Concentración, la carga, y la alineación de una célula de ultracentrifugación analítica de muestras
5 de noviembre de 2009
La ultracentrifugación analítica (AUC) de células de la muestra tiene la muestra y el tampón de referencia y durante los experimentos y se expone a alto vacío y la velocidad del rotor de hasta 60.000 rpm. Este vídeo demuestra la rigurosa atención a los detalles necesarios para la concentración, la carga y la alineación de este componente muy importante de un experimento AUC.
Hola, soy Andrea Balbo. Trabajo en el grupo de Peter Shucks en los Institutos Nacionales de Salud. En este vídeo, vamos a mostrarle nuestros procedimientos para el montaje, la carga y la alineación del rotor de una celda de muestra de ultracentrífuga analítica.
Empecemos. Reunido. Estos son los componentes de una celda de muestra de ultracentrífuga analítica Apilada dentro de la carcasa de la celda hay un campo de carbón de doble sector de 12 milímetros, pieza central de epón que se intercalará entre dos conjuntos de ventanas. Cada conjunto de ventana consta de una junta de ventana, un revestimiento de ventana y una ventana sostenida dentro del soporte de ventana.
Luego, estas piezas se deslizarán hacia abajo dentro de la carcasa de la celda alineando sus chaveteros con la llave que se encuentra dentro del barril de la carcasa, una junta de la carcasa y luego un anillo de tornillo cerró la celda de muestra con una presión de torque de entre 120 y 140 libras de pulgada. Después de cargar su muestra en referencia, dos juntas de tapón de carcasa y un tapón de carcasa sellan los orificios de carga de la celda para evitar artefactos de escaneo, fugas y roturas durante los experimentos, es vital que todos los componentes estén limpios, secos, libres de polvo y en las mejores condiciones posibles, examínelos con frecuencia y reemplácelos cuando sea necesario. También necesitará lo siguiente, una ultracentrífuga analítica, un rotor de titanio de cuatro orificios, una balanza de laboratorio, una llave dinamométrica con un dial legible y un soporte de par, un contrapeso y contrapesos, un destornillador de cabeza plana, un par de pinzas, una pipeta de 200 microlitros equipada con una punta de pipeta cónica larga, herramientas de alineación y lubricante de spin coat.
Comenzamos la construcción de celdas de muestra juntando dos conjuntos de ventanas. Primero coloque una junta de ventana en la parte inferior del soporte de la ventana. A continuación, coloque el revestimiento de la ventana, o a veces se llama cojín de la ventana dentro del soporte de la ventana, de modo que la abertura del revestimiento esté opuesta al chavetero del soporte en un ligero ángulo.
A continuación, coloque la ventana en el soporte, alineando la marca de trazado de la ventana con el chavetero del soporte de la ventana. Presione suavemente hacia abajo en los bordes a ambos lados de la ventana. Para garantizar un sellado adecuado y un twerking preciso de la celda de muestra, recubrimos ligeramente la junta de la carcasa con el anillo de tornillo.
Con el lubricante de spin coat, esparce una cantidad muy pequeña de spin coat entre el pulgar y el índice. Cubra las roscas de los anillos de tornillo con una película delgada e invisible de spin coat. Del mismo modo, cubra la junta de la carcasa.
Limpie cualquier lubricante visible. Para comenzar el ensamblaje de la celda de muestra. Deslice un conjunto de ventana con la ventana hacia arriba hacia usted en la carcasa de la celda alineando el chavetero con la llave de la carcasa.
Alinee el chavetero de la pieza central con la llave de la carcasa y déjela caer suavemente sobre el conjunto de la ventana dentro de la carcasa. Nunca use ningún tipo de herramienta para empujar la pieza central dentro de la carcasa de la celda. Esto podría causar daños permanentes a la pieza central, lo que resultaría en experimentos de almacenamiento con fugas.
Gire el segundo conjunto de ventana de modo que la ventana quede orientada hacia la pieza central y lejos de usted. Alinee el chavetero con la llave de la carcasa y deslícelo hacia abajo sobre la pieza central. Coloque la junta de la carcasa en la parte superior.
A continuación, un anillo de tornillo para que la palabra fuera visible. Con los dedos. Luego, una herramienta de alineación, apriete a mano el anillo del tornillo.
A veces, la pieza central no se desliza fácilmente en el cañón de la carcasa. Primero puede alinearlo y, a continuación, colocar el segundo conjunto de ventana encima. Aplicando una suave presión hacia abajo sobre el conjunto de la ventana.
Puede deslizar ambos en la carcasa de la celda al mismo tiempo. De esta forma, evitamos presionar directamente sobre el centro de mesa. Ahora es un buen momento para buscar en la celda polvo, pelusas y huellas dactilares.
También notarás los anillos de Newton que indican que todavía hay aire entre la pieza central y las ventanas. Estos desaparecerán después de apretar con el anillo del tornillo hacia arriba y la palabra fuera visible. Coloque la celda de muestra completamente hacia abajo dentro de la celda.
Boquilla de par del soporte de par. Mantenga la celda en su lugar aplicando presión constante sobre el mango del soporte de torsión. En un movimiento continuo, apriete el anillo del tornillo entre 120 y 140 libras de pulgada.
Suelte la manija del soporte de torsión y retire con cuidado la celda de muestra. Rutinariamente cargamos un volumen de 400 microlitros en cada sector de la pieza central de 12 milímetros. Con una pipeta de 200 microlitros, coloque la celda de muestra con los orificios de carga en la parte superior y la palabra en el anillo de tornillo visible.
Deslice la punta de la pipeta hasta la mitad hacia abajo en el sector central izquierdo a través de los orificios de carga y dispense lentamente 200 microlitros de solución de referencia. Repita una vez hasta un total de 400 microlitros utilizando la misma punta de pipeta y la misma técnica con cuidado y lentamente. Llene el sector derecho de la pieza central con 400 microlitros de solución de muestra.
Es imperativo hacer coincidir los volúmenes de las soluciones de referencia y de muestra lo más cerca posible. Colocar la punta de la pipeta firmemente en la pipeta, cargar y dispensar lentamente las soluciones, evitar la carga de burbujas y utilizar la misma punta de pipeta para ambas soluciones. Todo ayuda a mantener los volúmenes iguales para sellar la celda.
Coloque dos juntas rojas de tapón de carcasa bien ajustadas en cada orificio de carga, asegurándose de que estén colocadas cuidadosamente entre la pieza central y la carcasa de aluminio. Cubra cada orificio de carga con un tapón de carcasa y apriételo a mano con un pequeño destornillador de cabeza plana. Antes de cargar el rotor, asegúrese de que el contrapeso y la celda que estará opuesta al contrapeso tengan un peso de 0,5 gramos entre sí.
Comience con un saldo en cero. Primero, pese una celda de muestra que estará en posición opuesta al contrapeso. Rasgue la balanza para restar el peso de la celda de la muestra.
A continuación, pesa el contrapeso. Aquí encontramos que el contrapeso es 4.193 gramos más ligero que la celda de muestra. Seleccione un contrapeso de cuatro gramos y atorníllelo en el orificio de fijación del contrapeso, asegurándose de que no sobresalga de la parte superior.
Vuelva a encender el contrapeso para asegurarse de que el peso final esté dentro de los 0,5 gramos. Usando un rotor de cuatro orificios, coloque el contrapeso en la posición cuatro de modo que la flecha blanca sea visible y apunte en la dirección de la fuerza centrífuga. Con una herramienta de alineación, asegúrese de que esté completamente dentro del rotor.
Coloque la celda de muestra de balanza con los tapones de la carcasa hacia el centro del rotor y la palabra en el anillo del tornillo visible. Nuevamente, usando una herramienta de alineación, asegúrese de que esté completamente dentro del rotor. Mirando desde abajo del rotor.
Alinea el interior. Trazador, marque la marca más cercana al centro del rotor con la marca de trazado en el contrapeso Utilizando una herramienta de alineación. De la misma manera, alinee la celda de muestra en la posición dos.
Una vez que todas las celdas están alineadas, el rotor está listo para su colocación en la cámara de centrífuga.
Visión general
Este video demuestra el ensamblaje, carga y alineación de una célula de muestra de ultracentrifugadora analítica (AUC), lo cual es crucial para los experimentos de AUC. Se enfatiza el manejo y preparación adecuados de los componentes de la célula de muestra para garantizar resultados precisos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Ultracentrifugación analítica
- Métodos biofísicos
- Técnicas de preparación de muestras
Antecedentes
- La célula de muestra de AUC es esencial para realizar experimentos a altas velocidades de rotor.
- Consiste en múltiples componentes que deben ensamblarse con precisión.
- Mantener la limpieza y la alineación adecuada es crítico para evitar artefactos experimentales.
- Entender el proceso de ensamblaje es vital para los investigadores que usan AUC.
Propósito del estudio
- Proporcionar una guía detallada sobre cómo ensamblar y cargar una célula de muestra de AUC.
- Destacar la importancia de una preparación meticulosa en los experimentos de AUC.
- Asegurar que los investigadores puedan replicar el proceso con precisión.
Métodos utilizados
- Ensamblaje de los conjuntos de ventanas y el centro en la célula de muestra.
- Aplicación de torque para asegurar los componentes de la célula de muestra.
- Carga de soluciones de referencia y muestra en la célula.
- Equilibrado de la célula de muestra con un contrapeso para mediciones precisas.
Resultados principales
- Ensamblaje exitoso de la célula de muestra de AUC demostrado en el video.
- Las técnicas de carga adecuadas aseguran burbujas mínimas y volúmenes iguales.
- Los ajustes del contrapeso son cruciales para un rendimiento preciso del rotor.
- Indicadores visuales, como los anillos de Newton, ayudan a evaluar la calidad del ensamblaje.
Conclusiones
- La atención al detalle en el ensamblaje de la célula de muestra es esencial para los experimentos de AUC.
- Seguir los procedimientos descritos puede mejorar la confiabilidad experimental.
- Se recomienda el mantenimiento e inspección regular de los componentes.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Proper assembly and alignment of analytical ultracentrifuge sample cells are critical for generating reliable biophysical data on protein size, shape, purity, and oligomerization states. Meticulous sample cell preparation minimizes experimental artifacts, ensuring data integrity for target validation and mechanistic studies in early drug discovery. This procedural rigor supports predictive confidence in downstream screening and lead optimization workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise determination of protein oligomerization states and protein-protein interactions, directly informing target validation hypotheses.
- Operational Value: Provides label-free, solution-based assessment of macromolecular properties under near-native conditions.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity in target de-risking by delivering quantitative sedimentation coefficients and shape parameters.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers hydrodynamic size and shape data essential for assay buffer formulation and stability screening.
- Operational Value: Ensures sample integrity and monodispersity, critical for reproducible biochemical and cell-based assays.
- Platform Integration: Supports biophysical characterization of purified targets prior to high-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables assessment of protein complex formation and conformational changes relevant to disease mechanisms.
- Operational Value: Supports lot-to-lot consistency checks of recombinant proteins used in preclinical models.
- Translational Continuity: Bridges biophysical target characterization with functional assays in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The analytical ultracentrifuge sample cell workflow integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform go/no-go decisions based on target behavior and stability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of target oligomerization and interaction networks, enabling biological de-risking prior to assay development.
- Screening: Ensures target monodispersity and stability, directly impacting assay readiness and data quality in screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative sedimentation coefficient and molecular weight measurements that allow comparison of protein states under varying conditions.
- Translational Research: Connects purified target biophysics to functional validation in preclinical models through consistent material quality.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, reusable capability for biophysical characterization across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target properties, reduction of mechanistic ambiguity, and improved target validation rigor.
- Operational Value: Standardized sample preparation, reproducibility across runs, and scalability across laboratories.
- Strategic Value: Better-informed go/no-go decisions, reduced failure rates due to target instability, and improved capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted target prioritization based on biophysical de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biophysical techniques and precision handling of optical components.
- Dependent on analytical ultracentrifuge instrumentation, torque wrenches, alignment tools, and cleanroom-compatible sample handling.
- Necessitates cross-team standardization of cleaning, assembly, and torque application protocols.
- Involves adaptation considerations for different sample types, buffer conditions, and centerpiece geometries.
- Limited by component fragility; windows and centerpieces are susceptible to damage from particulates, improper torque, or misalignment.
