Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

En esta técnica, los cubreobjetos de vidrio se funcionalizan con una mezcla de moléculas inertes y de biotina. Se crea una celda de flujo con esta superficie funcionalizada y se coloca en un microscopio de césped. Las plantillas de círculos rodantes biotinilados se fijan a la superficie mediante estreptavidina multivalente.

Cuando los sustratos se replican mediante la adición de proteínas y nucleótidos de la zona repli, el ADN bicatenario resultante se extiende con flujo laminar y se obtienen imágenes en tiempo real utilizando un tinte intercotejante. Hola, soy Nathan Tanner del laboratorio de Antoine Van Ian en el Departamento de Química Biológica y Farmacología Molecular de la Facultad de Medicina de Harvard. Soy Joe Laro, también del laboratorio de Van Noian.

Hoy te mostraremos un procedimiento para obtener imágenes de fluorescencia de la replicación del ADN en tiempo real a nivel de molécula individual. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las actividades coordinadas de síntesis de ADN de complejos de replicación individuales. Así que comencemos.

Para comenzar este procedimiento, anímelo el oligo de la cola biotinilada al ADN monocatenario M 13 agregando un exceso de diez veces de oligo en el calentamiento del tampón TBS a 65 grados Celsius, luego apagando el bloque de calor para permitir un enfriamiento lento para anear correctamente el cebador. Ahora que el primo M 13 está listo, agréguelo a una mezcla de 64 nanomolares T seven ADN polimerasa y tampón de replicación T seven que contiene D NDP y cloruro de magnesio e incube la reacción a 37 grados Celsius durante 12 minutos. Al final de la incubación, enfriar con 100 milimolares de EDTA.

A continuación, purifique el ADN del producto relleno con cloroformo de fenol isoamílico, extráigalo y dialice en tampón TE u otro tampón de almacenamiento adecuado, extraiga cada fase orgánica para recuperar cualquier residuo cebado. M 13 después de la diálisis determine la concentración de ADN con espectrofotómetro UV vis. Una iteración de la preparación de la plantilla puede producir una concentración nanomolar suficiente de la plantilla para cientos de miles de experimentos con una sola molécula.

Ahora que el ADN está listo, proceda a preparar los cubreobjetos funcionalizados. El ADN a replicar se adhiere a los cubreobjetos de vidrio funcionalizados con Amil Lane, el grupo Oxy del Amil se une al vidrio dejando una amina disponible para unirse a las moléculas de clavija biotiniladas. Este recubrimiento ayuda a reducir la adherencia inespecífica a la superficie.

Para limpiar a fondo los cubreobjetos de vidrio, colóquelos en frascos de tinte y llene los frascos con sonicato de etanol. Durante 30 minutos, enjuague los frascos y llénelos con un molar de hidróxido de potasio Sonicato durante 30 minutos y repita ambos lavados. Para la primera reacción de funcionalización, es necesario eliminar todos los rastros de agua.

Llene los frascos de tinción con acetona y sonique durante 10 minutos. Vacía los frascos y vuelve a llenarlos con acetona. Proceda a agregar el reactivo sinusoidal a los frascos y agite durante dos minutos.

Luego apague con un gran exceso de agua. A continuación, seque los cubreobjetos horneándolos a 110 grados centígrados en el horno durante 30 minutos. A continuación, prepare la mezcla de PEG a aproximadamente 0,2%peso por volumen en una clavija inada, incluido un espaciador de cubreobjetos de vidrio que permita la separación de los cubreobjetos, pipetee 100 microlitros en un cubreobjetos secos y aislados.

Coloque un segundo cubreobjetos en la parte superior. Incubar los cubreobjetos en la solución de PEG durante tres horas. A continuación, separe cada par de cubreobjetos y lávelos abundantemente con agua.

Tenga cuidado de mantener los cubreobjetos funcionalizados con el lado hacia arriba, ya que solo un lado estará cubierto con una clavija. Finalmente, seque los cubreobjetos con aire comprimido y guárdelos al vacío en un desecado, las superficies permanecen estables durante al menos un mes. Por lo tanto, se pueden hacer docenas de cubreobjetos en un lote y usarlos según sea necesario.

Ahora que los cubreobjetos están listos, se puede ensamblar la cámara de flujo para el experimento de una sola molécula. Comience colocando de 20 a 25 mililitros de tampón de bloqueo que contenga BSA en un desecado para eliminar las burbujas de aire para los pasos posteriores. A continuación, diluya 25 microlitros de estreptavidina en 100 microlitros de PBS y extienda la solución sobre la superficie de una clavija funcionalizada e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir que la estreptavidina se una a la biotina de superficie mientras prepara otras partes de la cámara.

Mientras se incuba el cubreobjetos, corte un trozo de cinta adhesiva de doble cara con respaldo en ambos lados para que coincida con el tamaño del portaobjetos de cuarzo utilizado para ensamblar la cámara de flujo. Marque la posición de los orificios de los tubos en la cinta con un lápiz para que se pueda dibujar un contorno de la cámara de flujo en la cinta. Después de marcar los agujeros, haga un rectángulo de dos milímetros de ancho alrededor de las marcas.

Este rectángulo servirá como canal de flujo, así que asegúrese de hacer lados rectos y dejar espacio alrededor de la entrada y salida de la tubería. Ahora corte la cinta marcada a lo largo del contorno dibujado, haciendo cortes rectos y limpios para asegurarse de que no sobresalga ningún adhesivo en el canal. Limpie a fondo el portaobjetos de cuarzo con acetona para eliminar el adhesivo de la construcción de la celda de flujo utilizado en experimentos anteriores.

Encuentre la mejor alineación del contorno del canal. Retire un lado de la parte posterior adhesiva y coloque con cuidado la cinta en el tobogán de la cancha. Tenga cuidado de alinear la cinta correctamente, ya que los orificios de entrada y salida deben permanecer desbloqueados.

A continuación, prepare las longitudes de corte de tubería de 0,76 milímetros para la entrada y salida de la celda de flujo. Es útil cortar el extremo del tubo en un ángulo de aproximadamente 30 grados para que el tubo no presione contra el fondo de la cámara. Suspenda el tubo en las gradillas de tubos de ensayo para facilitar la fijación a la celda de flujo en los siguientes pasos.

A estas alturas, la incubación del cubreobjetos ha terminado. Enjuague bien con agua el cubreobjetos recubierto de estreptococos ENC y séquelo con aire comprimido. Tenga cuidado de no voltear el cubreobjetos, ya que solo un lado está funcionalizado.

Finalmente, complete el montaje de la cámara de flujo quitando el otro lado del respaldo de la cinta y colocando la corredera de cuarzo en el cubreobjetos. Presione ligeramente el cubreobjetos para expulsar el aire atrapado en el adhesivo. Esto ayudará a evitar que entren burbujas de aire en el canal de flujo.

Selle los lados de la cámara con epoxi. Inserte el tubo cortado en los agujeros del cuarzo y selle en su lugar con epoxi y deje secar durante unos minutos. Cuando el sello epoxi esté seco, comience a bloquear la superficie.

Usando una aguja de calibre 21. Pase un poco del tampón de bloqueo Degas a través de uno de los tubos. Enjuague varias veces para eliminar las burbujas de aire y permita que la cámara se incube durante al menos media hora antes de pasar a la replicación de una sola molécula. Experimento.

Ahora que la celda de flujo se ha bloqueado, colóquela en la platina del microscopio. Sostenga la cámara en su lugar con clips de etapa y asegúrese de que el canal de flujo esté alineado a lo largo del eje y. Conecte el tubo de salida de la celda de flujo a la bomba de jeringa mediante un tubo conector de mayor diámetro.

Coloque la entrada en el tampón de bloqueo y tire hacia atrás de la jeringa para eliminar el aire del tubo. Un suave movimiento del tubo de salida ayudará a eliminar cualquier burbuja de aire atrapada en la celda de flujo. Ahora agregue el ADN, diluya la plantilla de ADN original a 25 picomolares en un mililitro de flujo de tampón de bloqueo en la cámara a un caudal moderado, como 0,025 mililitros por minuto, durante 30 minutos para permitir una buena cobertura superficial de ADN.

Una vez que el ADN esté en la cámara, lave el exceso de ADN utilizando un lavado de tampón de bloqueo durante al menos 200 volúmenes de celdas de flujo. Para deshacerse de todo el ADN libre, encienda el láser y la cámara. El CCD refrigerado debe alcanzar la temperatura antes de poder utilizarse.

Después de lavar el exceso de ADN y desgasificar el tampón de replicación, prepare la reacción de replicación, mezcle nucleótidos DTT y citoxina el tampón de replicación. A continuación, añade las proteínas y mezcla suavemente. A continuación, haga fluir la mezcla de reacción en la celda de flujo.

La velocidad del flujo aquí debe ser suficiente para estirar el ADN bicatenario por dos milímetros de ancho. El canal de flujo de 100 micrómetros de altura 0,04 mililitros por minuto funciona bien. Deje tiempo para que la mezcla ingrese a la cámara unos 10 minutos.

Mueva el campo de visión hacia el lado del canal y concéntrese en el material adhesivo para asegurarse de que uno esté cerca de la superficie para enfocar y comenzar a obtener imágenes. Ajuste la potencia del láser, el enfoque del microscopio y el ángulo del césped. Mantenga la potencia baja para evitar cualquier fotodivisión del ADN manchado.

Adquiere de uno a cinco fotogramas por segundo durante varios minutos, dependiendo de la tasa de replicación del ADN. Repita para obtener trayectorias de replicación más largas, o muévase a un nuevo campo para ver más moléculas cuando casi toda la mezcla de reacción se ha bombeado a la célula, fluya en más tampón con cyt para ver otros campos de visión. La toma de múltiples imágenes de diferentes moléculas replicadas proporciona estadísticas para la determinación de la productividad.

En el círculo rodante. El ensayo de replicación extiende la cola uniendo el círculo y la superficie, la cola se convierte en ADN bicatenario por la polimerasa de hebra rezagada y se estira por flujo laminar mostrado. Aquí hay un ejemplo de campo de visión con cyt orange a 532 nanómetros de excitación.

Los pequeños puntos fluorescentes son sustratos atados sin replicar. Obsérvese la extrema longitud de los productos y el gran número de productos por campo. Un campo de visión típico mostrará numerosas moléculas replicantes visibles a medida que crecen líneas brillantes de ADN teñido; Los experimentos con Coli a 37 grados Celsius dan de cinco a 50 moléculas por campo, dependiendo de la densidad de la superficie.

La zona de repla T seven se inicia de manera mucho más eficiente y replicará más del 50% de las moléculas en un campo. Con una densidad tan alta, es difícil resolver moléculas individuales como se ve aquí. Por lo tanto, realice el experimento T seven a concentraciones de proteínas más bajas o densidad superficial Gráficos de campana de moléculas replicantes típicas de E. coli y T siete experimentos incluyen trayectorias de punto final de moléculas de E. coli y T 7 trazadas en función del tiempo, las trayectorias se ajustan con regresión lineal para obtener tasas de replicación, que en este ejemplo son 467,1 pares de bases por segundo para E. coli y 99,4 pares de bases por segundo.

Para T seven, las distribuciones de velocidad de las trayectorias de una sola molécula que se ajustan a los gaussianos individuales dan una media de 535,5 más o menos 39 pares de bases por segundo para E. coli y 75,9 más o menos 4,8 pares de bases por segundo. Para T seven, las distribuciones de longitud de los productos de replicación se ajustan con un decaimiento exponencial simple para obtener la productividad, que es 85,3 más o menos 6,1 pares de kilobases para E. coli y 25,3 más o menos 1,7 pares de kilobases para G 7. A continuación, acabamos de mostrarte cómo medir la replicación coordinada del ADN con moléculas individuales.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar funcionalizar correctamente los deslizamientos de la cubierta y hacer canales de flujo rectos limpios. Asegúrese de mantener la carga de potencia del láser y minimizar la fotodivisión del ADN largo. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.