Sistema Automatizado de Soltero mediciones de fluorescencia de la molécula de superficie inmovilizada Biomoléculas

Para estudiar la dinámica de moléculas individuales durante un período prolongado de tiempo, primero es necesario localizar las moléculas en el espacio. Esto se logra inmovilizándolas sobre la superficie de una celda microfluídica. El procedimiento comienza con el ensamblaje de la celda, que contiene cuatro cámaras donde se fijarán las biomoléculas.

Las cámaras están conectadas al exterior mediante capilares de entrada y salida. La celda se fabrica fusionando un disco de PDMS con un portaobjetos de cuarzo. Luego, la celda ensamblada se monta en el microscopio de fluorescencia y se conectan tubos flexibles a los capilares para permitir el intercambio fácil de soluciones a través de las cámaras, con el fin de activar primero la superficie para la inmovilización de moléculas, y a continuación hacer fluir una solución de BSA biotinilada a través de uno de los canales.

La BSA se absorberá en la cámara. Luego, haga fluir una solución de estreptavidina, que a su vez se unirá a la biotina. Finalmente, haga fluir su oligonucleótido biotinilado, el cual se unirá a la estreptavidina, anclando así la molécula de interés a la superficie del cubreobjetos de cuarzo.

Se hace fluir a través de la cámara un tampón de imagen diseñado para maximizar la estabilidad y la intensidad del tiempo de vida de los fluorocromos a una velocidad constante durante todo el período de adquisición. El sistema automatizado escanea diferentes secciones de la superficie en busca de moléculas que tengan fluorocromos donadores y aceptores, y luego las mueve una por una al volumen de detección, obteniendo para cada una una traza de intensidad de fluorescencia en el tiempo hasta que ambos fluorocromos se fotodesvanecen. Hola, soy Nicholas Dfi del laboratorio del profesor Miller en el departamento de ingeniería biomédica de la Universidad de Boston.

Hoy les mostraremos un procedimiento para obtener trazos de F de molécula individual a partir de ácidos nucleicos inmovilizados utilizando un equipo confocal. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la dinámica de ácidos nucleicos y las interacciones entre ácidos nucleicos y enzimas. Así que comencemos.

El Microfluid Excel se fabrica fusionando un disco de poli(dimetilsiloxano) o PDMS de dos milímetros de espesor, con un patrón definido, a una cubreobjetos de cuarzo recién limpiada. Para elaborar el disco de PDMS con patrón, combine 10 partes de base de elastómero de silicona con una parte de agente de curado, mezcle bien y desgasifique durante una hora en vacío. Una vez que la base de elastómero haya sido desgasificada, viértala suavemente en el molde de la celda microfluídica.

Deje que la mezcla de elastómero cure en una placa calefactora a 70 grados Celsius durante dos horas. Una vez curada, retire cuidadosamente el disco de PDMS del molde utilizando una cuchilla de afeitar. El disco de PDMS contiene cuatro cámaras rectangulares de 30 microlitros.

Fusionar el lado plano del disco de PDMS, el lado que no contiene los canales, a una ventana de vidrio de una pulgada mediante oxidación por plasma de ambas superficies durante 30 segundos. La ventana de vidrio contiene de ocho a dos orificios de dos milímetros en ambos extremos de los canales que fueron perforados previamente. A continuación, se inserta un tubo capilar de sílice fundida flexible de dos pulgadas de largo a través de cada orificio de la ventana de vidrio.

Para hacer esto, primero inserte una aguja y luego introduzca el tubo capilar hasta que alcance el canal. Selle los orificios de la ventana de vidrio utilizando un compuesto de moldeo de silicona de curado rápido, como Quick Cast. Enjuague los canales con etanol y agua después de activar la celda con plasma y una lámina circular de cuarzo de una pulgada limpiada recientemente con solución piraña durante 30 segundos.

Una el cubreobjetos al costado de la celda que contiene los canales. Ahora las cámaras están selladas. Deje la celda ensamblada curando durante la noche a temperatura ambiente.

Después de que el microfluídico ensamblado en Excel haya curado durante la noche, se coloca en un soporte hecho a medida y se monta en la platina del microscopio confocal para comenzar la activación de la superficie de la celda. Para la inmovilización de moléculas, conecte tubos flexibles a las capilares de la celda para facilitar la inyección de tampón mediante una jeringa y una aguja. A continuación, inyecte una solución de 0,1 miligramos por mililitro de BSA biotinilada en tampón A dentro del canal e incube durante al menos 30 minutos.

Después del flujo de incubación de 30 minutos, pase de 300 a 500 microlitros de tampón A para eliminar cualquier BSA biotinilada no absorbida del canal; tenga cuidado de no atrapar burbujas de aire en la cámara. A continuación, inyecte una solución de 0,1 miligramos por mililitro de STR din en tampón A e incube durante 15 minutos.

Después del flujo de incubación de 15 minutos, añada de 300 a 500 microlitros de tampón A para eliminar cualquier strep din no absorbido del canal. Como antes, evite atrapar burbujas de aire en la cámara. Finalmente, haga fluir una solución de tres a cinco picomolares del ejemplo biotinilado.

Para verificar la cobertura de las moléculas fluorescentes, se realiza un escaneo de la superficie. Incube la muestra biotinilada durante 10 minutos y repita el flujo de tampón. Como se mostró anteriormente, el tampón de imagenología o IB consiste en un sistema enzimático de eliminación de oxígeno y un inhibidor de estado triple, como trol, para que el IB se disuelva primero.

Cinco miligramos de trol se bloquean en 10 mililitros de tampón de glucosa mediante vortex durante unos minutos y agitación durante al menos 10 minutos. Filtre la solución y déjela desgasificar en vacío durante 10 minutos. Mezcle suavemente la solución de bloqueo TRO con la solución enzimática Glocky evitando la formación de burbujas de aire.

Llene el depósito con la solución IB. Luego, utilizando una bomba de jeringa mecánica, controle la velocidad de flujo haciendo pasar el IB a través del canal a una velocidad constante de cinco microlitros por minuto; burbujee gas argón en el depósito de IB para evitar que el oxígeno atmosférico se disuelva en el tampón. El escaneo de la superficie, la localización de moléculas y la adquisición de trazos de intensidad de molécula individual están controlados por el programa LabVIEW, que escanea áreas de 20 por 20 micrómetros cuadrados con una resolución de 0.2 micrómetros a una velocidad de 0.1 micrómetros por milisegundo.

Los datos del escaneo de superficie se procesan inmediatamente para obtener las posiciones ponderadas por intensidad de todos los píxeles por encima de las cuentas de fondo. Una vez localizadas las moléculas inmovilizadas, se trasladan una por una al volumen confocal y se registran las intensidades del fluoróforo donador y aceptor en función del tiempo hasta que ambos floros se fotodesvanecen. Luego, la platina se programa para moverse a un nuevo origen, a 100 milímetros de distancia, y se repite el proceso de escaneo.

Se muestra aquí el MICROFLUID Excel ensamblado. Estas son escaneos de superficie que muestran moléculas individuales en los canales verde donador y rojo aceptor. Se presentan algunas trazas típicas de moléculas individuales que muestran la intensidad del aceptor en rojo y la del donador en verde.

Acabamos de mostrarle cómo obtener trazas de moléculas individuales a partir de biomoléculas inmovilizadas utilizando un montaje confocal. Al realizar este procedimiento, es importante recordar hacer cada paso con cuidado y tomarse el tiempo necesario, ya que se trata de un experimento complejo. Eso es todo.

Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.