Aislamiento y suero animal expansión libre de cordón umbilical humano derivado de células mesenquimales del estroma (MSC) y endoteliales formadoras de colonias Células Progenitoras (ECFCs)

Este protocolo describe el aislamiento y la posterior expansión de células mesenquimales del estroma y las células endoteliales que forman colonias sin el uso de suero animal para generar pares con fines de trasplante autólogo experimental.

El cordón umbilical humano es una fuente de células progenitoras de fácil acceso. En este artículo describimos un protocolo para el aislamiento y posterior expansión de progenitores endoteliales y CFCs, una subpoblación de células dentro de la pared del vaso y células progenitoras mesenquimales. MSCs derivadas de un solo cordón umbilical humano.

Primero usando tijeras longitudinalmente, corte a lo largo de la vena umbilical humana y raspe las células de la superficie del vaso interno. Transfiera las células del raspador a un matraz y espere a que la colonia crezca. Algunas de las células raspadas exhibirán un fenotipo progenitor y proliferarán fuertemente hasta formar grandes colonias.

Una vez que estas células han proliferado, los e CFC pueden expandirse en nuevos frascos. Para un análisis más detallado, también se puede aislar una población de células mesenquimales del cordón umbilical humano. Corte partes del cordón en pedazos pequeños y transfiéralos a una placa de cultivo estéril.

Después de unos días, el crecimiento de las células estromales será visible alrededor de las piezas de tejido del cordón intervascular. Transfiera estas células a nuevos matraces y amplíelos para su posterior análisis. Este protocolo le permite obtener dos tipos de linajes de células progenitoras a partir de un solo cordón de material de partida en un plazo de tres a cuatro semanas.

Hola, soy Andreas Danish y trabajo en el laboratorio del Dr. T Strong en una unidad de investigación con células madre en la Universidad Médica de Grads en Austria. Hoy te mostraremos un procedimiento para el aislamiento, expansión y análisis de células mesenquimales y de canales endoteliales humanos a partir de un código umbilical. Solo una nota sobre la terminología.

Nuestras células se denominan células estromales mesenquimales multipotentes, o MSE, y células pro formadoras de colon endotelial o CSC e. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la función y la biología de las células progenitoras no hemáticas. Así que comencemos.

Antes de los pasos de aislamiento celular, limpie la campana de cultivo de tejido de flujo laminar con inadina y reúna placas de cultivo celular estériles. Frascos de cultivo celular, instrumentos quirúrgicos esterilizados con PBS, raspadores de células, un soporte para tubos, tiras de 25 mililitros y una jeringa de cinco mililitros provista de una aguja roma. Recuerde precalentar el medio de cultivo de dos células alpha MEM y EGM en un baño de agua a 37 grados.

Ahora transfiera el cordón umbilical al flujo laminar y lávelo dos veces en PBS. Para eliminar la sangre contaminante, use una jeringa estéril de cinco mililitros para canular la vena del cordón umbilical de un lado. Ahora enjuague la vena umbilical con PBS hasta que salga el líquido.

El otro extremo del cordón se vuelve completamente transparente sin tinte rojo. Comience el aislamiento de las células progenitoras formadoras de colonias endoteliales llenando un matraz de 75 centímetros cuadrados con 15 a 20 mililitros de medio EGM precalentado dos. Coloque el cordón en un plato nuevo lleno de PBS estéril y use unas tijeras quirúrgicas para cortar el cordón en dos pedazos de aproximadamente cinco centímetros de largo cada uno.

Ahora inserte una hoja de las tijeras quirúrgicas y corte la vena longitudinalmente. En este punto, un asistente puede usar fórceps para sujetar la vena mientras se realizan más cortes. Coloque el cordón con la vena abierta en un plato nuevo.

Sin PBS, use un raspador de células para frotar la superficie interna de la vena sobre un área de al menos un centímetro. Lave el raspador en el medio EGM dos para liberar las células del recipiente frotadas en el matraz. Este procedimiento deberá repetirse hasta 10 veces.

Cierre el matraz y colóquelo en una incubadora configurada a 37 grados, 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad. Ahora que se han aislado los e CFC, pasemos a los MSC. Ahora que se ha raspado la capa endotelial, use un bisturí estéril para cortar el cordón en pedazos muy pequeños.

De uno a dos milímetros. Utilice al máximo pinzas estériles para transferir estas piezas a una placa de cultivo preetiquetada. Deje la placa abierta durante al menos cinco minutos antes de llenarla con medio para permitir que las piezas se adhieran a la superficie de plástico.

Usando la velocidad más baja posible, agregue suavemente de 30 a 35 mililitros de MEM alfa modificado precalentado. Cierre la placa y colóquela en una incubadora configurada a 37 grados con 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad. El crecimiento de las células estromales mesenquimales de las piezas del cordón tomará de tres a siete días, después de los cuales las células pueden expandirse.

Mientras tanto, ECFC se puede expandir, lo que se mostrará en el siguiente paso. Al día siguiente, use un microscopio invertido para examinar las células. Si el procedimiento de raspado se realizó correctamente, los primeros grupos de células en proliferación serán completamente visibles.

Reemplace el medio E GM dos para eliminar todas las células y partículas no adheridas. Siga expandiendo las células e intercambiando un tercio del medio dos veces por semana. Después de 10 a 12 días, se observarán regularmente colonias endoteliales muy grandes.

Ahora, retire el medio y lave con PBS para deshacerse del uso de proteínas restantes. 0.05%tripsina 0.7 milimolar EDTA para separar las células. Al transferir células a nuevos recipientes de cultivo, asegúrese de elegir matraces del tamaño adecuado para lograr una baja densidad de siembra.

Esto ayudará a una mayor expansión. Nuestro laboratorio suele alejar la progenie de más de 20 colonias grandes en cuatro frascos de doscientos veinticinco centímetros cuadrados. No olvide reemplazar un tercio del medio dos veces por semana.

Un protocolo similar se utiliza para la expansión de MSC en la siguiente sección. Una vez que hayan pasado de tres a siete días, use un microscopio invertido para verificar la apariencia de células en forma de huso cerca del tejido adherido. Cuando hay suficiente crecimiento celular, las piezas tienden a adherirse a medida que pierden contacto con el plástico.

Después de 10 a 12 días, retire los trozos de tejido. Separe las MSC del plástico utilizando una solución de tripsina EDTA y transfiera las células a nuevos matraces de cultivo precargados de medio que tengan el tamaño y el número adecuados para garantizar una baja densidad de siembra durante la expansión de la célula. Será necesario intercambiar un tercio del medio dos veces por semana una vez que ambos tipos de células se hayan expandido.

La tinción seguida de citometría de flujo se puede realizar para detectar la expresión de marcadores de superficie celular indicativos de fenotipos progenitores y determinar que no hay contaminación con células hematopoyéticas. Siembre los CFC puros cosechados a una densidad de siembra muy baja de tres o 10 células por centímetro cuadrado en placas de cultivo celular para garantizar el crecimiento de una sola colonia Intercambie un tercio del medio dos veces por semana después de 14 días. El fin de la cultura.

Retire el medio. Lavar dos veces con PBS y fijar las colonias con solución de fijación helada Durante 15 minutos en el refrigerador, desechar la solución de fijación y dejar las placas abiertas para que se sequen durante 10 minutos. Rehidrata las células con agua destilada durante 10 minutos.

Agregue la solución de Harris Hematin y tiña las colonias fijas durante 12 minutos. Retire la solución de hematina y enjuague las placas con agua del grifo. Para deshacerse de la solución de tinción restante.

Tome fotos de cada colonia usando un microscopio estereoscópico e importe archivos en formato jpeg o TIFF a su computadora. Abra las fotos con el software image J y analice el número de celdas exacto de cada colonia como se describe en la siguiente animación. Abra el software image J e importe una imagen de colonia usando la función de apertura de archivos en el menú desplegable.

Proceda utilizando el proceso. Restar función de fondo. Utilice la función de selección elíptica o de pincel en el menú J de la imagen para marcar el margen de la colonia.

Borre la imagen circundante con la función de edición de borrado exterior y recorte la imagen seleccionando recorte de imagen. Ajuste el umbral manualmente usando la función de umbral de ajuste de imagen para que todas las celdas estén completamente coloreadas. Rojo. Cuente el número de celda de la colonia seleccionando.

Analizar, analizar partículas. Elija la configuración adecuada optimizada para cada tipo de celda y seleccione Aceptar si se realiza correctamente. Este protocolo permite el aislamiento de una población prácticamente pura de células que comparten las características de las células progenitoras endoteliales y mesenquimales humanas, que son autólogas entre sí porque se derivan del mismo cordón.

A partir del quinto día, aparecerán células mesenquimales en forma de huso por debajo de la pieza del cordón unida a la placa de cultivo. Después de uno o dos días, los primeros grupos de colonias endoteliales que forman células progenitoras o CFC se harán visibles bajo un microscopio invertido. Esta enorme colonia de e-CFC de rápido crecimiento se formó después de 11 días.

Tanto los MSC como los E CFC pueden ser transitados y ampliados aún más. Recomendamos un análisis posterior de todos los productos de cultivo mediante citometría de flujo para confirmar el fenotipo adecuado. Recuerde que tanto el linaje endotelial como el mesénquima reaccionan a los anticuerpos específicos para CD 73, CD 1 46, CD 29 y CD 1 0 5.

Nótese que las MSCs expresaron el muslo uno, que se detectó utilizando un anticuerpo anti CD 90. Los CFC E son positivos para CD 31, que también se denomina molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias o pcam. Está bien establecido que la expresión de inmunorreactividad de CD-34 en el cordón por E. CFC puede reducirse mediante el cultivo repetido.

Los marcadores de células sanguíneas como CD-45, H-L-A-D-R y CD-14 permanecieron negativos para ambos tipos de células. La jerarquía de células progenitoras entre los CFC E se puede evaluar utilizando el software Image J contando el número preciso de células de cada colonia. Acabamos de mostrarle cómo aislar, expandir y analizar mazas y ECE de un código umbilical humano al realizar este procedimiento.

Es importante trabajar en condiciones estériles y comprobar el fenotipo y la pureza antes de utilizar las células en estudios posteriores. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.