Name: Sistema Automatizado de Soltero mediciones de fluorescencia de la molécula de superficie inmovilizada Biomoléculas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-02T16:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Aprende a obtener trazas de FRET de moléculas individuales inmovilizadas en superficie mediante microscopía confocal automatizada. Este método permite estudiar la dinámica de ácidos nucleicos y sus interacciones con enzimas en tiempo real.

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Damos las gracias a Chandran Sabanayagam por su ayuda en el desarrollo del sistema, Josué Edel para el asesoramiento en el diseño del dispositivo de microfluidos y el personal del Instituto Rowland en la Universidad de Harvard para el mecanizado de piezas de la instalación. Reconocemos conversaciones útiles con los miembros del grupo Meller, en el Instituto Rowland y la Universidad de Boston, y los miembros del grupo T. Ha &#39;s de la UIUC para obtener información útil. Finalmente, agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias (PHY-0701207) y el Instituto Nacional de Salud (GM075893).

1 - Montaje de las células de microfluidos La célula de microfluidos se hace mediante la fusión de un patrón, 2 mm de espesor, polidimetilsiloxano (PDMS) de disco en una hoja de cubierta de cuarzo recién limpiado. El disco contiene cuatro PDMS 30 cámaras l rectangular que se accede por la entrada y salida flexibles capilares conectado a un tanque de regulación y una bomba de jeringa, respectivamente, para el control de flujo de buffer. La celda de flujo es compatible con su parte trasera por una ventana de vidrio y colocado en un soporte de la celda a medida que contiene un elemento termoeléctrico refrigerado por agua para regular la temperatura. <ol><li> Para hacer que el patrón PDMS disco, mezcla de 10 partes de base de elastómero de silicona con un agente de curado parte, mezclar bien y dejar de desgasificación durante 1 hora en el vacío. </li><li> Suavemente vierta la mezcla en el molde elastómero de células de microfluidos. En nuestro caso, se trata de una una &quot;oblea de silicio con cuatro tiras (1x10 1x10 4 x 3 x 300 m) a partir de fotosensible negativa. Deje esta para curar en un plato caliente a 70 ° C durante dos horas. </li><li> Retire con cuidado el disco curado PDMS del molde con una cuchilla de afeitar. Fundir el disco en una ventana de vidrio de 1&#39;&#39;(que contiene 8 x 2 mm de diámetro los agujeros previamente perforados en ambos extremos de los canales) por plasma oxidante ambas superficies durante 30 segundos. Fusionar las ventanas de cristal en el lado plano del disco PDMS (el lado que no contengan los canales). </li><li> Inserte una de 2 pulgadas de largo tubo flexible capilar de sílice fundida a través del agujero de cada ventana de vidrio, hasta que llegue al canal. Inserción de una aguja y luego sigue con el capilar puede facilitar este proceso. Selle los orificios ventana de cristal con un compuesto de curado rápido de fundición de silicona tales como Kwik-Cast. </li><li> Enjuague los canales con etanol y agua, y el plasma a activar la célula, junto con un recién limpiada, de 1 pulgada de deslizamiento circular cubierta de cuarzo de 30 segundos. Le recomendamos la limpieza de esta hoja de cubierta con pirañas *. Fusionar la hoja de la cubierta al lado de la celda que contiene los canales, sellado de las cámaras. </li><li> Salir de la celda se reunieron para curar toda la noche a temperatura ambiente. </li></ol> * Piranha es una solución de H 2 O 2 y H 2 SO 4 en proporciones 1:2,5. Para limpiar la cubierta se desliza, lavarlos en pirañas a 90 ° C durante 20 min. 2 - Activación de la superficie para la inmovilización de moléculas Para los estudios de ácido nucleico, el esquema de la superficie más simple consiste en la inmovilización primera capa un vaso o una hoja de cubierta de cuarzo con biotina albúmina de suero bovino (BSA) y luego con estreptavidina. Esto permite que la muestra con biotina a ser inmovilizada con una alta especificidad para el día a temperatura ambiente. <ol><li> Conecte el tubo flexible de los capilares de inyección de tampón fácil con una jeringa y aguja. </li><li> Se inyecta una solución de 0,1 mg / ml de BSA biotina en un buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, se filtra con filtros de 0,02 micras) en el canal y se incuba durante al menos 30 minutos. </li><li> Flujo de 300 a 500 l de tampón A para eliminar cualquier BSA biotina libre de los canales, teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire dentro de la cámara. </li><li> Se inyecta una solución de 0,1 mg / ml de estreptavidina en un buffer y se incuba durante 15 min. Luego repita el paso 3. </li><li> El flujo a través de una solución 5.3 pM de la muestra con biotina. Realizar una exploración de superficie para verificar la cobertura de moléculas fluorescentes. Si es necesario, aumentar la concentración de la muestra para obtener una mejor cobertura. Incubar durante 10 minutos y repita el paso 3. </li></ol> La célula de microfluidos está montado sobre una platina motorizada xy permite grueso (de hasta 25 mm) de movimiento con óptica codificada motores de corriente continua y fina (1 nm) de movimiento con dos de circuito cerrado actuadores piezoeléctricos (Physik Instrumente modelo M-014 o similar). Esto se puede hacer antes o después de la activación de la superficie para la inmovilización de la muestra. 3 - Preparación de la memoria intermedia de imagen (IB) El IB se compone de un sistema de oxígeno enzimática de barrido y un extintor de triplete, como Trolox. Desde el IB pasa a través del constante durante la noche, por lo menos 10 ml deben estar preparados de antemano. <ol><li> Prepare 10 ml de 0,8% w / v D-glucosa, por lo menos 35 mM Tris-HCl pH 8,0 y 50 mM de NaCl en agua destilada. La mayor concentración de buffer es importante por dos razones: Trolox disolución se acidifica la solución, y la reacción enzimática, también disminuirá el pH de la solución a través del tiempo. Puesto que esta solución tiene una larga vida útil que se puede almacenar como una solución de reserva. </li><li> Disuélvanse 5 mg de Trolox en el buffer preparado en el paso 1 por agitación durante un par de minutos y luego agitar durante&gt; 10 min. Trolox no es muy soluble en agua a pH&gt; 7, por lo que no se apresure este paso. Filtrar la solución con un filtro de 0,2 micras y dejar de desgasificación al vacío durante 10 minutos. </li><li> Prepare el &quot;gloxy&quot; solución enzimática mediante la mezcla de 60 l water, 20 l de tampón 5X A, 20 l de catalasa, una glucosa oxidasa mg y 100 l de 10 mg / ml de BSA. Filtrar la solución con un filtro de 0,22 micras centrífuga. </li><li> Mezclar suavemente el buffer de la etapa 2, &quot;gloxy&quot; solución desde el paso 3 para evitar la formación de burbujas de aire. </li><li> El flujo de la IB a través del canal a una velocidad constante de 5 l / min utilizando una bomba de inyección mecánica para controlar el caudal. Burbuja de gas argón en el depósito de IB para evitar que el oxígeno del aire se vuelva a disolver en el buffer. </li></ol> La exploración de la superficie, localización de la molécula y la adquisición de una sola molécula de huellas intensidad es controlada por un programa de LabView que permite la recopilación de datos automatizados 1. El programa escanea 20x20 m 2 zonas con una resolución de 0,2 micras, con una tasa de 0,1 m / ms. Los datos son procesados ​​inmediatamente para obtener la intensidad ponderada por la ubicación de todos los píxeles por encima de los recuentos de fondo. Una vez que las moléculas se encuentran inmovilizados, se mueven el uno por uno en el volumen confocal y las intensidades de los donantes y fluoróforo aceptor se registran como una función del tiempo hasta que ambos photobleach fluoróforos. El estadio está programado para pasar a un nuevo origen 100 m de distancia, y el proceso de exploración se repite. 4 - Resultados de la Representante A continuación se muestran algunas imágenes que muestran las células de microfluidos montado antes de la activación de superficie y después de ser montado en el microscopio listo para la inmovilización de moléculas. Si el canal se activa con éxito, escanea la superficie debe ser similar a los escáneres se muestra a continuación muestra las emisiones de los donantes colorante (verde) y receptor (rojo) después de la excitación directa de los donantes. Estas moléculas se mueven de uno en uno en el volumen de sondeo y la fluorescencia se registra el paso del tiempo hasta que ambos photobleach colorantes, como se muestra en los rastros sola molécula. A partir de las huellas como éstas se puede obtener la eficiencia de FRET que informa sobre la instantánea donante-aceptor de separación, que a su vez se utiliza para explorar la estructura y dinámica de las moléculas de interés biológico. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1: células de microfluidos con cuatro canales, cada uno con entrada / salida de los capilares. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2: Cell montado en el microscopio listo para las mediciones. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" /> Figura 3: Configuración de los SM-FRET mediciones. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 3. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Figura 5" border="0" /> Las figuras 4 y 5: canal rojo y el verde de una exploración de superficie de inmovilizado FRET moléculas excitadas con láser verde. Por favor, haga clic para ver una versión ampliada de <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">la figura 4</a> , o <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">la figura 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Figura 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Figura 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Figura 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Figura 9" border="0" /> Figuras 6, 7, 8 y 9: Intensidad de las trayectorias de los donantes (verde) y aceptor (rojo) fluoróforos etiqueta a una molécula de ADN 8, 10, 16 y 18 pares de bases de distancia. Por favor, haga clic para ver una versión ampliada de <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">la figura 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">figura 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">figura 8</a> , o <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">la figura 9</a> .

<ol><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Techniques%2C+a+Laboratory+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22CSHL+Press%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Pys.+Letters%22%5BJournal%5D)">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules%3A+Corrections+due+to+nonideal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li>
<li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.</li>
</ol>

Aunque el protocolo anterior ha sido optimizado para el sistema en particular y para una elección específica de los tintes (TMR y ATTO647N), que no es el único método probado. Recientemente, un sistema de oxígeno alternativos de barrido que consiste en ácido protocatéquico (PCA) / ​​protocatechuate-3 ,4-dioxigenasa (PCD) ha demostrado aumentar la fotoestabilidad de determinados colorantes 4. Del mismo modo, otro estado triplete, como apagar la β-mercaptoetanol (BME) se puede utilizar en lugar de Trolox, aunque no podría suprimir de larga duración intermitente de algunos colorantes, en particular, Cy5 5. A pesar de la inmovilización a través de biotina-estreptavidina-biotina albúmina de suero bovino (BSA) es la opción preferida para los estudios de los ácidos nucleicos, un polietilenglicol (PEG)-superficie cubierta es más adecuado para los estudios de las proteínas, ya que evita adhesión no específica 1. Además, la difracción de sub-limitada-vesículas de tamaño se puede utilizar para encapsular las biomoléculas de interés en los casos en que puede verse afectada por las interacciones de superficie 6. En este artículo hemos utilizado una configuración confocal equipado con silicona fotodiodos de avalancha para adquirir las huellas intensidad de la fluorescencia. Este protocolo funciona igual de bien con el total de los microscopios de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) equipados con cámaras CCD. Independientemente de la microscopía de utilizar, sm-FRET puede informar sobre la resolución espacial se acerca el angstrom cuando el donante y el receptor de la señal están debidamente corregido el 7.

<table><tbody><tr><td>Tubo capilar de sílice fundida</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP150375</td><td></td></tr><tr><td>Lámina cubreobjetos de sílice fundida</td><td>Esco Products</td><td>R425000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td>Diba Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA biotinilada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9085</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>0021122</td><td></td></tr><tr><td>Kit de elastómero Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td>Kit de elastómero de silicona</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Sellante Kwik-Cast</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kwik-Cast</td><td>Compuesto de moldeo de silicona</td></tr></tbody></table>

sistema automatizado de soltero mediciones de fluorescencia de la molécula de superficie inmovilizada biomoléculas

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) microscopía se ha utilizado ampliamente para estudiar la estructura y dinámica de las moléculas de interés biológico, tales como los ácidos nucleicos y proteínas. Sola molécula FRET (sm-FRET) mediciones en las moléculas inmovilizadas permitir observaciones de largo del sistema de forma efectiva hasta que ambos colorantes photobleach-que resulta en el tiempo las huellas que el informe sobre la dinámica de biomoléculas con una amplia gama de escalas de tiempo de milisegundos a minutos. Para facilitar la adquisición de gran número de huellas para el análisis estadístico, el proceso debe ser automatizado y el medio ambiente de la muestra debe ser estrechamente controlada por el tiempo de medición completa (~ 12 horas). Esto se logra utilizando un microscopio confocal de barrido automático que permite el interrogatorio de miles de moléculas individuales durante la noche, y una célula de microfluidos que permite el intercambio controlado de tampón, con el contenido de oxígeno restringido y mantiene una temperatura constante durante todo el período de medición. Aquí se muestra cómo montar el dispositivo de microfluidos y de cómo activar su superficie para la inmovilización de ADN. A continuación se explica cómo preparar un amortiguador para maximizar la fotoestabilidad y la duración de los fluoróforos. Finalmente, se muestran los pasos a seguir en la preparación de la instalación para la adquisición automática de la resolución temporal sola molécula FRET trazas de moléculas de ADN.

En este artículo se describe cómo obtener FRET rastros de moléculas individuales de ADN inmovilizado en una superficie utilizando un microscopio confocal de barrido automático.

Sistema Automatizado de Soltero mediciones de fluorescencia de la molécula de superficie inmovilizada Biomoléculas

La microscopía de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) se ha utilizado ampliamente para estudiar la estructura y la dinámica de moléculas de interés biológico, ...

Para estudiar la dinámica de moléculas individuales durante un período prolongado de tiempo, primero es necesario localizar las moléculas en el espacio. Esto se logra inmovilizándolas sobre la superficie de una celda microfluídica. El procedimiento comienza con el ensamblaje de la celda, que contiene cuatro cámaras donde se fijarán las biomoléculas.Las cámaras están conectadas al exterior mediante capilares de entrada y salida. La celda se fabrica fusionando un disco de PDMS con un portaobjetos de cuarzo. Luego, la celda ensamblada se monta en el microscopio de fluorescencia y se conectan tubos flexibles a los capilares para permitir el intercambio fácil de soluciones a través de las cámaras, con el fin de activar primero la superficie para la inmovilización de moléculas, y a continuación hacer fluir una solución de BSA biotinilada a través de uno de los canales.La BSA se absorberá en la cámara. Luego, haga fluir una solución de estreptavidina, que a su vez se unirá a la biotina. Finalmente, haga fluir su oligonucleótido biotinilado, el cual se unirá a la estreptavidina, anclando así la molécula de interés a la superficie del cubreobjetos de cuarzo.Se hace fluir a través de la cámara un tampón de imagen diseñado para maximizar la estabilidad y la intensidad del tiempo de vida de los fluorocromos a una velocidad constante durante todo el período de adquisición. El sistema automatizado escanea diferentes secciones de la superficie en busca de moléculas que tengan fluorocromos donadores y aceptores, y luego las mueve una por una al volumen de detección, obteniendo para cada una una traza de intensidad de fluorescencia en el tiempo hasta que ambos fluorocromos se fotodesvanecen. Hola, soy Nicholas Dfi del laboratorio del profesor Miller en el departamento de ingeniería biomédica de la Universidad de Boston.Hoy les mostraremos un procedimiento para obtener trazos de F de molécula individual a partir de ácidos nucleicos inmovilizados utilizando un equipo confocal. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la dinámica de ácidos nucleicos y las interacciones entre ácidos nucleicos y enzimas. Así que comencemos.El Microfluid Excel se fabrica fusionando un disco de poli(dimetilsiloxano) o PDMS de dos milímetros de espesor, con un patrón definido, a una cubreobjetos de cuarzo recién limpiada. Para elaborar el disco de PDMS con patrón, combine 10 partes de base de elastómero de silicona con una parte de agente de curado, mezcle bien y desgasifique durante una hora en vacío. Una vez que la base de elastómero haya sido desgasificada, viértala suavemente en el molde de la celda microfluídica.Deje que la mezcla de elastómero cure en una placa calefactora a 70 grados Celsius durante dos horas. Una vez curada, retire cuidadosamente el disco de PDMS del molde utilizando una cuchilla de afeitar. El disco de PDMS contiene cuatro cámaras rectangulares de 30 microlitros.Fusionar el lado plano del disco de PDMS, el lado que no contiene los canales, a una ventana de vidrio de una pulgada mediante oxidación por plasma de ambas superficies durante 30 segundos. La ventana de vidrio contiene de ocho a dos orificios de dos milímetros en ambos extremos de los canales que fueron perforados previamente. A continuación, se inserta un tubo capilar de sílice fundida flexible de dos pulgadas de largo a través de cada orificio de la ventana de vidrio.Para hacer esto, primero inserte una aguja y luego introduzca el tubo capilar hasta que alcance el canal. Selle los orificios de la ventana de vidrio utilizando un compuesto de moldeo de silicona de curado rápido, como Quick Cast. Enjuague los canales con etanol y agua después de activar la celda con plasma y una lámina circular de cuarzo de una pulgada limpiada recientemente con solución piraña durante 30 segundos.Una el cubreobjetos al costado de la celda que contiene los canales. Ahora las cámaras están selladas. Deje la celda ensamblada curando durante la noche a temperatura ambiente.Después de que el microfluídico ensamblado en Excel haya curado durante la noche, se coloca en un soporte hecho a medida y se monta en la platina del microscopio confocal para comenzar la activación de la superficie de la celda. Para la inmovilización de moléculas, conecte tubos flexibles a las capilares de la celda para facilitar la inyección de tampón mediante una jeringa y una aguja. A continuación, inyecte una solución de 0,1 miligramos por mililitro de BSA biotinilada en tampón A dentro del canal e incube durante al menos 30 minutos.Después del flujo de incubación de 30 minutos, pase de 300 a 500 microlitros de tampón A para eliminar cualquier BSA biotinilada no absorbida del canal; tenga cuidado de no atrapar burbujas de aire en la cámara. A continuación, inyecte una solución de 0,1 miligramos por mililitro de STR din en tampón A e incube durante 15 minutos.Después del flujo de incubación de 15 minutos, añada de 300 a 500 microlitros de tampón A para eliminar cualquier strep din no absorbido del canal. Como antes, evite atrapar burbujas de aire en la cámara. Finalmente, haga fluir una solución de tres a cinco picomolares del ejemplo biotinilado.Para verificar la cobertura de las moléculas fluorescentes, se realiza un escaneo de la superficie. Incube la muestra biotinilada durante 10 minutos y repita el flujo de tampón. Como se mostró anteriormente, el tampón de imagenología o IB consiste en un sistema enzimático de eliminación de oxígeno y un inhibidor de estado triple, como trol, para que el IB se disuelva primero.Cinco miligramos de trol se bloquean en 10 mililitros de tampón de glucosa mediante vortex durante unos minutos y agitación durante al menos 10 minutos. Filtre la solución y déjela desgasificar en vacío durante 10 minutos. Mezcle suavemente la solución de bloqueo TRO con la solución enzimática Glocky evitando la formación de burbujas de aire.Llene el depósito con la solución IB. Luego, utilizando una bomba de jeringa mecánica, controle la velocidad de flujo haciendo pasar el IB a través del canal a una velocidad constante de cinco microlitros por minuto; burbujee gas argón en el depósito de IB para evitar que el oxígeno atmosférico se disuelva en el tampón. El escaneo de la superficie, la localización de moléculas y la adquisición de trazos de intensidad de molécula individual están controlados por el programa LabVIEW, que escanea áreas de 20 por 20 micrómetros cuadrados con una resolución de 0.2 micrómetros a una velocidad de 0.1 micrómetros por milisegundo.Los datos del escaneo de superficie se procesan inmediatamente para obtener las posiciones ponderadas por intensidad de todos los píxeles por encima de las cuentas de fondo. Una vez localizadas las moléculas inmovilizadas, se trasladan una por una al volumen confocal y se registran las intensidades del fluoróforo donador y aceptor en función del tiempo hasta que ambos floros se fotodesvanecen. Luego, la platina se programa para moverse a un nuevo origen, a 100 milímetros de distancia, y se repite el proceso de escaneo.Se muestra aquí el MICROFLUID Excel ensamblado. Estas son escaneos de superficie que muestran moléculas individuales en los canales verde donador y rojo aceptor. Se presentan algunas trazas típicas de moléculas individuales que muestran la intensidad del aceptor en rojo y la del donador en verde.Acabamos de mostrarle cómo obtener trazas de moléculas individuales a partir de biomoléculas inmovilizadas utilizando un montaje confocal. Al realizar este procedimiento, es importante recordar hacer cada paso con cuidado y tomarse el tiempo necesario, ya que se trata de un experimento complejo. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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