Preparación de combinados lisado plaquetario humano (pHPL) como un suplemento eficaz de los animales libres de suero humano culturas de células madre
30 de octubre de 2009
Lisado de plaquetas humanas es una rica fuente de factores de crecimiento y un suplemento potente en cultivo celular. Este protocolo se presenta el proceso de preparación de una gran cantidad de lisado de plaquetas humanas, partiendo de plasma rico en plaquetas, la realización de varios ciclos de congelación-descongelación y el agotamiento de los fragmentos de plaquetas.
Este protocolo describe el proceso de preparación de un gran lote de lisado plaquetario humano, a partir de plasma rico en plaquetas. Mediante la realización de un ciclo de congelación-descongelación, las plaquetas se lisan. Luego, al menos 10 unidades de lisado plaquetario humano se agrupan en un lote único de lisado plaquetario humano agrupado o PHPL.
Este volumen de aproximadamente tres litros se divide además en alícuotas y se vuelve a congelar para agotar los fragmentos plaquetarios. Estas alícuotas se descongelan, se transfieren a viales y se centrifugan. El sobrenadante es el PHPL agotado de fragmentos plaquetarios, que contiene factores de crecimiento derivados de plaquetas utilizados para suplementar cultivos celulares.
El pellet restante de fragmentos de plaquetas se descarta. Hola, soy Kadina Sharmo del laboratorio del Dr. TRO en la unidad de investigación de células madre de la Universidad Médica de Grads. Hoy les mostraremos un procedimiento para la preparación de un pool de aislamientos plaquetarios humanos.
Comenzaremos a partir de plasma rico en plaquetas, realizaremos varios ciclos de congelación y descongelación, y luego eliminaremos los fragmentos plaquetarios. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para obtener un suplemento suficiente para cultivos celulares como alternativa al suero de bovino fetal. Así que comencemos.
Este protocolo comienza con plasma rico en plaquetas, que se denomina PRP. Este plasma podría haberse preparado mediante aféresis con Cy o haberse obtenido de capas leucocitarias (buffy coats). Las personas ajenas al campo de la medicina transfusional deben adquirir el PRP de un banco de sangre local u otro proveedor autorizado.
Verifique la esterilidad de la unidad de PRP transfiriendo 20 mililitros de cada unidad a una bolsa conectada pequeña y desconectando la bolsa mediante el soldador. Esta alícuota puede enviarse inmediatamente después de la preparación a un laboratorio de microbiología para la prueba de esterilidad. Es importante congelar las unidades de PRP a al menos menos 20 grados en la bolsa original de almacenamiento.
Una vez que las pruebas bacterianas sean negativas, se puede realizar el siguiente paso. Tenga cuidado de no permitir que el lisado plaquetario humano, ahora denominado HPL, se caliente en exceso; coloque las unidades de HPL en un baño de agua a 37 grados hasta que desaparezcan los coágulos de hielo. Las plaquetas deben lisarse tras este paso de congelación y descongelación para preparar un producto estandarizado para cada grupo de lisado plaquetario.
Recolecte de 10 a 15 unidades de PRP descongeladas. Conecte cada bolsa de HPL consecutiva a la bolsa doble para agrupación, y luego transfiera el HPL a estas dos bolsas. Desconecte las bolsas de HPL vacías utilizando la soldadora.
Mezcle el contenido de las dos bolsas para obtener un volumen final de tres a cuatro litros de lisado plaquetario humano agrupado, ahora denominado PHPL. Conecte una bolsa pequeña y obtenga una muestra de 20 mililitros de PHPL para verificar la esterilidad del producto agrupado.
Aliquote muestras de PHPL para su posterior procesamiento conectando bolsas pequeñas a la bolsa doble de agrupación. Transfiera volúmenes de aproximadamente 250 mililitros a las bolsas pequeñas de almacenamiento y luego desconecte las bolsas llenas utilizando la soldadora. Realice ahora un ciclo adicional de congelación-descongelación para aumentar la tasa de fragmentación de plaquetas y la cantidad de factores de crecimiento liberados.
Hágalo congelando las bolsas pequeñas con porciones de PHBL a menos 20 grados. Luego descongele las bolsas en un baño de agua a 37 grados. En la cabina de flujo laminar.
Utilice tijeras estériles para cortar y abrir el tubo de cada bolsa, y luego vierta el PHPL en los viales de 50 mililitros. A menudo, los fragmentos de plaquetas tienden a agregarse; además, las plaquetas pueden inducir aloinmunización. Para evitar estas condiciones, elimine los fragmentos del PHPL mediante centrifugación a 4.000 ×g durante 15 minutos en una centrífuga refrigerada.
A continuación, pipete el sobrenadante de plasma hacia los tubos finales de almacenamiento y deseche los pellet de plaquetas para evitar tener fragmentos en sus cultivos celulares. Alícuotas de 50 mililitros de PHPL una vez más a menos 20 grados hasta su uso posterior. Ahora que se ha generado PHPL desprovisto de fragmentos plaquetarios, pueden analizarse las características del lisado.
La función y calidad del lisado plaquetario en pool se evalúan en cultivos celulares y se demuestran mediante la estimulación eficaz de la proliferación celular, la propagación de células estromales mesenquimales o MSCs y la formación exitosa de colonias endoteliales, E CFCs, utilizando PHPL agotado de fragmentos plaquetarios. Consulte nuestro protocolo escrito con las recetas del medio aquí. Dos aplicaciones para el lisado plaquetario humano en pool.
En el cultivo de células estromales mesenquimales, se muestra que las CEM del donante uno se cultivaron con PHPL o con PHPL agotado de fragmentos plaquetarios. Como se indica, aquí se observa una mayor contaminación con fragmentos en comparación con el PHPL agotado de fragmentos solo. Los fragmentos plaquetarios no soportan adecuadamente el crecimiento de las CEM.
Las tres imágenes se tomaron tras 13 días de cultivo. Las CMM del donante dos se cultivaron durante nueve días en PHPL agotado de fragmentos plaquetarios en lugar de plasma rico en plaquetas. Obsérvese que el PRP sin lisis plaquetaria no es suficiente para sostener el crecimiento celular de las CMM.
Vea también el protocolo de JoVE por Andreas Reish, que describe el uso de PHPL agotado de fragmentos para el aislamiento y cultivo de MSC derivadas de sangre de cordón umbilical humano. Acabamos de mostrarle cómo preparar PHPL para reemplazar completamente el suero animal en sus cultivos de células madre. Al realizar este procedimiento, es importante recordar eliminar los fragmentos plaquetarios antes de agregar heparina y PHPL al medio de cultivo.
Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este protocolo describe la preparación de lisado de plaquetas humanas (HPL) a partir de plasma rico en plaquetas (PRP). El proceso implica ciclos de congelación-descongelación para lisar las plaquetas y producir un lisado pobre en fragmentos de plaquetas, rico en factores de crecimiento, destinado a la suplementación en cultivos celulares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Cultivo celular
- Biología de las plaquetas
- Investigación de factores de crecimiento
Antecedentes
- El lisado de plaquetas humanas es un suplemento potente en el cultivo celular.
- Contiene diversos factores de crecimiento esenciales para la proliferación y diferenciación celulares.
- El proceso de preparación es fundamental para garantizar la calidad y eficacia del lisado.
- El plasma rico en plaquetas sirve como material inicial para la preparación del lisado de plaquetas humanas.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para la preparación de lisado plaquetario humano.
- Asegurar el agotamiento de los fragmentos plaquetarios para obtener un lisado más puro.
- Facilitar el uso del LPH en diversas aplicaciones de cultivo celular.
Métodos Utilizados
- Partiendo de plasma rico en plaquetas (PRP).
- Realización de ciclos de congelación-descongelación para lisar plaquetas.
- Preparación de lisado plaquetario humano agrupado (PHPL).
- Centrifugación para agotar los fragmentos plaquetarios del sobrenadante.
Resultados principales
- Preparación exitosa de un gran pool de lisado plaquetario humano.
- Agotamiento de fragmentos plaquetarios logrado mediante centrifugación.
- Rendimiento de aproximadamente tres litros de factores de crecimiento derivados de plaquetas.
- Preparación adecuada para suplementación en cultivos celulares.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para la preparación de lisado plaquetario humano.
- El LPH puede mejorar significativamente los resultados del cultivo celular.
- Estudios futuros pueden explorar las aplicaciones del LPH en diversos campos de investigación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los sistemas de cultivo libres de suero animal son fundamentales para impulsar la terapéutica con células madre hacia la traslación clínica y el cumplimiento regulatorio. Este protocolo permite la producción a escala de lisado plaquetario humano (pHPL) como un suplemento definido y libre de componentes xenógenos que favorece la proliferación de células estromales mesenquimales y la propagación de células formadoras de colonias endoteliales. Al estandarizar la lisis plaquetaria y la eliminación de fragmentos, se reduce la variabilidad entre lotes y se mejora la reproducibilidad en flujos de trabajo de descubrimiento temprano y preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Proporciona un suplemento definido de origen humano que favorece estudios mecanicistas de las vías de proliferación y diferenciación de células madre.
- Valor operativo: Permite condiciones de cultivo consistentes entre experimentos, reduciendo la variabilidad en ensayos de validación de dianas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona un medio estandarizado y rico en factores de crecimiento que respalda lecturas confiables en ensayos funcionales de células madre.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos mediante un lisado libre de fragmentos, minimizando la interferencia de agregados plaquetarios en plataformas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Permite la expansión de células madre relevantes para enfermedades en condiciones libres de componentes ajenos, alineándose con los requisitos de biomarcadores traslacionales y modelos preclínicos.
- Valor operativo: Posibilita la producción a escala a partir de fuentes agrupadas de donantes, facilitando la transferencia de tecnología y el desarrollo de procesos compatibles con buenas prácticas de manufactura.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento al proporcionar un suplemento libre de suero para el cultivo de células madre desde la validación temprana del objetivo hasta la expansión preclínica, apoyando la identificación de compuestos líderes y la reducción de riesgos mecanicistas.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis en la proliferación y diferenciación de células madre al proporcionar un microentorno constante y definido.
- Selección: Permite pruebas reproducibles de compuestos o condiciones en ensayos basados en células madre mediante un lisado estandarizado y agotado de fragmentos.
- Análisis: Genera resultados cuantificables como tasas de proliferación celular y eficiencia de formación de unidades formadoras de colonias, posibilitando análisis comparativos entre diferentes condiciones de cultivo.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con trabajos preclínicos al permitir la expansión de células estromales mesenquimales y progenitoras endoteliales en condiciones clínicamente relevantes y libres de componentes animales.
- Reutilización Empresarial: Establece un proceso reutilizable y escalable para generar suplementos de grado clínico a partir de plasma rico en plaquetas de origen habitual, reduciendo la dependencia de sueros animales variables.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en los resultados del cultivo de células madre al eliminar componentes indefinidos de suero animal y estandarizar la administración de factores de crecimiento.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante el procesamiento de muestras agrupadas de donantes y pasos estandarizados de congelación-descongelación y centrifugación.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en el desarrollo de terapias celulares al proporcionar una alternativa humana y libre de componentes xenógenos al suero fetal bovino.
- Impacto en el portafolio: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al permitir la generación consistente de datos preclínicos en sistemas de cultivo definidos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas estériles de cultivo celular, manipulación de plaquetas y protocolos de centrifugación.
- Depende del acceso a plasma rico en plaquetas procedente de bancos de sangre autorizados o servicios de transfusión, y de equipo estéril para soldadura o sellado para la manipulación de bolsas.
- Necesita pruebas de esterilidad estandarizadas del PRP de entrada y del lisado agrupado antes y después del procesamiento, para garantizar la seguridad del cultivo.
- Requiere adaptación de los protocolos de cultivo para tener en cuenta las concentraciones específicas de factores de crecimiento por lote, a pesar de la estrategia de agrupamiento.
- Está limitado por la necesidad de múltiples ciclos de congelación-descongelación y pasos de centrifugación, lo que aumenta el tiempo de procesamiento y requiere equipo especializado.
