Name: Preparación de combinados lisado plaquetario humano (pHPL) como un suplemento eficaz de los animales libres de suero humano culturas de células madre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-30T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprende a preparar lisado plaquetario humano (pHPL) a partir de plasma rico en plaquetas mediante ciclos de congelación-descongelación y centrifugación. Este método libre de suero animal mejora el crecimiento celular en cultivos de células madre.

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Este trabajo ha sido financiado por el Austrian Research Foundation (FMF, la concesión N211-NAN para DS) y la Agencia de Promoción de la Investigación de Austria (FFG, otorgar N200 para DS). Los autores agradecen Url Claudia por su excelente asistencia técnica y Mónica Farrell para la edición lingüística.

1. Material de partida Comience con plasma rico en plaquetas (PRP) unidades preparadas por citaféresis o derivados de buffy abrigos. 2. Comprobar la esterilidad Para comprobar la esterilidad tomar una muestra de 20 ml de cada unidad de PRP mediante la transferencia del volumen de una bolsa conectada pequeños (Baxter). Desconecte esta bolsa por soldadura. 3. La congelación de las unidades de PRP Inmediatamente después de la preparación, congelación de las unidades de PRP hasta al menos -20 ° C en la bolsa de almacenamiento original, sin manipulación. 4. Descongelación de las unidades de HPL Cuando los ensayos con bacterias son negativos, descongelar humanos unidades lisado de plaquetas, que ahora se llama unidades de HPL a 37 ° C (baño de agua) hasta que la formación de coágulos de hielo desaparecen. No caliente el HPL. 5. Puesta en común de las unidades de HPL Tomar por lo menos diez a quince unidades descongelado HPL para una piscina lisado de plaquetas para preparar un producto estandarizado. Conecte las bolsas de HPL consecutiva a la bolsa de la puesta en común de matrimonio (MacoPharma) y la transferencia de la HPL en estas dos bolsas. Desconecte las bolsas vacías HPL por soldadura. Obtener un volumen final de 3 a 4 litros de combinado lisado de plaquetas humanas (pHPL) al mezclar el contenido de las dos bolsas. Conecte una bolsa pequeña (Baxter) y tomar una muestra de 20 ml pHPL para comprobar la esterilidad del producto combinado. Desconecte esta bolsa por soldadura. 6. Porcionado de la pHPL Parte de la pHPL para obtener alícuotas adecuadas para su posterior procesamiento. Conectar pequeñas bolsas (Baxter) a la bolsa de la puesta en común de matrimonio (MacoPharma) y la transferencia de volúmenes de hasta 250 ml a las bolsas de almacenamiento de pequeño (Baxter). Desconecte las bolsas llenas de soldadura. 7. Volver a la congelación de las alícuotas pHPL Aumentar la tasa de fragmentación de las plaquetas y la cantidad de factores de crecimiento liberados por otros de congelación / descongelación paso. Congelar las pequeñas bolsas de pHPL porciones de nuevo por lo menos a -20 ° C. 8. Re-descongelación y dosificación de las alícuotas pHPL Descongele las bolsas pHPL a 37 ° C (baño de agua). Transferir el contenido en viales de 50 ml (Falcon BD) por cortar el tubo de la bolsa con unas tijeras estériles y verter el pHPL en los viales. Realice este paso en un banco de flujo laminar para evitar la contaminación bacteriana o micótica. 9. Extirpación de los fragmentos de plaquetas Como fragmentos de plaquetas tienden a agruparse y puede inducir a aloinmunización, sacarlos de la pHPL. Centrifugue los viales pHPL por lo tanto, a 4.000 g (15 minutos, 4 ° C). En una pipeta banco de flujo laminar el plasma sobrenadante en los viales de almacenamiento final (Falcons BD) y desechar los gránulos de las plaquetas a evitar los fragmentos en cultivos celulares. 10. Almacenamiento de pHPL Congelar las alícuotas de 50 ml viales pHPL de nuevo en menos de 20 ° C y almacenarlos para su uso experimental. 11. El uso de pHPL en cultivo celular Inicialmente añadir heparina sin conservantes para el medio para evitar la formación de gel. Descongelar una alícuota de pHPL a 37 ° C y complementar el medio de cultivo mediante la adición de 8 a 10%. Medios MSC-Media: Utilizar 500 ml de una MEM, añadir 56 ml de descongelado pHPL (véase también la referencia 1 para más detalles) e IU 2 / ml (= l de solución madre 224) de la heparina sin conservantes (evita la coagulación del medio a través de la formación de grumos el fibrinógeno en el plasma) para alcanzar una concentración final del 10% pHPL. Además añade la penicilina (100U/mL) / estreptomicina (100μg/mL) y la solución 2 mM de L-glutamina (Sigma ambos). Filtrar el medio a través de 20 micras de poro del filtro de vacío de tamaño (Millipore). Etiqueta de la botella adecuadamente (contenido, la fecha). ECFC-Media: Utilice una botella (500 ml) de la MBE, añadir las alícuotas de citoquinas, 56 ml de pHPL, 10 UI / ml (= 1120μl de la solución madre) sin conservantes heparina, penicilina (100U/mL) / estreptomicina (100 g / ml) y 2 mM de L-glutamina en el medio basal y el filtro con 20 l-de tamaño de poro del filtro de vacío (Millipore). Etiqueta de la botella adecuadamente (contenido, la fecha). <img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Preparación de plasma rico en plaquetas a partir de una donación de sangre total de un banco de sangre local o cualquier otro proveedor autorizado. Después de la centrifugación de la sangre puede ser separada en plasma, la capa leucocitaria y los glóbulos rojos. Cuatro unidades de la capa leucocitaria, grupo sanguíneo O y un grupo sanguíneo AB plasma pueden agruparse antes de la centrifugación para separar el plasma rico en plaquetas. Una calidad regular rico en plaquetas unidad de plasma de aproximadamente 300 ml debe contener 1x10 9 plaquetas por ml o 3x10 platele 11ts total. <img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig2.jpg" alt="Figura 2" /><img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig3.jpg" alt="Figura 3" />

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En algunas regiones de plaquetas en plasma rico (PRP) se puede obtener a partir de buffy-coats de lo contrario ser un producto de desecho de concentrados de la producción de glóbulos rojos a partir de donaciones de sangre analizadas (Figura 1). En condiciones óptimas, PRP se utiliza inmediatamente para su posterior elaboración de pHPL, como en las plaquetas obsoletas se concentra la disponibilidad de factores de crecimiento puede ser reducida debido a las lesiones de almacenamiento de plaquetas y la degradación 20....

<table><tbody><tr><td>Doble bolsa (2 x 3,5 L)</td><td>MacoPharma</td><td>VDL 8000XQ</td><td>originalmente para punción de ascitis</td></tr><tr><td>Tubo Falcon de 50 mL</td><td>Falcon BD</td><td>2098</td><td></td></tr><tr><td>Probetas graduadas de 50 mL</td><td>Costar</td><td>4501</td><td></td></tr><tr><td>Bolsas para plasma (600 mL)</td><td>Baxter International Inc.</td><td>R4R2021</td><td></td></tr><tr><td>Soldador de tubos estéril</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>TSCD-II</td><td></td></tr><tr><td>Equipo de soldadura</td><td>Fresenius Kabi</td><td>Compo Seal</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras estériles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de combinados lisado plaquetario humano (phpl) como un suplemento eficaz de los animales libres de suero humano culturas de células madre

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Factores de crecimiento derivados de plaquetas se ha demostrado que estimulan la proliferación celular de manera eficiente<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 1,2</sup&gt; Y<em&gt; In vitro</em&gt;. Este efecto se ha informado de células mesenquimales del estroma (MSC), fibroblastos y células endoteliales que forman colonias con las plaquetas activadas por la trombina<sup&gt; 5.3</sup&gt; O lisadas por los ciclos de congelación / descongelación<sup&gt; 14/06</sup&gt; Antes de la releasate plaquetas se añade al medio de cultivo celular. El efecto trófico de los factores de crecimiento derivados de plaquetas ya ha sido probado en varios estudios de ingeniería de tejidos y terapia regenerativa.<sup&gt; 1,15-17</supEficiencia&gt; Variación se considera al menos en parte debido a las concentraciones de forma individual divergentes de los factores de crecimiento<sup&gt; 18,19</sup&gt; Y la actual falta de protocolos estandarizados para la preparación de plaquetas.<sup&gt; 15,16</sup&gt; Este protocolo presenta un procedimiento viable para generar un conjunto de lisado de plaquetas humanas (pHPL) derivados de la producción rutinaria de plasma rico en plaquetas (PRP) de cuarenta a cincuenta donaciones de sangre única. Por varios de congelación / descongelación ciclos de las membranas de las plaquetas están dañadas y los factores de crecimiento son liberados de manera eficiente en el plasma. Finalmente, los fragmentos de plaquetas se separa por centrifugación para evitar la formación de agregados amplios y agotan los antígenos potenciales. La implementación de protocolos de cultivo en pHPL estándar representa una herramienta prometedora para el futuro desarrollo de la terapéutica de células propagadas en un animal libre de proteínas del sistema.

Lisado de plaquetas humanas es una rica fuente de factores de crecimiento y un suplemento potente en cultivo celular. Este protocolo se presenta el proceso de preparación de una gran cantidad de lisado de plaquetas humanas, partiendo de plasma rico en plaquetas, la realización de varios ciclos de congelación-descongelación y el agotamiento de los fragmentos de plaquetas.

Preparación de combinados lisado plaquetario humano (pHPL) como un suplemento eficaz de los animales libres de suero humano culturas de células madre

Se ha demostrado que los factores de crecimiento derivados de plaquetas estimulan la proliferación celular de manera eficiente in vivo1,2 e in vitro. Este efecto se ha reportado para...

Este protocolo describe el proceso de preparación de un gran lote de lisado plaquetario humano, a partir de plasma rico en plaquetas. Mediante la realización de un ciclo de congelación-descongelación, las plaquetas se lisan. Luego, al menos 10 unidades de lisado plaquetario humano se agrupan en un lote único de lisado plaquetario humano agrupado o PHPL.Este volumen de aproximadamente tres litros se divide además en alícuotas y se vuelve a congelar para agotar los fragmentos plaquetarios. Estas alícuotas se descongelan, se transfieren a viales y se centrifugan. El sobrenadante es el PHPL agotado de fragmentos plaquetarios, que contiene factores de crecimiento derivados de plaquetas utilizados para suplementar cultivos celulares.Se descarta el pellet restante de fragmentos de plaquetas. Hola, soy Kadina Sharmo del laboratorio del Dr. TRO en la unidad de investigación de células madre de la Universidad Médica de Grads. Hoy les mostraremos un procedimiento para la preparación de un pool de aislamientos plaquetarios humanos.Comenzaremos a partir de plasma rico en plaquetas, realizaremos varios ciclos de congelación y descongelación, y luego eliminaremos los fragmentos plaquetarios. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para obtener un suplemento suficiente para cultivos celulares como alternativa al suero de bovino fetal. Así que comencemos.Este protocolo comienza con plasma rico en plaquetas, que se denomina PRP. Este plasma podría haberse preparado mediante aféresis con Cy o derivado de capas leucocitarias (Buffy coats). Las personas ajenas al campo de la medicina transfusional deberían adquirir el PRP de un banco de sangre local u otro proveedor autorizado.Compruebe la esterilidad de la unidad de PRP transfiriendo 20 mililitros de cada unidad a una bolsa conectada pequeña y desconectando la bolsa mediante el soldador. Esta alícuota puede enviarse inmediatamente después de la preparación a un laboratorio de microbiología para la prueba de esterilidad. Es importante congelar las unidades de PRP a al menos menos 20 grados en la bolsa original de almacenamiento.Una vez que las pruebas bacterianas sean negativas, se puede realizar el siguiente paso. Tenga cuidado de no permitir que el lisado plaquetario humano, ahora denominado HPL, se caliente en exceso; coloque las unidades de HPL en un baño de agua a 37 grados hasta que desaparezcan los coágulos de hielo. Las plaquetas deben lisarse tras este paso de congelación y descongelación para preparar un producto estandarizado para cada grupo de lisado plaquetario.Recolecte de 10 a 15 unidades de PRP descongeladas. Conecte cada bolsa de HPL consecutiva a la bolsa doble para agrupación, y luego transfiera el HPL a estas dos bolsas. Desconecte las bolsas de HPL vacías utilizando la soldadora.Mezcle el contenido de las dos bolsas para obtener un volumen final de tres a cuatro litros de lisado plaquetario humano agrupado, ahora denominado PHPL. Conecte una bolsa pequeña y obtenga una muestra de 20 mililitros de PHPL para verificar la esterilidad del producto agrupado.Aliquote muestras de PHPL para su posterior procesamiento conectando bolsas pequeñas a la bolsa doble de agrupación. Transfiera volúmenes de aproximadamente 250 mililitros a las bolsas pequeñas de almacenamiento y luego desconecte las bolsas llenas utilizando la soldadora. Realice ahora un ciclo adicional de congelación-descongelación para aumentar la tasa de fragmentación de plaquetas y la cantidad de factores de crecimiento liberados.Hágalo congelando las bolsas pequeñas con porciones de PHBL a menos 20 grados. Luego descongele las bolsas en un baño de agua a 37 grados. En la cabina de flujo laminar.Utilice tijeras estériles para cortar y abrir el tubo de cada bolsa, y luego vierta el PHPL en los viales de 50 mililitros. A menudo, los fragmentos de plaquetas tienden a agregarse; además, las plaquetas pueden inducir aloinmunización. Para evitar estas condiciones, elimine los fragmentos del PHPL mediante centrifugación a 4.000 ×g durante 15 minutos en una centrífuga refrigerada.A continuación, pipete el sobrenadante de plasma hacia los tubos finales de almacenamiento y deseche los pellet de plaquetas para evitar la presencia de fragmentos en sus cultivos celulares al congelar. Alícuotas de 50 mililitros de PHPL una vez más a menos 20 grados hasta su uso posterior. Ahora que se ha generado PHPL libre de fragmentos de plaquetas, pueden analizarse las características del lisado.La función y calidad del lisado plaquetario agrupado se evalúan en cultivos celulares y se demuestran mediante la estimulación eficaz de la proliferación celular, la propagación de células estromales mesenquimales o MSCs y la formación exitosa de colonias endoteliales, E CFCs, utilizando PHPL agotado de fragmentos plaquetarios. Consulte nuestro protocolo escrito con las recetas del medio aquí. Dos aplicaciones para el lisado plaquetario humano agrupado.En el cultivo de células mesenquimales estromales, se muestra que las CME del donante uno fueron cultivadas con PHPL o con PHPL agotado de fragmentos plaquetarios. Como se indica, aquí se observa una mayor contaminación con fragmentos en comparación con el PHPL agotado de fragmentos solo. Los fragmentos plaquetarios no soportan adecuadamente el crecimiento de las CME.Las tres imágenes se tomaron tras 13 días de cultivo. Las CMM del donante dos se cultivaron durante nueve días en PHPL agotado de fragmentos plaquetarios en lugar de plasma rico en plaquetas. Obsérvese que el PRP sin lisis plaquetaria no es suficiente para sostener el crecimiento celular de las CMM.Vea también el protocolo de JoVE por Andreas Reish, que describe el uso de PHPL desprovisto de fragmentos para el aislamiento y cultivo de MSC derivadas de sangre de cordón umbilical humano. Acabamos de mostrarle cómo preparar PHPL para reemplazar completamente el suero animal en sus cultivos de células madre. Al realizar este procedimiento, es importante recordar eliminar los fragmentos plaquetarios antes de agregar heparina y PHPL al medio de cultivo.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí, presentamos protocolos de cultivo de células madre pluripotentes humanas (hPSC), basados en el crecimiento de células individuales disociadas de monocapa (NCM) de tipo no colonia. Este nuevo método, que utiliza inhibidores de la quinasa asociada a Rho o la isoforma de laminina 521 (LN-521), es adecuado para producir grandes cantidades de hPSC homogéneas, la manipulación genética y el descubrimiento de fármacos.

Culturas alternativas para Pluripotentes Stem Cell Production, mantenimiento y análisis genético

Los protocolos descritos permiten a los laboratorios realizar cultivos de células madre adherentes y escalables con un rendimiento mínimo con un costo mínimo de inversión en mano de obra, experiencia y equipo utilizando un robot de manejo de líquidos programable y placas de 96 pocillos.  Las iPSCs transitadas más de 20 veces en este sistema mantuvieron la pluripotencia, los cariotipos normales y se diferenciaron en cardiomiocitos.

Escalable 96 pocillos Placa base IPSC Cultura y Producción Usando un sistema de manipulación robótica Líquido

Este protocolo proporciona una forma sencilla y eficiente de propagar células madre pluripotentes humanas (hPSCs) utilizando solo medios condicionados derivados de la placenta humana en un plato recubierto de gelatina sin suplementación exógena adicional o sustratos sintéticos específicos de hPSC.

Una Cultura Modelo Novela de Pluripotentes Stem Cell Propagación de gelatina en Media Placenta acondicionado

Este protocolo describe un enfoque semiautomático para producir células similares a hepatocitos de células de vástago pluripotent humana en formato de 96 placa bien. Este proceso es rápido y eficiente, permitiendo que la producción de calidad asegurada lotes de hepatocitos como las células para investigación básica y aplicada.

Producción semi automatizada de hepatocitos como células de células madre pluripotentes

Este protocolo describe un enfoque para producir hepatoesferas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando un sistema de cultivo definido y un autoensamblaje celular. Este protocolo es reproducible en una serie de líneas celulares, rentable y permite la producción de hepatóferas humanas estables para aplicación biomédica.

Producción libre de suero de heferas humanas tridimensionales a partir de células madre pluripotentes

Este protocolo presenta un dispositivo que produce PRP para impulsar la expansión in vitro de las células en un sistema de cultivo de fibroblastos 100% autólogo.

Producción de plasma autólogo rico en plaquetas para impulsar la expansión in vitro de fibroblastos humanos

Para evitar las limitaciones asociadas con el paso enzimático o mecánico de células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) cultivadas en células alimentadoras, hemos establecido un método rápido, efectivo, rentable y de alto rendimiento para recolectar colonias de hESC o hiPSC mantenidas en una capa de células alimentadoras de fibroblastos del prepucio humano utilizando la desadhesión mediada por EDTA.

Pase rápido, rentable y sin enzimas de células madre pluripotentes humanas a células alimentadoras mediante desadhesión mediada por ácido etilendiaminotetraacético

Este protocolo describe la generación de vasos sanguíneos autoorganizados a partir de células madre pluripotentes humanas y pluripotentes inducidas. Estas redes de vasos sanguíneos exhiben una red endotelial extensa y conectada rodeada de pericitos, actina del músculo liso y una membrana basal continua.

Generación de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de células madre pluripotentes

Los productos xenogénicos (químicos o derivados de animales) introducidos en los pasos de preparación/manipulación de la terapia celular se asocian con un mayor riesgo de reactividad inmune y transmisión patogénica en pacientes huéspedes. Aquí, se describe un método completo libre de xenogénicos para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano.

Aislamiento y cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo humano con un innovador método libre de xenogénicos para terapia humana

Los avances técnicos recientes permitieron la producción a escala de una plataforma in vitro para aplicaciones de metabolismo y toxicidad de fármacos. Un sistema hepático 2D+ totalmente humano (TV2D+) proporciona resultados fisiológicamente relevantes utilizando métodos tradicionales de cultivo bidimensional. Este protocolo apoyará a los usuarios finales en la configuración, el mantenimiento y la aplicación del sistema.

Un sistema de cultivo hepático totalmente humano para aplicaciones de desarrollo de fármacos

Aprende a preparar lisado plaquetario humano (pHPL) a partir de plasma rico en plaquetas mediante ciclos de congelación-descongelación y centrifugación. Este método libre de suero animal mejora el crecimiento celular en cultivos de células madre.

Preparación de combinados lisado plaquetario humano (pHPL) como un suplemento eficaz de los animales libres de suero humano culturas de células madre (Video) | JoVE Journal

Preparación de combinados lisado plaquetario humano (pHPL) como un suplemento eficaz de los animales libres de suero humano culturas de células madre

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