el 40 % serán macrófagos y granulocitos, y entre el 5 y el 10 % serán células T. Acabamos de mostrarle cómo aislar células de la cavidad peritoneal de un ratón. Al utilizar este procedimiento, es importante limitar la cantidad de sangre en la población de células de la cavidad peritoneal mediante la eutanasia cuidadosa de los ratones y sin perforar ningún órgano dentro de la cavidad peritoneal.Asegúrese de desechar cualquier muestra que se contamine con sangre. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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