Name: Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 57 s
Description: Aprende a visualizar la replicación del ADN a nivel de molécula única mediante microscopía de fluorescencia en tiempo real. Este protocolo utiliza superficies funcionalizadas con biotina y flujo laminar para estudiar la dinámica de los replisomas individuales.

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Samir Hamdan ayudó en el desarrollo de esta técnica. E. proteínas coli son del laboratorio del profesor Nick Diaz, las proteínas de la Universidad de Wollongong, y T7 son del Prof. Charles Richardson, Harvard Medical School. El trabajo es financiado por los Institutos Nacionales de Salud (GM077248 a amvo) y la Fundación Jane Coffin Niños (JJL).

Antes de realizar un experimento de replicación de una sola molécula, unos pocos tienen que estar preparados de antemano. 1. Patrón de ADN de replicación El sustrato para la reacción de replicación es un biotina, cola M13 círculo rodante prepararse con técnicas de biología molecular 1,2. Materiales: M13mp18 ADN de cadena sencilla, primer oligonucleótido biotinilado cola (5&#39;-biotina-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &#39;), ADN polimerasa T7, bloque de calor, el alcohol fenol / isoamílico / cloroformo <ol><li> Recocer la cola oligo biotinilado a la M13 por la adición de un exceso de 10 veces de oligo en tampón TBS (330 nM cola oligo, 33 nM M13). </li><li> Calentar la mezcla a 65 ° C en el bloque de calor. Una vez caliente, a su vez el bloque de calor y deje un enfriamiento lento para templar correctamente la cartilla. </li><li> Agregue el M13 preparado para una mezcla de 64 nm de la polimerasa T7 ADN y la replicación T7 tampón que contiene dNTPs y MgCl 2. </li><li> Incubar la reacción a 37 ° C durante 12 minutos y apagar con 100 mM EDTA. </li><li> Purificar el lleno-en el ADN de productos con la extracción de alcohol de fenol / cloroformo / isoamílico y diálisis en buffer TE o tampón otro dispositivo de almacenamiento adecuado y determinar la concentración de ADN (Back-extracto de cada fase orgánica para recuperar los residuos preparados M13). </li><li> Una repetición de la preparación de la plantilla puede hacer fácilmente varios mililitros de la plantilla de concentración nanomolar, suficiente para cientos de miles de experimentos de una sola molécula. </li></ol> 2. Cubreobjetos funcionalizados Para unir el ADN a la cubreobjetos de vidrio, el vidrio es el primer funcionalizados con un aminosilano, que se acopla a las moléculas de PEG con biotina. Esta capa ayuda a reducir las interacciones no específicas de ADN y las proteínas de replicación con la superficie de 1,3. Materiales: cubreobjetos de vidrio, cubetas, 3-aminopropiltrietoxisilano, éster de metoxi-PEG5k-NHS, biotina-PEG5k NHSester, acetona, KOH 1M, etanol, horno, baño de ultrasonido <ol><li> Limpiar a fondo el cubreobjetos de vidrio, colocándolas en la tinción de los frascos y llenar los frascos con etanol. Sonicar durante 30 minutos y enjuague los frascos y llenar con 1 M KOH. Sonicar durante 30 minutos Repita ambos lavados. </li><li> Para la reacción de funcionalización en primer lugar, todos los rastros de agua necesitan ser removidos. Llenad las tinajas de acetona y ultrasonidos durante 10 minutos. Enjuague los frascos una vez más con acetona. </li><li> Preparar un 2% v / v solución del reactivo de silano en acetona. Añadir a la cubetas y agitar durante 2 minutos. Esta reacción se acopla el grupo alcoxi de la aminosilano al vidrio, dejando una amina reactiva para la próxima etapa de acoplamiento. Detener la reacción con un gran exceso de agua. </li><li> Seque el cubreobjetos de hornearlas a 110 ° C en el horno durante 30 minutos. </li><li> Prepare una metoxi 50:1: biotina mezcla de PEG en 100 mM NaHCO 3 pH 8,2. Trate de alrededor del 0,2% w / v de PEG con biotina. </li><li> Pipetear 100 L de la mezcla de PEG en un portaobjetos seco silanizada y otro lugar cubreobjetos en la parte superior. Incluyendo un separador cubreobjetos permitirá la separación de las laminillas. </li><li> Incubar los cubreobjetos en la solución de PEG durante 3 horas, luego se separan cada par de cubreobjetos y lavar intensamente con agua. Tenga cuidado de mantener los cubreobjetos funcionalizada hacia arriba, ya que sólo una vez que lado va a ser recubierto con PEG. </li><li> Seque el cubreobjetos y guardar al vacío. Las superficies se mantienen estables durante al menos un mes, por lo que decenas de cubreobjetos se puede hacer en un lote y se utiliza según sea necesario. </li></ol> Estos materiales deben ser hechas antes de tiempo, y luego se usa para cada experimento. Para iniciar cada experimento de una sola molécula, comience el montaje de la cámara de flujo. 3. Preparación de la Cámara de flujo El experimento se realiza con una cámara de flujo sencillo construido con un cubreobjetos funcionalizados, cinta de doble cara, una diapositiva de cuarzo y tubos. Una cámara de flujo se prepara para el 1,4 experimento cada molécula. Materiales: cinta de doble cara, una hoja de afeitar, diapositivas de cuarzo con agujeros para la tubería, de secado rápido epoxi, cubreobjetos funcionalizados (ver arriba), la solución de estreptavidina (25 l de 1 mg / ml en PBS), tubos, tampón de bloqueo (20 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg / ml de BSA, 0,005% de Tween-20) <ol><li> Comience colocando 20-25 ml de tampón de bloqueo en un desecador para eliminar cualquier burbuja de aire para los pasos posteriores. </li><li> Tome un cubreobjetos PEG-funcionalizados y la propagación de la solución de estreptavidina 125 PBS diluido a lo largo de la superficie. Dejar esta tarea a incubar durante 20 minutos mientras se preparan otras partes de la cámara, permitiendo estreptavidina para unirse Biotins superficie. </li><li> Corte un pedazo de doble carad cinta que coincida con el tamaño de la diapositiva de cuarzo. Marque la posición de los orificios de la tubería en la cinta con un lápiz de modo que un esquema de la cámara de flujo se pueden extraer de la cinta (1 mg / ml). </li><li> Hacer una de 2 mm de ancho rectángulo alrededor de los agujeros. Esto servirá como canal de flujo, así que asegúrese de que los lados rectos y dejar espacio alrededor de la entrada y la salida de la tubería. Si lo desea, los canales múltiples o diferentes tamaños se pueden utilizar. </li><li> Corte a lo largo de la línea trazada, por lo que los cortes rectos y limpio para asegurarse de que no sobresale adhesivo en el canal. </li><li> Limpiar el cuarzo a fondo con acetona o etanol para quitar el adhesivo de la construcción de flujo de la celda anterior. </li><li> Encontrar la mejor alineación de las líneas de canal, eliminar una parte de la superficie adhesiva y colocar con cuidado la cinta en el portaobjetos de cuarzo. Tenga cuidado de alinear correctamente la cinta, ya que los orificios de entrada y salida deben permanecer bloqueados. </li><li> Cortar trozos de tubos para la entrada y salida de la celda de flujo. Que ayuda a cortar el extremo del tubo de aproximadamente un ángulo de 30 ° para que el tubo no se prensa plana contra el fondo de la cámara. Coloque los tubos en algún tipo de apoyo para suspender para la conexión fácil a la celda de flujo en los próximos pasos. </li><li> Enjuague el portaobjetos recubiertas de estreptavidina a fondo con agua y secar con aire comprimido. Recuerde que sólo un lado es funcionalizados, tenga cuidado de no convertir el cubreobjetos encima. Retire el otro lado del soporte de la cinta y colocar la placa de cuarzo en el cubreobjetos. </li><li> Presione suavemente el cubreobjetos para expulsar el aire atrapado en el adhesivo. Esto ayudará a evitar las burbujas de aire en el canal de flujo. </li><li> Sello de los lados de la cámara con epoxy. Inserte la tubería cortada en los agujeros del cuarzo y el sello en su lugar con epoxy. Esto tiene que secar por unos minutos. </li><li> Una vez seca, comenzará a bloquear la superficie tirando algunos de los buffer desgasificar el bloqueo a través de uno de los tubos. Una aguja de calibre 21 encaja perfectamente dentro de la tubería de 0,76 mm. Ras un par de veces para eliminar las burbujas de aire, y permitir que la cámara de incubación por lo menos durante media hora. </li></ol> 4. Una sola molécula de replicación Experimento Materiales: cámara de flujo preparado, SYTOX Orange, microscopio TIRF, 532 nm láser, CCD de la cámara, ordenador con software de adquisición de imágenes, círculo rodante sustrato de ADN, las proteínas de replicación <ol><li> Después de la celda de flujo ha sido bloqueado, todo está listo para comenzar el experimento de una sola molécula. </li><li> Tome la celda de flujo y colocarlo en la platina del microscopio. Mantenga la cámara en su lugar con clips de la etapa y estar seguro de que el canal de flujo esté recto a lo largo del eje. </li><li> Conecte el tubo de salida de la celda de flujo de la bomba de jeringa con un tubo de diámetro de conector más grande o una aguja. Coloque la entrada en tampón de bloqueo y tire hacia atrás de la jeringa para eliminar el aire en el tubo. Un movimiento suave del tubo de salida va a ayudar a eliminar las burbujas de aire atrapadas en la celda de flujo. </li><li> Diluir la plantilla de ADN de valores a 25 pM en 1 ml de tampón de bloqueo. Flujo en la cámara a una velocidad moderada para permitir el flujo de cobertura de la superficie buena de ADN. 0.025 ml / min durante 30 minutos funciona bien. Esto puede variar según el número de moléculas de ADN están en la superficie de cada lote de cubreobjetos o cuántos se desean para el experimento. </li><li> Una vez que el ADN se encuentra en, lavar el exceso de ADN con el tampón de bloqueo. Lávese las manos por lo menos 200 células de flujo de los volúmenes de deshacerse de todo el ADN libre. </li><li> Comience desgasificación del búfer de duplicación. Para el E. experimentos coli la replicación, haga lo siguiente a 37 ° C para reducir el riesgo de burbujas en la cámara de flujo caliente. </li><li> Encienda el láser y la cámara. El CCD enfriado las necesidades para alcanzar la temperatura antes de que pueda ser utilizado. </li><li> Si se realiza a 37 ° C experimento, a su vez la calefacción. Asegúrese de que el objetivo está en contacto con la celda de flujo o será un disipador de calor más tarde. </li><li> Después de lavar y la desgasificación, la reacción puede ser preparado. Nucleótidos mezcla, la TDT, y SYTOX en el buffer de la replicación. A continuación, añadir proteínas y mezclar suavemente. </li><li> El flujo de la mezcla de reacción en la celda de flujo. Esta velocidad de flujo debe ser suficiente para estirar dsDNA. Para un niño de 2 mm de ancho, de 100 m de altura canal de flujo de 0,04 ml / min funciona bien. </li><li> Dé tiempo para que la mezcla entre en la cámara y comenzará a marcar. Un buen consejo es mover el campo de visión hacia el lado del canal y se centran en el material adhesivo. Esto asegurará que se encuentran cerca de la superficie para enfocar. </li><li> Ajustar la potencia del láser, el enfoque microscopio, y el ángulo TIRF. Mantener el bajo consumo de energía para evitar cualquier photocleavage del ADN de colores. Adquirir en 5.1 fotogramas / segundo durante varios minutos dependiendo de la tasa de replicación del ADN. Si lo desea, repita a ser más largas trayectorias de replicación o trasladarse a un nuevo campo para ver más moléculas. </li><li> Después de la mezcla de reacción está casi vacío, es una buena idea para el flujo de más de amortiguación con SYTOX para ver otros campos de la vista. Tomar varias imágenes de diferentes moléculas replicadas proporciona estadísticas para la determinación de procesividad. </li></ol> 5. Resultados representante Moléculas de replicación activa son fácilmente visibles como líneas de crecimiento de ADN manchado. En nuestros experimentos, que fluye 25 horas del sustrato M13 ofrece 100-1000 moléculas en un 60x, 125 m x 125 m de campo de vista (Figura 1). La realización de experimentos de replicación utilizando el E. proteínas coli replisoma a 37 ° C (ver Materiales para más detalles) le da réplica moléculas 50-50 por campo de visión. En concentraciones equivalentes de la replisoma T7, que inicia en el sustrato mucho más eficiente, se observa&gt; 70% de las moléculas en un campo de replicar. Estas condiciones producen una densidad del producto tan alto que las moléculas individuales son difíciles de resolver y analizar, de modo que los experimentos T7 se realizan en las concentraciones de proteína más bajos. Análisis de datos: Para obtener la velocidad de datos, simplemente trazar el punto final de la ADN en función del tiempo y calcular la pendiente (Figura 2). Para procesividad, determinar la longitud total del ADN. Ambos de estos números tendrán que convertirse en pares de bases. Antes de realizar el experimento, usted debe saber el tamaño en píxeles de la cámara en un aumento adecuado. Para la conversión de pares de bases, una buena estimación es simplemente la conversión sobre la base de la longitud de cristalografía de ADN, 2,9 pb / nm. Sin embargo, el flujo laminar completamente no se estira el ADN, por lo que la calibración de la longitud del ADN se debe realizar mediante la adopción de un ADN de longitud conocida, por ejemplo, 48.502 pares de bases del ADN λ, adjuntando a la celda de flujo con un oligo biotinilado y medir su SYTOX manchada de longitud en el caudal utilizado para el experimento de replicación. Determinar el número de pares de bases / pixel permite un cálculo exacto de las tasas de repetición y processivities. Tomar numerosas imágenes y películas se ofrecen un gran número de moléculas de producto, lo que permite el trazado de las distribuciones de frecuencia y procesividad (Figura 2) 1. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: (De Ref 1.) Una historieta) de la prueba de la replicación de círculo rodante. (SA, estreptavidina). Principal capítulo de síntesis se extiende la cola que une el círculo y la superficie. La cola se convierte en ADN de doble cadena por la polimerasa de cadena retrasada y se extendía por el flujo laminar. b) Ejemplo de campo de visión con SYTOX Orange y 532 nm de excitación. Pequeñas manchas fluorescentes están atados, no replicado sustratos. Tenga en cuenta la eslora máxima de los productos y el gran número de productos por campo (cada celda de flujo contiene&gt; 5,000 campos de este tipo). <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: (adaptado de la Ref 1). A, b) Kymographs típica de las moléculas de la replicación del T7 (a) y E. coli (b) los experimentos. c) las trayectorias de extremos de las moléculas de a) y b) trazado en función del tiempo. Trayectorias están equipados con la regresión lineal para obtener las tasas de replicación. Ejemplos que se muestran son 99,4 pb s -1 y 467,1 pb s -1. d) Duración de la distribución de los productos de replicación, se ajustan a la decadencia exponencial simple para obtener procesividad: 25,3 ± 1,7 kpb (T7), 85,3 ± 6,1 kpb (E. coli). e) Tasa de las distribuciones de las trayectorias de una sola molécula, se ajustan a gaussianas sola. Medios: 75,9 ± 4,8 pb s -1 (T7), 535,5 ± 39 pb s -1 (E. coli).

<ol><li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27(2009).</li>
<li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+grafted+to+silicon+surfaces%3A+Grafting+density+and+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanner%2C+NA+%22DNA+replication%3A+Methods+and+protocols%22">DNA replication: Methods and protocols</a>. Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. 521, Humana Press. New York. 397-410 (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li>
</ol>

Un crítico de control es examinar el efecto de la mancha naranja, SYTOX, en la replicación de proteínas de interés. Una manera simple de hacer esto es llevar a cabo el experimento de replicación en la celda de flujo como se describe, pero con la omisión de SYTOX. Después de la mezcla de reacción ha fluido a través de la cámara, añadir tampón con SYTOX para teñir el ADN y examinar la distribución de la longitud de las moléculas de reproducirse. Por otra parte, las reacciones estándar a granel se pueden utilizar para comprobar ningún efecto sobre la tasa de SYTOX la replicación y la eficiencia. El experimento que se describe aquí sólo utiliza un canal de flujo único. Esto se puede cambiar fácilmente mediante la creación de canales múltiples cámaras de flujo o el uso de PDMS o similares dispositivos de microfluídica. Aumentar el número de canales facilita en gran medida de detección de las concentraciones de proteínas, mutantes, o moléculas inhibidoras y aumenta la rapidez de la replicación de recolección de datos. Como se ha mencionado, se realiza la E. experimentos coli la replicación a 37 ° C con una casa construida de aluminio calentador de flujo de células, un elemento de calefacción resistivo (calentador de cartucho) y fuente de alimentación variable. Esto le da estabilidad a la temperatura buena y evita la compra de un calentador de objetivo. Para calibrar la calefacción, simplemente un agujero en el centro de un importante flujo de celda de cuarzo, insertó un termopar en el canal de flujo y fluido de amortiguación de forma normal. La medición de la temperatura de la celda de flujo de amortiguación a tensiones cada vez permite un calentamiento preciso.

Replicación T7: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM de glutamato de potasio, cloruro de magnesio 10 mM, 100 mg / ml BSA, con 5 mM de ditiotreitol, 600 mM dNTPs, 300 mM ATP, 300 M CTP y 15 nM SYTOX naranja añadido inmediatamente antes de uso. Proteínas añadidas como: 5 nM gp4 (hexamer), 40 nM de la polimerasa (1:1 GP5: tiorredoxina), 360 nm gp2.5 1,5. E. coli replicación: HEPES 50 mM pH 7,9, 12 mM de acetato de magnesio, cloruro de potasio 80 mM, 100 ug / ml de BSA con mM ditiotreitol 10, 40 mM dNTPs, 200 rNTPs M, y 15 nM SYTOX naranja añadido inmediatamente antes del uso. Proteínas añadidas como: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monómero), 30 nM αεθ, 15 nM τ γ 2 1 δδ&#39;χψ o τ 3 δδ&#39;χψ, 30 β nM (dímero), 300 nM dnaG, 250 nM SSB (tetrámero), 20 nM Pría, 40 nM PriB, 320 nM Pric, 480 nM DNAT 1,6

visualización de una sola molécula de adn de replicación con microscopía de fluorescencia

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Se describe un simple microscopía de fluorescencia basada en tiempo real el método para la observación de la replicación del ADN en el ámbito de una sola molécula. Una plantilla circular, ADN horquilla se une a un cubreobjetos funcionalizados y reproducido ampliamente después de la introducción de las proteínas de replicación y los nucleótidos (Figura 1). Los productos de mayor crecimiento de doble cadena de ADN (dsDNA) se amplía con flujo laminar y se visualizan mediante el uso de un colorante intercalante. La medición de la posición del extremo del ADN que crecen en tiempo real permite la determinación precisa de la tasa de replicación (Figura 2). Además, la duración de los productos de ADN completó los informes sobre la procesividad de la replicación. Este experimento se puede realizar con mucha facilidad y rapidez, y sólo requiere un microscopio de fluorescencia con una cámara bastante sensible.

Este protocolo demuestra un sencillo de una sola molécula de la técnica de microscopía de fluorescencia para la visualización de la replicación del ADN por replisomes individuales en tiempo real.

Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

Describimos un método sencillo en tiempo real, basado en microscopía de fluorescencia, para observar la replicación del ADN a nivel de molécula individual. Un ADN circular y bifurcado...

En esta técnica, las laminillas de vidrio se funcionalizan con una mezcla de moléculas de PEG inertes y biotiniladas. Se crea una celda de flujo con esta superficie funcionalizada y se coloca en un microscopio TIRF. Las plantillas de amplificación por rolling circle biotiniladas se fijan a la superficie utilizando estreptavidina multivalente.Cuando los sustratos se replican mediante la adición de proteínas de la zona de replicación y nucleótidos, el ADN bicatenario resultante se extiende mediante flujo laminar y se visualiza en tiempo real utilizando un colorante intercalante. Hola, soy Nathan Tanner del laboratorio de Antoine Van Oijen en el Departamento de Química Biológica y Farmacología Molecular de la Escuela de Medicina de Harvard. Soy Joe Loparo, también del laboratorio de Van Oijen.Hoy les mostraremos un procedimiento para la obtención de imágenes de fluorescencia de la replicación del ADN en tiempo real a nivel de molécula individual. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las actividades coordinadas de síntesis de ADN de complejos de replicación individuales. Así que comencemos.Para comenzar este procedimiento, anile el oligo con cola biotinilada al ADN monocatenario M13 añadiendo un exceso diez veces mayor de oligo en tampón TBS, calentando a 65 grados Celsius y luego apagando el bloque térmico para permitir un enfriamiento lento que permita la correcta hibridación del cebador. Ahora que el cebador M13 está listo, añádalo a una mezcla de 64 nanomolares de polimerasa T7 y tampón de replicación T7 que contiene dNDPs y cloruro de magnesio, e incube la reacción a 37 grados Celsius durante 12 minutos. Al final de la incubación, detenga la reacción con EDTA 100 milimolar.A continuación, purifique el ADN del producto rellenado mediante extracción con fenol-isoamilo-alcohol-cloroformo y diálisis en tampón TE u otro tampón de almacenamiento adecuado. Realice extracciones posteriores de cada fase orgánica para recuperar cualquier cebador residual. Tras la diálisis, determine la concentración de ADN mediante un espectrofotómetro UV-vis. Una sola iteración de preparación de la plantilla puede generar una concentración nanomolar suficiente de plantilla para cientos o miles de experimentos de molécula individual.Ahora que el ADN está listo, proceda a preparar las laminillas funcionalizadas. El ADN que se va a replicar se une a laminillas de vidrio funcionalizadas con Amil Lane, en las que el grupo Oxy del Amil se enlaza al vidrio, dejando un amin disponible para unir moléculas de peg biotiniladas. Este recubrimiento ayuda a reducir la unión no específica a la superficie.Para limpiar completamente las laminillas de vidrio, colóquelas en frascos para tinción y llene los frascos con etanol sometido a sonicación. Enjuague los frascos durante 30 minutos, luego llénelos con hidróxido de potasio uno molar y sométalos a sonicación durante 30 minutos; repita ambos lavados. Para la primera reacción de funcionalización, es necesario eliminar todos los rastros de agua.Llene los frascos de tinción con acetona y sométalos a sonicación durante 10 minutos. Vacíe los frascos y llénelos nuevamente con acetona. A continuación, añada el reactivo sine a los frascos y agite durante dos minutos.Luego, enfríe con un gran exceso de agua. A continuación, seque las laminillas horneándolas a 110 grados Celsius durante 30 minutos. Después, prepare la mezcla de PEG al aproximadamente 0,2 % peso por volumen mediante PEG aminado; incluya un espaciador de laminilla de vidrio para permitir la separación de las laminillas, y agregue 100 microlitros mediante pipeta sobre una laminilla silanizada seca.Coloque un segundo cubreobjetos encima. Incube los cubreobjetos en la solución de PEG durante tres horas. Luego, separe cada par de cubreobjetos y lávelos extensamente con agua.Tenga cuidado de mantener los cubreobjetos con el lado funcionalizado hacia arriba, ya que solo un lado estará recubierto con peg. Finalmente, seque los cubreobjetos con aire comprimido y guárdelos al vacío en un desecador; las superficies permanecen estables durante al menos un mes. Así, se pueden fabricar docenas de cubreobjetos en un lote y utilizarlos según sea necesario.Ahora que los cubreobjetos están listos, se puede armar la cámara de flujo para el experimento de molécula individual. Comience colocando de 20 a 25 mililitros de tampón bloqueante que contenga BSA en un desecador para eliminar cualquier burbuja de aire en pasos posteriores. A continuación, diluya 25 microlitros de estreptavidina en 100 microlitros de PBS y extienda la solución sobre la superficie de un cubreobjeto funcionalizado con perno, incube durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir que la estreptavidina se una a la biotina de la superficie mientras prepara las otras partes de la cámara.Mientras la cubreobjetos está incubando, corte un trozo de cinta adhesiva doble cara con respaldo en ambos lados de modo que coincida con el tamaño del portaobjetos de cuarzo utilizado para armar la cámara de flujo. Marque la posición de los orificios para los tubos en la cinta con un lápiz para poder dibujar un contorno de la cámara de flujo sobre la cinta. Después de marcar los orificios, haga un rectángulo de dos milímetros de ancho alrededor de las marcas.Este rectángulo servirá como canal de flujo, por lo que asegúrese de hacer lados rectos y dejar espacio alrededor de la entrada y salida del tubo. Ahora corte la cinta marcada siguiendo el contorno dibujado, realizando cortes rectos y limpios para garantizar que ningún adhesivo sobresalga hacia el canal. Limpie cuidadosamente la lámina de cuarzo utilizando acetona para eliminar el adhesivo proveniente de la construcción de la celda de flujo utilizada en experimentos anteriores.Encuentre la mejor alineación del contorno del canal. Retire un lado del respaldo adhesivo y coloque cuidadosamente la cinta sobre la portaobjetos. Tenga cuidado de alinear correctamente la cinta, ya que los orificios de entrada y salida deben permanecer desbloqueados.A continuación, prepare trozos de tubo de 0,76 milímetros de longitud para la entrada y salida de la celda de flujo. Es útil cortar el extremo del tubo con un ángulo de aproximadamente 30 grados para que el tubo no quede plano contra el fondo de la cámara. Sujete los tubos en gradillas para tubos de ensayo para facilitar su conexión a la celda de flujo en los siguientes pasos.Hasta ahora, la incubación del cubreobjetos ha finalizado. Enjuague bien el cubreobjetos recubierto con strep avid ENC con agua y séquelo utilizando aire comprimido. Tenga cuidado de no dar la vuelta al cubreobjetos, ya que solo un lado está funcionalizado.Finalmente, complete el ensamblaje de la cámara de flujo retirando el otro lado del respaldo adhesivo y colocando el portaobjetos de cuarzo sobre el cubreobjetos. Presione ligeramente el cubreobjetos para expulsar cualquier aire atrapado en el adhesivo. Esto ayudará a prevenir que se formen burbujas de aire en el canal de flujo.Selle los lados de la cámara con epoxi. Inserte el tubo cortado en los orificios del cuarzo y séllelo con epoxi; deje secar durante unos minutos. Cuando el sellado con epoxi esté seco, comience el bloqueo de la superficie.Utilizando una aguja de 21 gauge. Aspire un poco del tampón de bloqueo Degas a través de uno de los tubos. Lave varias veces para eliminar las burbujas de aire y deje que la cámara incube durante al menos media hora antes de pasar al experimento de replicación de molécula individual.Ahora que la celda de flujo ha sido bloqueada, colóquela sobre la platina del microscopio. Sujete la cámara en su lugar con pinzas de la platina y asegúrese de que el canal de flujo esté alineado a lo largo del eje y. Conecte el tubo de salida de la celda de flujo a la bomba de jeringa utilizando un tubo conector de mayor diámetro.Coloque la entrada en tampón de bloqueo y tire suavemente del émbolo de la jeringa para eliminar cualquier aire presente en el tubo. Un ligero golpe en el tubo de salida ayudará a eliminar las burbujas de aire atrapadas en la celda de flujo. A continuación, agregue el ADN, diluya la plantilla de ADN stock hasta 25 picomolares en un mililitro de tampón de bloqueo y hágala fluir hacia la cámara a un flujo moderado, como 0,025 mililitros por minuto durante 30 minutos, para permitir una buena cobertura superficial del ADN.Una vez que el ADN esté en la cámara, elimine el exceso de ADN mediante un lavado con tampón bloqueante durante al menos 200 volúmenes de la celda de flujo. Para eliminar todo el ADN libre, encienda el láser y la cámara. El CCD refrigerado debe alcanzar la temperatura adecuada antes de poder utilizarse.Después de eliminar el exceso de ADN y desgasificar el tampón de replicación, prepare la mezcla de reacción de replicación con nucleótidos, DTT y citoxina en el tampón de replicación. A continuación, agregue las proteínas y mezcle suavemente. Luego, haga fluir la mezcla de reacción dentro de la celda de flujo.La velocidad del flujo aquí debe ser suficiente para estirar el ADN de doble cadena en un canal de flujo de dos milímetros de ancho y 100 micrómetros de alto; 0,04 mililitros por minuto funciona bien. Deje tiempo para que la mezcla entre en la cámara, aproximadamente 10 minutos.Mueva el campo de visión hacia el lateral del canal y enfoque el material adhesivo para asegurarse de que está cerca de la superficie antes de enfocar y comenzar la adquisición de imágenes. Ajuste la potencia del láser, el enfoque del microscopio y el ángulo del césped. Mantenga la potencia baja para evitar cualquier escisión por fotoablation del ADN marcado.Adquiera de uno a cinco cuadros por segundo durante varios minutos, dependiendo de la velocidad de replicación del ADN. Repita el proceso para obtener trayectorias de replicación más largas o muévase a un nuevo campo para observar más moléculas cuando casi toda la mezcla de reacción haya sido impulsada hacia la célula; agregue más tampón con cit para visualizar otros campos de observación. Tomar múltiples imágenes de diferentes moléculas replicadas proporciona estadísticas para la determinación de la productividad.En el círculo de rodadura. En el ensayo de replicación, la síntesis de la hebra conductora extiende la cola que une el círculo y la superficie; luego, la cola se convierte en ADN bicatenario mediante la polimerasa de la hebra rezagada y se estira por flujo laminar, como se muestra. A continuación se presenta un ejemplo de campo de visión con citrino de naranja con excitación a 532 nanómetros.Los pequeños puntos fluorescentes son sustratos anclados no replicados. Observe la longitud extrema de los productos y el gran número de productos por campo. Un campo típico mostrará numerosas moléculas en replicación visibles como líneas brillantes alargadas de ADN teñido. Los experimentos con E. coli a 37 grados Celsius producen de cinco a cincuenta moléculas por campo, dependiendo de la densidad superficial.La zona de replicación de T7 inicia mucho más eficientemente y replicará más del 50 % de las moléculas en un campo. Con una densidad tan alta, es difícil resolver moléculas individuales como se observa aquí. Por lo tanto, realice el experimento con T7 a concentraciones de proteína más bajas o a menor densidad superficial. Los gráficos Chime de moléculas replicantes típicas provenientes de experimentos con E. coli y T7 incluyen trayectorias finales de moléculas de E. coli y T7 trazadas en función del tiempo. Las trayectorias se ajustan mediante regresión lineal para obtener tasas de replicación, que en este ejemplo son de 467,1 pares de bases por segundo para E. coli y 99,4 pares de bases por segundo para T7.Para T7, las distribuciones de tasas de trayectorias de moléculas individuales ajustadas con gaussianas individuales dan una media de 535,5 ± 39 pares de bases por segundo para E. coli y 75,9 ± 4,8 pares de bases por segundo. Para T7, las distribuciones de longitudes de los productos de replicación se ajustan con una descomposición exponencial simple para obtener la productividad, que es de 85,3 ± 6,1 kilopares de bases para E. coli y 25,3 ± 1,7 kilopares de bases para G7. A continuación, les hemos mostrado cómo medir la replicación coordinada del ADN con moléculas individuales.Al realizar este procedimiento, es importante recordar funcionalizar adecuadamente las laminillas y crear canales de flujo limpios y rectos. Asegúrese de mantener baja la potencia del láser y minimizar la fotoclisis del ADN de larga longitud. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

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