El uso del kit de la proteasa detección fluorescente para determinar la actividad de la proteasa
4 de agosto de 2009
El kit de detección fluorescente de la proteasa se ha diseñado para la medición de la actividad de la proteasa con fluorometría. También es adecuado para la detección de trazas de contaminación de la proteasa. El método se basa en la hydroysis proteolítica de una fórmula propia de un sustrato marcado con FITC caseína.
Este protocolo comienza añadiendo tampón de incubación, solución de caseína FXI y la muestra que contiene la proteasa de interés a un tubo pequeño para centrífuga, seguido de una mezcla suave e incubación a 37 grados Celsius durante 60 minutos en la oscuridad. Para detener la reacción proteolítica al final del periodo de incubación, añada la solución de TCA, mezcle suavemente e incube nuevamente a 37 grados Celsius durante 30 minutos, también en la oscuridad. Este paso provocará la precipitación del sustrato no reaccionado.
Centrifugar la muestra durante 10 minutos. A 10.000 G, eliminar el sobrenadante, que contiene los fragmentos marcados solubles en ácido de FXI. Transferir el sobrenadante a una placa de pocillos o múltiples pocillos, diluir con tampón de ensayo y leer la muestra en un fluorímetro.
Hola, soy Carrie Cup Vineyard y soy científica en nuestras instalaciones Sigma Aldridge DeKalb en St. Louis, Missouri. Hoy les mostraré un procedimiento para la determinación de la actividad de proteasa mediante fluorometría. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio de control de calidad para determinar la actividad baja de proteasa.
Así que comencemos. Para este procedimiento, el tampón de incubación, el tampón del ensayo y la solución de ácido tricloroacético 0,6 normal o TCA se proporcionan como soluciones listas para usar. Aliquote la solución de Cain marcada con fite en volúmenes más pequeños y almacénela a menos 20 grados Celsius, asegurándose de protegerla de la luz utilizando viales ámbar o envolviendo los tubos transparentes en papel de aluminio.
Citar el sustrato de fite Cain minimiza la necesidad de ciclos repetidos de congelación y descongelación; ciclos repetidos de congelación y descongelación o agitación vigorosa o mezcla del fite Cain podrían provocar la separación del fite del Cain, lo que resulta en un fondo más alto. Si se calibra el fluorímetro o se determina el rango lineal para la señal de fit e, prepare la solución control de fit. Prepare la solución fresca reconstituyéndola en tampón de ensayo a la concentración adecuada.
Una vez listo, proteja la solución de la luz. Por último, prepare el control de proteasa tripsina añadiendo 100 microlitros de ácido clorhídrico un milimolar al vial de tripsina liofilizada y mezcle brevemente para asegurar que la tripsina se haya disuelto. Almacenar la tripsina en condiciones ácidas aumenta su estabilidad.
Tenga en cuenta que la solución control de tripsina es sensible a la temperatura y no es estable en bajas concentraciones. A continuación, comience a preparar todas las muestras del ensayo, que incluyen muestras de prueba, controles y blancos durante todo el ensayo. Mantenga las muestras protegidas de la luz para cada muestra de prueba.
Combine en un tubo de microcentrífuga 20 microlitros de tampón de incubación, 20 microlitros del sustrato fitc kian y 10 microlitros de la muestra de prueba. Puede utilizarse un tubo de microcentrífuga transparente siempre que la muestra se incube en la oscuridad. Téngase en cuenta también que las muestras de prueba con alta actividad de proteasas necesitarán ser diluidas.
La muestra control de tripsina se utiliza como control positivo para verificar que el ensayo está funcionando correctamente, con el fin de determinar el límite de detección o para crear una curva estándar general. Para preparar el control de tripsina, combine una parte de tripsina acidificada con nueve partes de tampón de incubación o del tampón utilizado para las muestras de prueba, y mezcle bien. La concentración final de trabajo de tripsina es de 20 microgramos por mililitro. Si se utiliza una proteasa específica diferente, prepare la solución control con dicha proteasa específica y un tampón adecuado.
Continúe preparando la muestra control combinando 20 microlitros de tampón de incubación, 20 microlitros de sustrato fz cain y 10 microlitros del control de tripsina en un tubo microcentrífugo. Se recomienda realizar al menos una muestra control con cinco nanogramos de tripsina en cada ensayo o utilizar una dilución seriada. La última muestra es el blanco, preparado combinando 20 microlitros de tampón de incubación, 20 microlitros del sustrato Fitz Caine y 10 microlitros de agua ultrapura en un tubo microcentrífugo.
Con los tres tipos de muestras preparadas, mezcle suavemente cada tubo e incube a 37 grados Celsius en la oscuridad durante 60 minutos. Tenga cuidado de no mezclar con demasiada fuerza, ya que una turbulencia excesiva podría provocar un fondo de fluorescencia elevado y reducir la sensibilidad del ensayo. Se puede incubar hasta 24 horas para aumentar la sensibilidad, pero no se recomiendan incubaciones más largas, ya que la caseína FXI podría comenzar a degradarse.
De nuevo, lo que provoca un fondo de fluorescencia elevado cuando finaliza la incubación, use equipo de protección adecuado para agregar 150 microlitros de la solución de ÁCT a cada tubo de microcentrífuga. Tras la incubación con ÁCT, se debe observar una neblina blanca en el tubo, que corresponde a la mezcla de cain precipitada, no digerida e insoluble; mezcle suavemente e incube a 37 grados Celsius en la oscuridad durante 30 minutos. Al finalizar la incubación con la solución de ÁCT, centrifugue los tubos durante 10 minutos a 10.000 Gs a temperatura ambiente.
El sobrenadante contiene los fragmentos de Cain marcados solubles en ácido utilizados para la medición de fluorescencia; pipetee suavemente desde la parte superior del tubo para que ninguno de los precipitados del sedimento sea aspirado en la punta de la pipeta, ya que esto provocaría una lectura falsa positiva durante la detección fluorescente posterior para medir la actividad de la proteasa utilizando un fluorímetro. Combine 10 microlitros del sobrenadante de TCA con un mililitro del tampón de ensayo en un tubo y mezcle suavemente. Además, diluya el estándar de FE para su análisis agregando 10 microlitros de FE a un mililitro de tampón de ensayo. El control de FE y el estándar de tripsina proporcionan un nivel de fluorescencia que la muestra no debe superar. La solución del sobrenadante de TCA y el tampón de ensayo puede almacenarse en la oscuridad a dos a ocho grados Celsius durante un máximo de 24 horas antes de medir la fluorescencia.
Si se mide utilizando un vete, transfiera un mililitro de la solución a un vete adecuado; si se van a analizar un gran número de muestras, se puede usar una placa de 96 pocillos y un lector de placas fluorescente para obtener datos fluorométricos. En este ensayo, la isotiocianato de fluoresceína se proporciona como control para una posible calibración del instrumento. Aquí se muestra un rango representativo de linealidad de la señal FS e tras seguir el procedimiento descrito.
El uso de este kit con un tiempo de incubación de 30 minutos en el primer paso de incubación produce esta curva estándar típica para muestras de tripsina y control que varían entre 1,5 nanogramos y 25 nanogramos. Las mediciones de fluorescencia se realizaron en una placa de múltiples pocillos. El límite de detección del ensayo es la cantidad de proteasa que produce una lectura de fluorescencia significativa por encima del valor obtenido con la muestra en blanco.
Hoy les hemos mostrado cómo utilizar el kit de determinación de proteasa Sigma Aldridge para detectar la actividad proteásica fluorométrica en una muestra biológica. Aunque este kit está optimizado para su uso, es importante recordar que, para sus proteasas particulares, podría necesitar ligeras modificaciones. Eso es todo.
Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
Resumen
El Kit de Detección Fluorescente de Proteasas permite la medición de la actividad proteásica mediante fluorometría, lo que lo hace adecuado para detectar contaminación traza de proteasas. El método utiliza un sustrato de caseína marcado con FITC de propiedad exclusiva para la hidrólisis proteolítica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Medición de la actividad de proteasas
- Análisis fluorométrico
- Control de calidad en entornos de laboratorio
Antecedentes
- El kit está diseñado para la detección precisa de la actividad de proteasas.
- Es esencial para el control de calidad en diversas aplicaciones biológicas.
- Los métodos fluorométricos ofrecen capacidades de detección sensibles.
- El manejo y almacenamiento adecuados de los reactivos son fundamentales para el rendimiento del ensayo.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para medir la actividad de las proteasas.
- Facilitar la detección de niveles bajos de contaminación por proteasas.
- Garantizar el control de calidad en entornos de laboratorio.
Métodos Utilizados
- Preparación del tampón de incubación y del sustrato de caseína marcado con FITC.
- Incubación de las muestras a 37 grados Celsius en la oscuridad.
- Uso de la solución de ÁCT para detener las reacciones proteolíticas.
- Medición de la fluorescencia mediante un fluorímetro o una placa de 96 pocillos.
Resultados principales
- Medición exitosa de la actividad de proteasas en diversas muestras.
- Establecimiento de una curva patrón para la calibración del ensayo.
- Demostación de la sensibilidad y especificidad del ensayo.
- Validación del método mediante muestras control.
Conclusiones
- El Kit de Detección Fluorescente de Proteasas es efectivo para la evaluación de la actividad proteásica.
- Las condiciones adecuadas del ensayo mejoran la sensibilidad de detección.
- Este método es adecuado para aplicaciones rutinarias de control de calidad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El Kit de Detección Fluorescente de Proteasas permite la medición sensible y cuantitativa de la actividad proteásica mediante una lectura fluorométrica de la escisión de caseína marcada con FITC. Este ensayo apoya la validación temprana de objetivos al proporcionar un método confiable y reproducible para evaluar la función proteolítica en muestras biológicas, facilitando la reducción de riesgos mecanicistas en vías dependientes de proteasas. Su compatibilidad con tubos de microcentrífuga y placas multipozo permite su integración en flujos de trabajo de cribado para la identificación de compuestos iniciales y el desarrollo de ensayos en programas de descubrimiento de fármacos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas dependientes de proteasas mediante la detección cuantitativa del corte del sustrato.
- Valor operativo: Proporciona un formato estandarizado basado en kits que reduce la variabilidad en las mediciones de actividad de proteasas entre experimentos.
- Valor predictivo: Facilita la evaluación de la potencia y selectividad de inhibidores de proteasas mediante la medición de la actividad residual en muestras tratadas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor Científico: Genera datos de respuesta dosis-dependiente para inhibidores de proteasas utilizando una señal de fluorescencia lineal proporcional a la actividad proteolítica.
- Valor Operacional: Compatible con formatos de placas de 96 pocillos, lo que permite el cribado de medio rendimiento de bibliotecas de compuestos o bibliotecas mutantes.
- Preparación del Ensayo: Utiliza controles estables liofilizados y tampones listos para usar, minimizando el tiempo de preparación y asegurando la consistencia de los reactivos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Permite la evaluación de biomarcadores de proteasas en modelos relevantes para la enfermedad mediante la detección de la actividad proteásica endógena en lisados o sobrenadantes.
- Reducción Mecanística de Riesgos: Ayuda a distinguir los efectos proteolíticos sobre el objetivo de aquellos fuera del objetivo durante la optimización del compuesto líder.
- Confianza Predictiva: Permite el monitoreo longitudinal de la modulación de proteasas en estudios preclínicos mediante un punto final cuantitativo y fluorométrico.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, donde las mediciones cuantitativas de la actividad de proteasas informan sobre las relaciones estructura-actividad y el perfil de selectividad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la medición de cambios en la actividad de proteasas tras perturbaciones genéticas o farmacológicas.
- Detección: Permite la evaluación de bibliotecas de compuestos para la inhibición de proteasas utilizando una lectura homogénea basada en fluorescencia.
- Análisis: Genera datos cuantitativos de fluorescencia que pueden normalizarse respecto a controles y utilizarse para calcular valores de IC50 o % de inhibición.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación de biomarcadores mediante la detección de la actividad de proteasas en modelos preclínicos de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: El protocolo estandarizado del kit permite su reutilización en distintos proyectos y equipos que estudian diferentes proteasas o inhibidores.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona información mecanicista sobre la función de las proteasas y el mecanismo de acción de los inhibidores.
- Valor operativo: Ofrece un ensayo robusto y reproducible con sensibilidad definida (detecta ~0,5 µg/mL de tripsina) y tiempos de incubación ajustables para optimización.
- Valor estratégico: Reduce los falsos positivos en cribados al distinguir la actividad proteolítica real de la interferencia del ensayo.
- Impacto en el portafolio: Permite tomar decisiones cuantitativas de continuar o descartar proyectos basadas en perfiles cuantitativos de modulación de proteasas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere formación básica en fluorometría y manejo adecuado de reactivos marcados con FITC sensibles a la luz.
- Depende del acceso a un fluorímetro o lector de placas con capacidad de fluorescencia para la detección del punto final.
- Necesita la estandarización de las condiciones de incubación y parada entre diferentes usuarios para garantizar la reproducibilidad entre experimentos.
- Requiere la dilución de muestras de alta actividad para mantenerse dentro del rango lineal del ensayo.
- Se beneficia del uso de controles específicos de proteasas para validar el desempeño del ensayo en dianas distintas de la tripsina.
