Name: Preparación Extienda los cromosomas de las células estaminales embrionarias para cariotipo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprende a preparar extensiones cromosómicas de células madre embrionarias humanas para cariotipo. Este método permite detectar alteraciones genéticas durante el cultivo celular y garantizar la integridad genética.

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EQUIPO <ul><li> De cultivo de tejidos incubadora a 37 º C, 5% de CO 2 </li><li> Centrífugo </li><li> Juego de micropipetas (100, 100μL) </li><li> Baño de agua 37 ° C </li><li> Baño de agua a 90 ° C para ser fuente de vapor de agua </li><li> Microscopio de contraste de fase </li></ul> PRIMER PASO Tratar las células con colcemid En este procedimiento se utilizó la línea de células madre cultivadas H9 en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) inactivados con mitomicina C (Sigma) y se mantuvieron en DMEM/F12 (Invitrogen), complementado con el reemplazo de octavos de final 20% de suero (KSR, Gibco) y de 8ng/mL factor de crecimiento fibroblástico (FGF-2, R &amp; D). Con el fin de obtener un gran número de los diferenciales de metafases, se recomienda el uso de cultivos con alto índice mitótico en el que hay muchas células que se dividen. <ol><li> Tome el frasco de cultivo de la incubadora y, en el flujo laminar, añadir Colcemid a una concentración final de 0,1 mg / ml. </li><li> Volver el frasco a la incubadora y esperar 3 horas para que el inhibidor puede causar un paro mitótico en metafase, cuando los cromosomas están bien condensada y se pueden visualizar fácilmente bajo el microscopio. </li></ol> La fijación de las células <ol start="3"><li> Saque el medio y agregar tripsina / EDTA 0,05% suficiente para cubrir la superficie de las células. Permitir que las células se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego inactivar la enzima, ya sea por la adición de medio de cultivo que contiene suero o con sólo añadir suero de las células. NOTA: Es importante asegurarse de que una única suspensión de células se realiza para obtener una buena propaga metafase. </li><li> Transferencia de las células a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar a 122 g durante 5 minutos. </li><li> Descartar el sobrenadante, dejando alrededor de 200 ml, y resuspender el precipitado suavemente tocando el tubo, como se muestra en el video. Asegúrese de que las células están bien disociado, por lo que no se puede visualizar cualquier grupo en la solución. </li><li> A continuación, tendrá que añadir 5 ml de solución hipotónica (KCl 75 mm) pre-calentado a 37 ° C, lentamente, por la pared del tubo como en la siguiente descripción. Primero se debe agregar 3 ml, invertir el tubo a una posición horizontal justo para mezclar las células con la solución hipotónica a continuación, añadir el resto de 2 ml y mantener caliente a 37 ° C durante 15 minutos. NOTA: En este punto la solución hipotónica se producirá un aumento en el volumen celular y ayudan a desenredar los cromosomas. El tiempo de incubación es importante para adquirir una buena extiende cromosoma. Si el tiempo es demasiado tiempo, la membrana celular puede explotar muy pronto y los cromosomas se han perdido. Si es demasiado corto, puede ser difícil de obtener porque se extiende el cromosoma de la membrana celular no puede alterar. </li><li> Añadir 3 gotas de la solución fijadora (metanol / ácido acético glacial 3:1), invertir el tubo suavemente para mezclar la solución de fijación con las células y se centrifuga a 122 g durante 5 minutos sin interrupción. NOTA: La solución de fijación debe estar recién hecho. NOTA: Es importante la utilización de la centrifugación sin descanso para evitar el desgaste células, evitando la pérdida del material. </li><li> Descartar el sobrenadante, dejando alrededor de 200 ml, y resuspender el precipitado suavemente tocando el fondo del tubo. NOTA: Una vez más, asegúrese de que las células están bien disociado, por lo que no se puede visualizar cualquier grupo en la solución. </li><li> Añadir los primeros 3 ml de solución fijadora, lentamente por la pared del tubo, mientras se gira el tubo. Invierta el tubo a una posición horizontal justo para mezclar las células, y luego añadir más 2 ml de la solución de fijación a la pared del tubo para tomar las células hacia abajo. De archivo a 4 ° C durante la noche. NOTA: Las células fijadas se pueden almacenar en la solución fijadora durante meses a 4 ° C. Además de proteger las células en su estado hinchado, la solución fijadora elimina los lípidos y las proteínas se desnaturaliza. Estos hechos hacen que la frágil membrana de la célula y, en consecuencia, que el cromosoma propaga fácilmente. </li></ol> LIMPIEZA DE LA portaobjetos de vidrio Antes de iniciar la toma se extiende a su cromosoma asegurarse de que las diapositivas se limpian correctamente o es posible que pierda algunos núcleos y también metafases. Este paso es también importante si quieres probar alguna técnica de hibridación 9. <ol><li> Coloque los portaobjetos en un vaso que contiene HCl 6M durante al menos 3 horas a temperatura ambiente. </li><li> Después de este tiempo, lavar los portaobjetos con agua corriente durante 10 minutos. </li><li> Enjuague los portaobjetos en agua destilada y dejar que se sequen a temperatura ambiente. </li><li> Ahora las diapositivas se pueden almacenar en 96% de etanol y se seca con un paño inmediatamente antes del uso. </li></ol> NOTA: Para los métodos de hibridación in situ, las diapositivas no se pueden almacenar durante más de 2 días en etanol al 96% SEGUNDO PASO Lavado de las células <ol start="10"><li> Al día siguiente, centrifugar las células a 122 g durante 5 minutos sin interrupción. </li><li> Discard el sobrenadante dejando alrededor de 200 ml. Resuspender el precipitado agitando suavemente el tubo a continuación, añadir 5 ml de solución fijadora fresca (metanol / ácido acético glacial 3:1), lentamente por la pared del tubo mientras se gira el tubo. Repita este paso de lavado dos veces más para un total de tres lavados. NOTA: La solución de fijación debe estar recién hecho. </li></ol> Preparación de las diapositivas <ol start="12"><li> En la última etapa de centrifugación dejar una cantidad suficiente de solución para homogeneizar el sedimento celular y obtener una densidad adecuada de las células en las diapositivas (ver figura 1). </li><li> Añadir 20-30 l de suspensión de células en un portaobjetos limpio y seco, moviendo la pipeta muy cerca y en paralelo a la superficie. Medida que se evapora la solución de fijación, la superficie de deslizamiento se convierte en granulado. </li><li> Inmediatamente, exponer la diapositiva, boca arriba, en el vapor de agua caliente (90 °) durante 30 segundos para hacer que las células explotan. NOTA: En este momento, el metanol se evapora de la solución de fijación, lo que resulta en una mayor concentración de ácido acético, que junto con el agua estimula la difusión de los cromosomas. </li><li> Mira a un microscopio de contraste de fase sólo para comprobar si la concentración, así como la distribución de las células es buena (ver figura 1). </li><li> Ahora las diapositivas están listos para ser utilizados para comprobar el juego de cromosomas mediante enfoques como la citogenética de bandas G (Giemsa), FISH, SKY y CGH. </li></ol> CONSEJOS IMPORTANTES ¿Cómo elegir una metafase adecuados para ser analizados La elección de metafases redondas y aisladas (figura 2D), es posible evitar la consideración de aneuploidías falsa como la ganancia de los cromosomas generados por dos o más se extiende mezclados entre sí o la pérdida de cromosomas generados por un cromosoma en marcha. Por lo tanto, evitar la elección de metafases cerca de los núcleos, ya que algunos cromosomas pueden estar ocultos por ellos (Figura 2A y 2B). Además, busca metafases ronda y estar seguros de que cualquier cromosoma se separa de la metafase (figura 2C). Células alimentadoras y el cariotipo células madre De bandas G y análisis SKY, la presencia de células alimentadoras en la cultura células madre no interferir con los resultados, porque las células de alimentación no están bajo un estado de división (inactivada por la mitomicina C o irradiación) y no será parte de la población de la metafase. Sin embargo, para la aplicación de la técnica de FISH en núcleos en interfase, es preferible separar a la población de células madre a las células de alimentación por la recolección de las colonias manualmente antes de tripsinización para el análisis de FISH. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: ¿Cómo saber la densidad celular apropiada en las diapositivas. Las imágenes de microscopio de contraste de fase en el objetivo de 10x. (A) La densidad celular es muy alta. Las flechas indican la metafase se propaga muy cerca de los núcleos. (B) Una diapositiva con una buena densidad de las células. Los círculos muestran los diferenciales metafases aislado de núcleos o metafases otros. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: ¿Cómo elegir una metafase adecuados para ser analizados. Los cromosomas son teñidos con DAPI y las imágenes obtenidas por un microscopio de fluorescencia en el objetivo de 100x. (A) (B) Evitar metafases cerca de los núcleos (indicado por las flechas) (C) y no metafases ronda que los cromosomas presentan separados (círculo). (D) A la metafase ronda es una metafase bueno para ser analizados. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig2.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 2.

<ol><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).</li>
<li>Draper, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+gain+of+chromosomes+17q+and+12+in+cultured+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).</li>
<li>Maitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+alterations+in+cultured+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).</li>
<li>Mitalipova, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).</li>
<li>Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotype+of+human+ES+cells+during+extended+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Karyotype of human ES cells during extended culture.</a> Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).</li>
<li>Caisander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+integrity+maintained+in+five+human+embryonic+stem+cell+lines+after+prolonged+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture.</a> Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).</li>
<li>Imreh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+conditions+favoring+selection+of+chromosomal+abnormalities+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells.</a> J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).</li>
<li>Robin-Wesselschmidt, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobin-Wesselschmidt%2C+JL+%22Human+Stem+Cell+Manual%22">Human Stem Cell Manual</a>. Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. chwartz , Elsevier's Science & Technology Rights. California. 59-59 (2007).</li>
<li>Rooney, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRooney%2C+DE+%22Human+Cytogenetics%22">Human Cytogenetics</a>. , Third Edition, Oxford University Press. (2001).</li>
<li>Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeslop-Harrison%2C+P+%22Practical+in+situ+hybridization%22">Practical in situ hybridization</a>. Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. 51-51 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La preparación de los diferenciales de los cromosomas es un paso crítico para el éxito de un análisis de la situación genética de las células madre embrionarias mediante técnicas de rutina como el G-bandas, y las técnicas más sofisticadas como el pescado, SKY y CGH. Este procedimiento se puede aplicar a muchos tipos de células, variando el período de incubación colcemid, que depende de la duración del ciclo celular. Para las colonias de células madre embrionarias, que esperar 3 horas, mientr...

<table><tbody><tr><td>Tubo centrífugo de 15 ml</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Colcemid Karyo MAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Isofar</td><td>721</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Isofar</td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Isofar</td><td>208</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>104.931.000</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>Bioslide</td><td>7105-1</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación extienda los cromosomas de las células estaminales embrionarias para cariotipo

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Aunque las células madre embrionarias (células madre) se ha demostrado que presentan un cariotipo diploide estable 1, muchos estudios han reportado que en función de las condiciones de cultivo se convierten propensos a adquirir las anomalías cromosómicas como la suma de la totalidad o partes de los cromosomas. De hecho, durante el cultivo prolongado, alteraciones del cariotipo se observan cuando la disociación enzimática o química se utilizan 2,3,4, mientras que la disección manual de las colonias de pases conserva un cariotipo estable 5. Además, los cambios en el medio ambiente tales como la eliminación de las células de alimentación también parecen poner en peligro la integridad genética de las células madre a 3,6. Una vez que las alteraciones cromosómicas pueden afectar la fisiología celular, la caracterización de la integridad genética de las células madre in vitro células madre es esencial considerar como una herramienta esencial en los estudios de la embriogénesis y la prueba de la droga. Por otra parte, para el futuro con fines terapéuticos cambios cromosómicos son una preocupación real, ya que se asocia frecuentemente a la carcinogénesis. Aquí mostramos un método sencillo y útil para obtener alta calidad se extiende cromosoma para su posterior análisis del cromosoma establecidos por bandas G, FISH, SKY o técnicas de CGH 7,8. Se recomienda comprobar el estado cromosómico de rutina, con intervalos de 5 pasajes a fin de vigilar la aparición de las translocaciones y aneuploidías Priscila Britto y Sartore Rafaela contribuido igualmente a la de papel.

El cariotipo es una técnica sencilla y útil ampliamente utilizado para la detección de alteraciones genéticas. A continuación se describe paso a paso el protocolo para la preparación de los cromosomas propagación de células madre embrionarias humanas para controlar el estado cromosómico de estas células se mantienen en cultivo.

Preparación Extienda los cromosomas de las células estaminales embrionarias para cariotipo

Aunque se ha demostrado que las células madre embrionarias humanas (hESC) presentan un cariotipo diploide estable 1, muchos estudios han informado que, dependiendo del cultivo...

Introducción. Hola. Somos del Instituto de Ciencias Biométricas de la Universidad Federal de Faja en Brasil. En este video prepararemos extensiones cromosómicas de células madre embrionarias humanas para detectar posibles alteraciones cromosómicas milagrosas. Aunque se ha demostrado que las células madre embrionarias humanas presentan un cariotipo estable y normal, varios estudios han reportado que, dependiendo de las condiciones de cultivo, tienden a adquirir anomalías cromosómicas, como la adición de cromosomas completos o de partes de ellos.La caracterización de la integridad genética de HASS in vitro es crucial considerando su importancia esencial en estudios de embriogénesis y pruebas de fármacos. Además, para futuras propuestas terapéuticas, los cambios cromosómicos son una preocupación real, ya que frecuentemente se asocian con la carcinogénesis. Así que comencemos.Trate las células con ate. En este procedimiento, lo utilizamos. La ocho a nueve tiene la línea curada en el F 12 suplementado con 20% de reemplazo de suero sin conteo y 80 a nueve gramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos. Comience retirando el frasco de cultivo del incubador y, bajo una campana de flujo laminar, agregue coit a una concentración final de 0,1 microgramo por mililitro.La adición de Coit al medio induce mitoka, reposo y metafase. Cuando los cromosomas estén bien condensados y puedan visualizarse más fácilmente al microscopio, asegúrese de utilizar técnicas estériles para evitar contaminación. Una vez que haya agregado Coit, guarde el matraz y devuelva las células al incubador.Después del período de incubación, las células aún no están listas para ser fijadas. No es necesario trabajar bajo condiciones estériles. Comience por aspirar el medio y, cuando termine, agregue una tripsina.El DTA es del 0,05 % al frasco. Asegúrese de agregar suficiente triptasa para cubrir la superficie inferior de las células. Tape el frasco y agítelo suavemente para distribuir uniformemente.La tripsina permite que las células incuben durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de los cinco minutos de incubación a temperatura ambiente, las células ya no deberían estar adheridas al fondo del frasco y será necesario inactivar la tripsina agregando medio de corte que contenga suero o añadiendo suero suavemente a las células. Retire cuidadosamente la tapa del frasco y agregue el medio de corte o el suero, permitiendo que el líquido fluya por el fondo del frasco sobre las células.Pipetee la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo varias veces para disociar completamente las células. Transfiéra las células a un tubo cónico de 15 mililitros, pero antes de hacerlo, asegúrese de que las células se hayan disociado bien y de que la suspensión no contenga ningún agregado celular visible. Una vez completada la transferencia, tape el tubo y centrifugue.Doble la suspensión durante cinco minutos. A 800 RPM después de la centrifugación, debería haber una paleta celular en el fondo del tubo. Tenga cuidado de no perturbar la paleta celular.Aspire el sobrenadante utilizando una pipeta P1000 hasta que queden aproximadamente 200 microlitros. Este es un volumen intermedio respecto a Resus. Suspender el precipitado en Resus.Suspenda el paladar. Agite suavemente el tubo con los dedos varias veces. Asegúrese de que las células hayan quedado bien suspendidas comprobando que no queden grumos de células en la solución.En este momento, la solución debería estar turbia. A continuación, debe agregar cinco mililitros de una solución de cloruro de potasio de 75 milimolar precalentada a 37 grados Celsius. La solución hipotónica debe agregarse muy lentamente por debajo del tubo mientras gira el tubo.Después de haber agregado los primeros tres mililitros, tape firmemente el tubo y con cuidado. Homogenice la suspensión celular con una solución hipotónica girando suavemente el tubo en posición horizontal y rotándolo lentamente.Continúe agregando lentamente los dos mililitros restantes de la misma manera que antes. La finalidad de la solución hipotónica es aumentar el volumen celular para permitir que los cromosomas se desenreden. Por lo tanto, este período de incubación es crucial para obtener buenos extendidos cromosómicos. Una vez que se hayan agregado los cinco mililitros completos, tape el tubo e incube las células en un baño de agua a treinta y siete grados Celsius durante 15 minutos.Una vez finalizado el período de incubación de 15 minutos, retire el tubo del baño de agua. En este momento, trabaje bajo campana extractora, ya que los vapores producidos por la solución fijadora son tóxicos. Si no tiene acceso a una campana extractora, asegúrese de trabajar en un área bien ventilada.Retire el tapón del tubo y agregue tres gotas de la solución fijadora. Esta es una relación de tres a uno de metanol y ácido acético y debe prepararse el día de su uso. Tape el tubo firmemente y gírelo suavemente en posición horizontal mientras lo rota lentamente: primero en sentido horario y luego en sentido antihorario.Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 800 RPM sin freno. Es muy importante que el ciclo de centrifugación se detenga lentamente para evitar la pérdida de material causada por la desintegración celular tras la centrifugación. Este estado cardíaco vive en aproximadamente 200.Solo para suspender el paladar, agite suavemente el tubo con los dedos varias veces. Asegúrese de que las células hayan quedado bien suspendidas comprobando que no queden grumos de células. Añada lentamente, por la pared del tubo, la solución fijadora hasta completar tres mililitros, mientras gira el tubo después de haber agregado los primeros tres mililitros.Cierre herméticamente el tubo T y homogenice cuidadosamente la suspensión celular girando suavemente el tubo en posición horizontal y rotándolo lentamente. Asegúrese de realizar al menos una rotación completa. Para maximizar este proceso de mezclado, agregue más.Dos mililitros de la solución fijadora junto a la pared del tubo para sedimentar las células. Almacene la suspensión celular a cuatro grados Celsius durante la noche. Estas células fijadas pueden almacenarse en la solución fijadora a cuatro grados Celsius durante meses.Lave las células al día siguiente centrifugando durante cinco minutos a 800 rpm sin freno. Deseche el sobrenadante y resuspenda en aproximadamente 200 microlitros. Suspenda el precipitado golpeando el tubo con los dedos varias veces.Asegúrese de que las células se hayan asociado adecuadamente y de que la suspensión no contenga ningún agregado celular visible. Añada cinco mililitros de solución fijadora fresca lentamente por la pared del tubo. Tape el tubo y homogenice las células girándolo suavemente en posición horizontal mientras lo rota lentamente.Además de proteger las células, la solución fijadora elimina los lípidos y luego las proteínas, y como resultado, facilita la extensión de los cromosomas. Centrifugue el tubo durante cinco minutos a 800 RRM sin freno. Preparación de los portaobjetos: tras el paso de centrifugación, deje una cantidad suficiente de solución para homogeneizar el paladar celular.Esta cantidad de líquido puede depender del número de células. Agitar suavemente el tubo con los dedos varias veces. Asegurarse de que las células estén bien disociadas comprobando que no haya grumos visibles de células.En este momento, se debe agregar el objetivo, depositando entre 20 y 30 microlitros de la suspensión celular sobre un portaobjetos limpio y seco, moviendo la pipeta paralelamente a esta superficie luminosa. A medida que la solución fijadora se evapora, la superficie luminosa se vuelve inmediatamente granulada. Exponga esta superficie hacia arriba al vapor de agua caliente durante 30 segundos para provocar la hinchazón de las células.Analizando estas preparaciones. Después de preparar estos portaobjetos, analícelos bajo microscopio de contraste de fases utilizando los objetivos de 10 y el peludo para verificar si la densidad celular es adecuada para un análisis posterior. Este portaobjeto es un ejemplo de uno que está demasiado concentrado.Tenga en cuenta que los núcleos celulares están demasiado cerca de las extensiones metafásicas. Si tiene un portaobjetos en el que la densidad celular es demasiado alta, entonces diluya la suspensión celular agregando más solución fijadora. Este portaobjetos muestra la densidad celular deseada.Tenga en cuenta que las extensiones en metafase están bien dispersas y aisladas. Una vez que se ha obtenido un portaobjetos con una densidad celular óptima, no puede teñirse ni analizarse. Evite seleccionar las metafases que están cerca del núcleo, ya que los cromosomas pueden estar ocultos o bloqueados de la vista.Busque metafases que estén redondeadas, pero asegúrese de que ningún cromosoma se haya separado de la metafase. Elija metafases redondeadas y bien aisladas. Como en la siguiente diapositiva, intente evitar informar falsos IES como ganancia de cromosomas generada por dos extensiones adicionales. Mézclelo todo, o la pérdida de cromosomas generada por cromosomas rectos.Esperamos que este video le sea útil en sus futuros experimentos. Si tiene alguna duda, no dude en contactarnos. Disfrute y mucha suerte.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La diferenciación de ESC coincide con los cambios de tipo de células específicas en la estructura y composición de la cromatina. La detección de los cambios proporciona información valiosa sobre los mecanismos que definen stemcellness y la diferenciación celular. Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) representa un método valioso para diseccionar los mecanismos moleculares que subyacen a la diferenciación de células madre.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

El micro-disección técnica de explantes es un método robusto y fiable para el aislamiento de proliferación células del músculo esquelético de los músculos menores, adultas o embrionarias como fuente de células madre de músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células han sido derivadas por clonación para producir músculo esquelético líneas de células madre utilizadas en el trasplante de vivo.

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Cariotipo espectral (SKY) es una técnica de citogenética avanzada para identificar aberraciones genómicas y cromosómicas. Esta técnica se aprovecha de las sondas de pintado cromosómico, lo que permite la clasificación de todos los cromosomas. Sky también puede identificar aberraciones cromosómicas y defectos complejos de segregación en ratones y seres humanos con diversas enfermedades, incluyendo enfermedad renal poliquística.

Cariotipo espectral para el Estudio de anomalías cromosómicas en humanos y ratones con la enfermedad renal poliquística

Los cromosomas se pueden aislar de las células vivas, tales como linfocitos o fibroblastos de la piel, y a partir de organismos, incluyendo seres humanos o ratones. Estas preparaciones cromosómicas se pueden utilizar más de rutina bandeo G y procedimientos citogenéticos moleculares como la hibridación fluorescente in situ (FISH), la hibridación genómica comparada (CGH) y cariotipo espectral (SKY).

Cromosoma Preparación de las células cultivadas

Se necesita ensayo de expresión de un solo gen celular para comprender las heterogeneidades de células madre.

Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

Líneas celulares Reporter ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés por parte de las poblaciones heterogéneas. Sin embargo, gen de la orientación mediante recombinación homóloga convencional en células madre de embriones humanos es extremadamente ineficiente. Aquí se describe la orientación del SNC locus cerebro medio específico Pitx3 factor de transcripción con EGFP usando nucleasa dedo de zinc mejorado recombinación homóloga.

Nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas

Aunque las células poliploides proliferativas son necesarias para analizar la inestabilidad cromosómica de las células poliploides, crear tales células a partir de células humanas no transformadas no es fácil. En el presente informe se describen procedimientos relativamente sencillos para establecer células tetraploides proliferativas libres de una población diploide a partir de fibroblastos humanos normales.

Establecimiento de células tetraploides proliferativa de fibroblastos humanos no transformadas

La meiosis es el proceso de desarrollo por que los gametos se forman a través de una sola ronda de replicación del ADN y dos series sucesivas de segregación cromosómica. Meiosis mamífera pueden examinarse mediante la utilización de una técnica para preparar extensiones de cromosoma meiótico. Aquí, demostramos un método de preparación de superficie de extensión núcleos de espermatocitos de ratón.

Preparación del cromosoma meiótico se extiende desde ratón espermatocitos

Ovogénesis en mamíferos es conocido por ser errores, particularmente debido a protooncogenes del cromosoma. Este manuscrito describe métodos de preparación de cromatina extensión de profase de ratón, metafase I y II etapas ovocitos. Estas técnicas fundamentales permiten el estudio de las proteínas de la cromatina-limite y morfología cromosómicas en mamíferos Oogénesis.

Cromatina difundir preparados para el análisis de progresión de ovocitos de ratón de profase a metafase II

Este protocolo describe el método Capture Hi-C utilizado para caracterizar la organización 3D de regiones genómicas específicas de tamaño megabasado en alta resolución, incluidos los límites de los dominios de asociación topológica (TAD) y las interacciones de cromatina de largo alcance entre los elementos reguladores y otros elementos de secuencia de ADN.

Descifrando la organización de la cromatina 3D de alta resolución a través de Capture Hi-C

Aprende a preparar extensiones cromosómicas de células madre embrionarias humanas para cariotipo. Este método permite detectar alteraciones genéticas durante el cultivo celular y garantizar la integridad genética.

Preparación Extienda los cromosomas de las células estaminales embrionarias para cariotipo

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