Preparación Extienda los cromosomas de las células estaminales embrionarias para cariotipo
4 de septiembre de 2009
El cariotipo es una técnica sencilla y útil ampliamente utilizado para la detección de alteraciones genéticas. A continuación se describe paso a paso el protocolo para la preparación de los cromosomas propagación de células madre embrionarias humanas para controlar el estado cromosómico de estas células se mantienen en cultivo.
Introducción. Hola. Somos del Instituto de Ciencias Biométricas de la Universidad Federal de Faja en Brasil. En este video prepararemos extensiones cromosómicas de células madre embrionarias humanas para detectar posibles alteraciones cromosómicas milagrosas. Aunque se ha demostrado que las células madre embrionarias humanas presentan un cariotipo estable y normal, varios estudios han reportado que, dependiendo de las condiciones de cultivo, tienden a adquirir anomalías cromosómicas, como la adición de cromosomas completos o de partes de ellos.
La caracterización de la integridad genética de HASS in vitro es crucial considerando su importancia esencial en estudios de embriogénesis y pruebas de fármacos. Además, para futuras propuestas terapéuticas, los cambios cromosómicos son una preocupación real, ya que frecuentemente se asocian con la carcinogénesis. Así que comencemos.
Trate las células con ate. En este procedimiento, lo utilizamos. La ocho a nueve tiene la línea curada en el F 12 suplementado con 20% de reemplazo de suero sin conteo y 80 a nueve gramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos. Comience retirando el frasco de cultivo del incubador y, bajo una campana de flujo laminar, agregue coit a una concentración final de 0,1 microgramo por mililitro.
La adición de Coit al medio induce mitoka, reposo y metafase. Cuando los cromosomas estén bien condensados y puedan visualizarse más fácilmente al microscopio, asegúrese de utilizar técnicas estériles para evitar contaminación. Una vez que haya agregado Coit, guarde el matraz y devuelva las células al incubador.
Después del período de incubación, las células aún no están listas para ser fijadas. No es necesario trabajar bajo condiciones estériles. Comience por aspirar el medio y, cuando termine, agregue una tripsina.
El DTA es del 0,05 % al frasco. Asegúrese de agregar suficiente triptasa para cubrir la superficie inferior de las células. Tape el frasco y agítelo suavemente para distribuir uniformemente.
La tripsina permite que las células incuben durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de los cinco minutos de incubación a temperatura ambiente, las células ya no deberían estar adheridas al fondo del frasco y será necesario inactivar la tripsina agregando medio de corte que contenga suero o añadiendo suero suavemente a las células. Retire cuidadosamente la tapa del frasco y agregue el medio de corte o el suero, permitiendo que el líquido fluya por el fondo del frasco sobre las células.
Pipetee la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo varias veces para disociar completamente las células. Transfiéra las células a un tubo cónico de 15 mililitros, pero antes de hacerlo, asegúrese de que las células se hayan disociado bien y de que la suspensión no contenga ningún agregado celular visible. Una vez completada la transferencia, tape el tubo y centrifugue.
Doble la suspensión durante cinco minutos. A 800 RPM después de la centrifugación, debería haber una paleta celular en el fondo del tubo. Tenga cuidado de no perturbar la paleta celular.
Aspire el sobrenadante utilizando una pipeta P1000 hasta que queden aproximadamente 200 microlitros. Este es un volumen intermedio respecto a Resus. Suspender el precipitado en Resus.
Suspenda el paladar. Agite suavemente el tubo con los dedos varias veces. Asegúrese de que las células hayan quedado bien suspendidas comprobando que no queden grumos de células en la solución.
En este momento, la solución debería estar turbia. A continuación, debe agregar cinco mililitros de una solución de cloruro de potasio de 75 milimolar precalentada a 37 grados Celsius. La solución hipotónica debe agregarse muy lentamente por debajo del tubo mientras gira el tubo.
Después de haber agregado los primeros tres mililitros, tape firmemente el tubo y con cuidado. Homogenice la suspensión celular con una solución hipotónica girando suavemente el tubo en posición horizontal y rotándolo lentamente.
Continúe agregando lentamente los dos mililitros restantes de la misma manera que antes. La finalidad de la solución hipotónica es aumentar el volumen celular para permitir que los cromosomas se desenreden. Por lo tanto, este período de incubación es crucial para obtener buenos extendidos cromosómicos. Una vez que se hayan agregado los cinco mililitros completos, tape el tubo e incube las células en un baño de agua a treinta y siete grados Celsius durante 15 minutos.
Una vez finalizado el período de incubación de 15 minutos, retire el tubo del baño de agua. En este momento, trabaje bajo campana extractora, ya que los vapores producidos por la solución fijadora son tóxicos. Si no tiene acceso a una campana extractora, asegúrese de trabajar en un área bien ventilada.
Retire el tapón del tubo y agregue tres gotas de la solución fijadora. Esta es una relación de tres a uno de metanol y ácido acético y debe prepararse el día de su uso. Tape el tubo firmemente y gírelo suavemente en posición horizontal mientras lo rota lentamente: primero en sentido horario y luego en sentido antihorario.
Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 800 RPM sin freno. Es muy importante que el ciclo de centrifugación se detenga lentamente para evitar la pérdida de material causada por la desintegración celular tras la centrifugación. Este estado cardíaco vive en aproximadamente 200.
Solo para suspender el paladar, agite suavemente el tubo con los dedos varias veces. Asegúrese de que las células hayan quedado bien suspendidas comprobando que no queden grumos de células. Añada lentamente, por la pared del tubo, la solución fijadora hasta completar tres mililitros, mientras gira el tubo después de haber agregado los primeros tres mililitros.
Cierre herméticamente el tubo T y homogenice cuidadosamente la suspensión celular girando suavemente el tubo en posición horizontal y rotándolo lentamente. Asegúrese de realizar al menos una rotación completa. Para maximizar este proceso de mezclado, agregue más.
Dos mililitros de la solución fijadora junto a la pared del tubo para sedimentar las células. Almacene la suspensión celular a cuatro grados Celsius durante la noche. Estas células fijadas pueden almacenarse en la solución fijadora a cuatro grados Celsius durante meses.
Lave las células al día siguiente centrifugando durante cinco minutos a 800 rpm sin freno. Deseche el sobrenadante y resuspenda en aproximadamente 200 microlitros. Suspenda el precipitado golpeando el tubo con los dedos varias veces.
Asegúrese de que las células se hayan asociado adecuadamente y de que la suspensión no contenga ningún agregado celular visible. Añada cinco mililitros de solución fijadora fresca lentamente por la pared del tubo. Tape el tubo y homogenice las células girándolo suavemente en posición horizontal mientras lo rota lentamente.
Además de proteger las células, la solución fijadora elimina los lípidos y luego las proteínas, y como resultado, facilita la extensión de los cromosomas. Centrifugue el tubo durante cinco minutos a 800 RRM sin freno. Preparación de los portaobjetos: tras el paso de centrifugación, deje una cantidad suficiente de solución para homogeneizar el paladar celular.
Esta cantidad de líquido puede depender del número de células. Agitar suavemente el tubo con los dedos varias veces. Asegurarse de que las células estén bien disociadas comprobando que no haya grumos visibles de células.
En este momento, se debe agregar el objetivo, depositando entre 20 y 30 microlitros de la suspensión celular sobre un portaobjetos limpio y seco, moviendo la pipeta paralelamente a esta superficie luminosa. A medida que la solución fijadora se evapora, la superficie luminosa se vuelve inmediatamente granulada. Exponga esta superficie hacia arriba al vapor de agua caliente durante 30 segundos para provocar la hinchazón de las células.
Analizando estas preparaciones. Después de preparar estos portaobjetos, analícelos bajo microscopio de contraste de fases utilizando los objetivos de 10 y el peludo para verificar si la densidad celular es adecuada para un análisis posterior. Este portaobjeto es un ejemplo de uno que está demasiado concentrado.
Tenga en cuenta que los núcleos celulares están demasiado cerca de las extensiones metafásicas. Si tiene un portaobjetos en el que la densidad celular es demasiado alta, entonces diluya la suspensión celular agregando más solución fijadora. Este portaobjetos muestra la densidad celular deseada.
Tenga en cuenta que las extensiones en metafase están bien dispersas y aisladas. Una vez que se ha obtenido un portaobjetos con una densidad celular óptima, no puede teñirse ni analizarse. Evite seleccionar las metafases que están cerca del núcleo, ya que los cromosomas pueden estar ocultos o bloqueados de la vista.
Busque metafases que estén redondeadas, pero asegúrese de que ningún cromosoma se haya separado de la metafase. Elija metafases redondeadas y bien aisladas. Como en la siguiente diapositiva, intente evitar informar falsos IES como ganancia de cromosomas generada por dos extensiones adicionales. Mézclelo todo, o la pérdida de cromosomas generada por cromosomas rectos.
Esperamos que este video le sea útil en sus futuros experimentos. Si tiene alguna duda, no dude en contactarnos. Disfrute y mucha suerte.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para preparar extensiones cromosómicas de células madre embrionarias humanas con el fin de monitorear el estado cromosómico. La cariotipificación es esencial para detectar alteraciones genéticas que puedan surgir durante el cultivo celular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Genética
- Biología celular
- Investigación con células madre
Antecedentes
- Las células madre embrionarias humanas pueden presentar anomalías cromosómicas bajo ciertas condiciones de cultivo.
- Mantener la integridad genética es crucial para los estudios de embriogénesis y las pruebas de fármacos.
- Los cambios cromosómicos están asociados con una posible carcinogénesis.
- La caracterización de estas células es vital para futuras aplicaciones terapéuticas.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para la cariotipificación de células madre embrionarias humanas.
- Monitorear la estabilidad cromosómica en células cultivadas.
- Destacar la importancia de la integridad genética en la investigación con células madre.
Métodos Utilizados
- Preparación de extensiones cromosómicas a partir de células madre embrionarias humanas.
- Monitoreo del estado cromosómico mediante cariotipificación.
- Evaluación de alteraciones genéticas en células cultivadas.
- Análisis de posibles anomalías cromosómicas.
Resultados principales
- Demuestra la eficacia del protocolo de cariotipificación.
- Identificación de alteraciones cromosómicas en células madre embrionarias humanas cultivadas.
- Información sobre la estabilidad del cariotipo bajo condiciones variables.
- Implicaciones para el uso de células madre en contextos terapéuticos.
Conclusiones
- La cariotipificación es una herramienta valiosa para monitorear la integridad genética en células madre.
- Comprender la estabilidad cromosómica es esencial para aplicaciones terapéuticas seguras.
- Se necesita más investigación para explorar las implicaciones de las anomalías cromosómicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El monitoreo de la estabilidad cromosómica en células madre embrionarias humanas es fundamental para garantizar modelos preclínicos confiables y reducir la ambigüedad mecanicista en las pruebas de fármacos. El cariotipaje proporciona confianza predictiva al detectar alteraciones genéticas que podrían comprometer la fisiología celular o indicar un riesgo carcinogénico. La evaluación rutinaria apoya la toma de decisiones ajustada al riesgo en el desarrollo de terapias basadas en células madre.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de la integridad genética para validar hipótesis terapéuticas en modelos pluripotentes.
- Valor operativo: Facilita la reducción de riesgos biológicos al identificar alteraciones cariotípicas asociadas a la inestabilidad inducida por el cultivo.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Produce preparaciones cromosómicas de alta calidad para análisis de bandeo G, FISH, SKY o CGH, lo que permite un cribado genético confiable.
- Valor operativo: Estandariza la preparación mediante pasos definidos de tratamiento hipotónico y fijación para garantizar la reproducibilidad entre los diferentes pasajes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la integridad del sistema relevante para la enfermedad mediante el monitoreo del estado cromosómico cada 5 pasajes para detectar translocaciones y aneuploidias.
- Valor operativo: Garantiza la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al preservar la estabilidad genética.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de biología de descubrimiento como un punto de control de calidad para líneas de hESC antes de las aplicaciones posteriores en modelado de enfermedades o cribado de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al confirmar la estabilidad cariotípica antes de iniciar estudios mecanicistas o fenotípicos.
- Selección: Permite la preparación de ensayos al proporcionar poblaciones celulares genéticamente validadas para una evaluación consistente de compuestos.
- Analítica: Genera resultados citogenéticos cuantitativos mediante cariotipado para comparar condiciones de cultivo y efectos del pase.
- Investigación Traducional: Se vincula con la continuidad preclínica al garantizar que la integridad genética se mantenga durante las etapas de expansión y diferenciación.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable de control de calidad genético aplicable a múltiples líneas de células madre embrionarias humanas y proyectos de investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo y decisiones de avance.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, técnica estéril y preparación citogenética.
- Necesita acceso a centrífuga, baño de agua, solución hipotónica (KCl), fijador (metanol:ácido acético) y microscopio de contraste de fase.
- Exige la estandarización de tiempos, volúmenes de reactivos y protocolos de fijación entre usuarios y laboratorios.
- Debe tener en cuenta la variabilidad en la densidad celular y la formación de agregados, que afecta la calidad del extendido.
- Está limitado por la dependencia de la captura óptima de metafases y la preparación de portaobjetos para un análisis preciso.
