Name: El uso de SC1 (Pluripotin) para apoyar MESC auto-renovación en la ausencia de LIF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprende a mantener la auto-renovación de células madre embrionarias de ratón usando SC1 como alternativa económica al factor LIF. Este método permite evaluar marcadores de pluripotencia mediante inmunocitoquímica.

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Los autores desean agradecer al Dr. Sheng Ding, del Instituto Scripps de Investigación y el Dr. Deng Hongkui de la Universidad de Pekín por su ayuda y dirección.

1. Preparación de las placas de alimentación MEF <ol><li> Un día antes de que el cultivo de células madre embrionarias, descongele un vial de irradiados E14.5 CF-1 células alimentadoras MEF (ver nuestro procedimiento sobre la forma de descongelar las células ES). </li><li> Placa de las células de alimentación MEF, con una densidad de 10.000 células / pocillo en una placa de 12 también. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C y 5% CO 2. MEF celular medios de comunicación: DMEM suplementado con 10% ES-PBS, la glutamina 1X y 1X no aminoácidos esenciales. </li></ol> 2. Mantenimiento de auto-renovación de las células madre embrionarias de ratón <ol><li> Separar las células madre embrionarias con tripsina. Sembrar las células a una densidad de 50.000 células / pocillo en las placas de alimentación preparada previamente MEF en medios de cultivo (MEM golpe de gracia complementado con un 15% KSR, 4 mM L-glutamina, 0,1 mM no aminoácidos esenciales y BME 1X), complementado con SC1 a la concentración deseada (en el ejemplo 100 nm, 300 nm, y M 1). También hemos añadido un control positivo, así que fue complementado con 1000 μ / ml de LIF. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C y 5% CO 2. </li><li> Cultivo de las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 3-4 días en cada paso. Actualizar los medios de comunicación cada 48 horas. </li><li> Células paso 1:10-1:15 con tripsina para mantener una densidad similar a la densidad de siembra inicial. Después de cinco pasajes, las células pueden ser examinados para la expresión de marcadores de pluripotencia típicos utilizando inmunocitoquímica. </li></ol> 3. El examen de inmuno marcadores de pluripotencia <ol><li> Lave suavemente las células tres veces con PBS. </li><li> Fijar las células con 500 l de solución fijadora durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lave suavemente las células tres veces con PBS. </li><li> Bloquear la unión no específica con 500 l de amortiguación de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. </li><li> Se incuban las células con 250 l de la primaria de anticuerpos específicos (en el ejemplo Nanog, Sox2, SSEA1 y Oct4 en las siguientes diluciones: 1:500, 1:2000, 1:500 y 1:500) </li><li> Lave suavemente las células tres veces con PBS. </li><li> Se incuban las células con 250 l de anticuerpo secundario durante dos horas a temperatura ambiente, manteniéndose alejado de la luz (en el ejemplo burro anti-ratón conjugado con Alexa Fluor ® 555 a 1:2000 y burro anti-conejo conjugado con Alexa Fluor ® 488 a 1 : 2000). </li><li> Lave suavemente las células tres veces con PBS. </li><li> Añadir DAPI (concentración final de 1 mg / ml) para el último lavado e incubar 5 minutos para visualizar los núcleos. </li><li> Analizar las células bajo un microscopio de fluorescencia. </li></ol> 4. Los resultados representativos: 1. Resultados de la morfología: Células madre embrionarias de ratón (ESC R1) fueron cultivadas en células alimentadoras MEF en la presencia de cualquiera de LIF o SC1 para mantener la auto-renovación en un estado indiferenciado. Después del segundo paso, la diferenciación se puede observar en las células sin LIF o SC1 (control negativo) y después de 5 pasajes prácticamente no se observaron colonias indiferenciadas. LIF (control positivo) colonias tratadas se mantuvo en un estado indiferenciado de los 5 pases celulares. Las células tratadas con SC1 a concentraciones de 300 nm o 100 también se mantuvo diferenciado después de 5 pasajes, sin embargo, las células tratadas con 1 mM SC1 muerte celular experimentado tras el paso cuarto. (Fig 2 de la nota de aplicación) La Tabla 1 resume las observaciones morfológicas. 2. Expresión de marcadores de pluripotencia Células ES de ratón mantuvo durante 5 pasajes fueron fijados y examinados por inmunohistoquímica para SSEA1, Oct4, Sox2 y Nanog. Expresión de los marcadores fue similar a las células mantenidas en LIF. (Fig 3 y 4 de la nota de aplicación) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Comparación de Morfología de las células mantenidas en LIF o SC1. No se observaron diferencias en la morfología se observó. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="Figura 2 y 3" /> Figura 2 y Figura 3: Nanog, SSEA1, Sox2, Oct4 y la tinción de células madre embrionarias mantiene con SC1 o LIF (fig 4 de la nota de aplicación). Células mantenidas en SC1 mostrar expresión similar marcador de pluripotencia de las células mantenidas en LIF. Tabla 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Control Negativo </td><td> LIF control positivo </td><td> SC1 1um </td><td> SC1 300 nM </td><td> SC1 100 nM </td></tr><tr><td> Primero paso </td><td> ES normal de la morfología celular </td><td> ES normal de la morfología celular </td><td> ES normal de la morfología celular </td><td> ES normal de la morfología celular </td><td> ES normal de la morfología celular </td></tr><tr><td> El paso segundo </td><td> Algunos morfología diferenciada </td><td> E normalesS morfología de las células </td><td> ES normal de la morfología celular </td><td> ES normal de la morfología celular </td><td> ES normal de la morfología celular </td></tr><tr><td> El paso tercero </td><td> La mayoría de las células diferenciadas </td><td> ES normal de la morfología celular </td><td> ES normal de la morfología celular </td><td> ES normal de la morfología celular </td><td> ES normal de la morfología celular </td></tr><tr><td> Paso cuarto </td><td> No colonias CES </td><td> ES normal de la morfología celular </td><td> La muerte celular observada </td><td> ES normal de la morfología celular </td><td> ES normal de la morfología celular </td></tr><tr><td> Pasaje quinto </td><td> diferenciado </td><td> ES normal de la morfología celular </td><td> La muerte celular observada </td><td> ES normal de la morfología celular </td><td> ES normal de la morfología celular </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li>
<li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acat.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li>
</ol>

Los autores de este artículo están empleados por Stemgent, empresa que produce reactivos e instrumentos utilizados en este artículo.

El SC1 pequeñas moléculas se pueden utilizar para mantener la auto-renovación, con un estado indiferenciado de las células madre embrionarias de ratón. Antes de utilizar en una línea celular no probado, sin embargo, deben ser valorados para determinar la concentración óptima. Por ejemplo, hemos probado tres concentraciones en el ratón de células ES R1 línea ESC. 100 nm y 300 nm concentraciones fueron capaces de sostener células ES de ratón, sin embargo, una concentración de 1 M era tóxico. SC1 también se puede utilizar bajo condiciones de alimentación libre.

<table><tbody><tr><td>SC1</td><td>Stemgent</td><td>04-0011</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo SSEA-1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>21702</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab21603</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo Sox2</td><td>Chemicon International</td><td>Ab5603</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo Oct4</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

el uso de sc1 (pluripotin) para apoyar mesc auto-renovación en la ausencia de lif

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Madre embrionarias de ratón (ES) las células son cultivadas convencionalmente con factor inhibidor de leucemia (LIF) para mantener la auto-renovación.<sup&gt; 1</sup&gt; Sin embargo, LIF es caro y la activación de la vía LIF/JAK/STAT3 no es absolutamente necesario para mantener el estado de auto-renovación.<sup&gt; 2</sup&gt; La molécula pequeña SC1 puede ser una alternativa económica a LIF. SC1 funciones a través de la inhibición dual de Ras-GAP y ERK1.<sup&gt; 3</supIlustración&gt; de su mecanismo de acción hace que sea una herramienta útil para estudiar el mecanismo molecular fundamental de la auto-renovación. Aquí se demuestra el procedimiento para el cultivo de células madre embrionarias de ratón en presencia de SC1 y demostrar que son capaces de mantener la auto-renovación en la ausencia de LIF. Las células cultivadas con SC1 mostró morfología similar en comparación con las células mantenidas con LIF. Ambos mostraron una morfología típica madre embrionarias de ratón después de cinco pasajes. Típica expresión de marcadores de pluripotencia (Oct4, Sox2, Nanog, y SSEA1) se observó después de cinco pasajes de la presencia de SC1. Además, SC1 no causó toxicidad manifiesta en las células madre embrionarias de ratón.

SC1 funciones a través de la inhibición dual de Ras-GAP y ERK1. Pusimos a prueba la función de SC1 en el apoyo de células ES de ratón de auto-renovación en la ausencia de LIF y demostró que SC1 es capaz de mantener la auto-renovación de los cultivos celulares de ratón ES.

El uso de SC1 (Pluripotin) para apoyar MESC auto-renovación en la ausencia de LIF

Las células madre (ES) embrionarias de ratón se cultivan convencionalmente con el factor inhibidor de la leucemia (LIF) para mantener la autorrenovación.1 Sin embargo, el LIF es costoso y ...

Hola, soy Sarah NAU del Laboratorio STEM Gen en Boston. Hoy les mostraremos un procedimiento para mantener la autorrenovación de células madre embrionarias de ratón en presencia de la molécula pequeña C uno ratón. Normalmente, las células madre embrionarias se cultivan en presencia del factor inhibidor de la leucemia para mantener su autorrenovación.Sin embargo, L es costoso. Por lo tanto, aquí ofreceremos una alternativa económica, la molécula pequeña SC uno. En la última parte del video, les mostraremos una comparación de la expresión de marcadores de pluripotencia entre células cultivadas en L y aquellas cultivadas en SC uno.Entonces, comencemos. Un día antes de cultivar las células madre embrionarias, descongele un vial de células alimentadoras irradiadas. Siembre las células alimentadoras a una densidad de 10.000 células por pocillo.En una placa de 12 pocillos, incubar las células durante la noche a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, sembrar las células ES sobre la capa de alimentación de MEF, sembrando las células a una densidad de 50.000 células por pocillo en las placas de alimentación preparadas, en medio de crecimiento suplementado con SC1 a la concentración deseada; utilizamos 100 nanomolares, 300 nanomolares y 1 micromolar.Como control, agregamos un pocillo al que se le suplementó con 1000 microgramos por mililitro de LIF. Ahora incubar las células durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.Al día siguiente, cambie el medio para el cultivo continuo. Renueve el medio cada 48 horas al pasar las células, una por cada 10 cada tres o cuatro días, para mantener una densidad similar a la densidad inicial de siembra. Después de cinco pases, ahora podemos verificar la expresión de marcadores típicos de pluripotencia mediante inmunoquímica para comenzar la inmunoquímica de células madre.Comience por lavar las células suavemente tres veces con PBS. Fije las células con 500 microlitros de paraformaldehído al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las células en PBS otras tres veces, bloquee la unión no específica con 500 microlitros de tampón bloqueante durante una hora a temperatura ambiente.A continuación, agregue 250 microlitros del anticuerpo primario a las células y deje que incuben a cuatro grados Celsius durante la noche. En este experimento, estamos incubando con nano SOX dos, SSEA uno y anticuerpos OCT cuatro. Después de otra serie de lavados, incube las células con 250 microlitros del anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente durante dos horas a temperatura ambiente, manteniéndolas alejadas de la luz, y lave las células por última vez agregando DAPI a una concentración final de un microgramo por mililitro en el último lavado.Luego, incubar las células durante cinco minutos para teñir los núcleos. Finalmente, analizar las células bajo microscopio fluorescente. Aquí se muestran imágenes de campo brillante de células ES de ratón cultivadas sobre células alimentadoras en presencia de LIF o SC uno para mantener la autorrenovación en un estado indiferenciado.Aquí se muestran células ES de ratón que se han mantenido durante cinco pasajes. Las células se fijaron y examinaron mediante inmuno citroquímica para SSEA uno OCT cuatro y nano y SOX dos. La expresión de marcadores para células mantenidas en C uno fue similar a la de células mantenidas en LIF.Acabamos de mostrarle cómo usar la molécula pequeña SC uno para mantener la autorrenovación en células madre embrionarias de ratón. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que se debe titular el SC uno para determinar la concentración óptima antes de utilizarlo en una línea celular no probada. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

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