Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos humanos con los Lentivirus Stemgent Humanos TF Set

Hola, mi nombre es Brad Hamilton. Soy un científico aquí en el departamento de investigación y desarrollo aquí en STEM Gen. Hoy les mostraremos un procedimiento sobre cómo reprogramar fibroblastos humanos utilizando factores de reprogramación lentivirales.

Este procedimiento se puede utilizar tanto para generar celdas IPS como para estudiar el proceso de reprogramación. Las células IPS son similares a las células ES en morfología, proliferación y capacidad de diferenciación, y a todos los tipos de tejidos del cuerpo. Las células IPS humanas tienen una clara ventaja sobre las células ES, ya que exhiben propiedades clave de las células ES sin el dilema ético de destruir un embrión para obtener las células.

La generación de células IPS específicas del paciente evita un obstáculo importante para las terapias de medicina regenerativa personalizadas al eliminar el potencial de rechazo inmunitario de las células trasplantadas no autólogas. Así que comencemos. En varios puntos de este protocolo, se reemplaza el medio de las células madre pluripotentes inducidas o IPSC en desarrollo con medio condicionado por metanfetamina.

La preparación de este medio lleva seis días. Así que comienza al menos una semana antes de que quieras comenzar tu experimento. Para empezar, siembra cada pozo de un seis.

Placa de pozo con dos veces 10 a la quinta cf una celdas alimentadoras de metanfetamina en dos mililitros de crecimiento de metanfetamina. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, cambie el medio a cultivo de células E-S-I-P-S humanas.

Incubar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Recoja el sobrenadante y reemplácelo con medio fresco cada 24 horas durante cuatro días. Filtre el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micrómetros.

Suplementar el sobrenadante recolectado con 15 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento básico de fibroblastos BFGF. Terminará con alrededor de 16 mililitros de medio acondicionado con metanfetamina almacene el sobrenadante recolectado cada día por separado a cuatro grados SIU. El medio acondicionado con metanfetamina puede almacenarse durante una o dos semanas a cuatro grados centígrados o durante varios meses a menos 20 grados centígrados.

Ahora que te has asegurado de que tu medio acondicionado para la metanfetamina estará listo cuando lo necesites, hablemos de la preparación de las células. La primera tarea en la generación de IPSC es utilizar lentivirus para transducir células de fibroblastos del prepucio humano, o células BJ con cuatro características de transcripción de las células madre. Para preparar la transducción de células BJ de siembra a una densidad de una por 10 a la quinta célula por pocillo de una placa de seis pocillos y cultivo.

Las células en dos mililitros de crecimiento, medio durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono el mismo día. Comience a preparar las placas alimentadoras de metanfetamina agregando dos mililitros de gelatina al 0.1% diluida en agua a una placa de seis pocillos e incube durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. La gelatina recubre los pocillos y sirve de matriz para ellos.

Ahora las células BJ están listas para la transducción lentiviral para preparar el virus para la transducción. Suplementar dos mililitros de medio fresco con seis microgramos por mililitro de policerebro y cuatro lentivirus, cada uno de los cuales expresa uno de los factores de transcripción humanos. T cuatro, SO dos nanog y lin 28, de modo que cada uno está en la misma multiplicidad de infección o MOI.

Todos estos lentivirus están incluidos en el conjunto de lentivirus del factor de reprogramación humana. Para realizar la transducción, simplemente reemplace el medio de crecimiento de células BJ con el medio que contiene el virus. Balancee suavemente el plato para que el medio cubra uniformemente el fondo.

Incubar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono el mismo día. Retire un frasco de células alimentadoras de metanfetamina del nitrógeno líquido y descongele. Retire la solución de gelatina de las placas alimentadoras de metanfetamina, que ahora están recubiertas de gelatina en cada una.

Bueno, agregue 0.2 veces 10 a la quinta celda en dos mililitros de crecimiento de metanfetamina. Medio. Incubar el MES durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, separar las células BJ con EDTA de tripsina al 0,05% y centrifugar a 200 Gs durante cinco minutos.

Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el medio de crecimiento. Retire el medio de la placa alimentadora de metanfetamina y agregue dos mililitros por pocillo de la suspensión de celdas BJ. La concentración de células BJ debe ser aproximadamente cinco veces 10 por la cuarta célula por pocillo.

Incubar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. 24 horas después de retroceder, las células BJ en la placa alimentadora de metanfetamina reemplazan el medio con E-S-I-P-S humano, es decir, un cultivo de células madre embrionarias o pluripotentes inducidas. Medio. Continúe cambiando el medio cada 24 horas durante siete días.

En el séptimo día, reemplace el medio de cultivo de células madre embrionarias con dos mililitros de medio acondicionado con metanfetamina. Las células alimentadoras de metanfetamina han estado proporcionando los factores solubles necesarios para cultivar células IPS. Pero ahora necesitamos agregar más de estos factores para mantener la cultura saludable.

El medio acondicionado con metanfetamina contiene todos los factores solubles secretados por las células alimentadoras de metanfetamina, incubadas durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Mirando a través del visor, seleccione una colonia de células. Se distingue por una apariencia pequeña y compacta en forma de cúpula en una placa fresca de 24 pocillos que ha precedido 24 horas antes con ccf uno, las células alimentadoras de metanfetamina retroceden en la colonia seleccionada en el cultivo humano E-S-I-P-S.

Medio suplementado con 10 moléculas de tallo micromolar, Y, 2, 7, 6, 3, 2. Inhibidor de cinasas dependiente. Cambie el medio de cultivo sin suplementar con la molécula madre Y 2 7 6 3 2 cada 24 horas durante los primeros siete días.

Después de siete días, cambie el medio a metanfetamina. La condición al medio continúa pasando por las células hasta que muestran la morfología típica de las células madre embrionarias humanas. Busca colonias pequeñas y compactas en forma de cúpula que tengan un borde afilado.

Las colonias deben ser uniformes y tener una alta proporción de núcleo a citoplasma. En este punto, ha desarrollado colonias que tienen la morfología de las células madre embrionarias, pero ¿también expresan genes característicos de las células madre embrionarias? Para averiguarlo, tiñe las colonias en busca de marcadores de pluripotencia como TRA 180, 1 TRA, uno 60, SSEA, cuatro s, s, SE, un tres, T, cuatro sox, dos nanog y SSEA, uno Para comenzar, lave suavemente las células tres veces con PBS.

A continuación, fije las células con 500 microlitros de paraforma al 4%, aldehído u otro fijador durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de 20 minutos, lave las células con PB S3 más veces para eliminar el exceso de fijador. A continuación, bloquee la unión inespecífica incubando las células en 500 microlitros de tampón de bloqueo por pocillo durante una hora a temperatura ambiente. Después del paso de bloqueo, agregue 250 microlitros de anticuerpo primario diluido de uno a 100 en tampón de bloqueo a cada uno.

Incubar bien las células en el anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente. Lave las células tres veces con PBS para eliminar el anticuerpo primario no unido. Incubar las células con 250 microlitros de anticuerpo secundario diluido de uno a 300 y tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente, manteniéndolo alejado de la luz para evitar el fotoblanqueo después de la incubación con el anticuerpo secundario.

Lave las celdas tres veces con PBS hasta el tercer lavado. Agregue DPI a un microgramo por mililitro para teñir los núcleos. Por último, analice la expresión génica de sus células IPS.

Bajo el microscopio, se observaron cambios morfológicos en la morfología de cuatro células de fibroblasto de piel humana donde se transducía con T, cuatro SOX, dos nanog y lin 28, cambios morfológicos ya en el cuarto día después de la transducción, y el grupo de células se volvió más apretado en el día 17, expresión de marcadores de potencia de plurry. Para caracterizar aún más las colonias de células IPS aisladas, buscamos la presencia de marcadores de pluripotencia comunes expresados en células ES. Las colonias exhibieron una fuerte actividad de fosfatasa alcalina.

Además, se realizó inmunoquímica o ICC en las colonias celulares IPS con un panel de anticuerpos específicos de marcadores de pluripotencia, incluidos los marcadores de superficie TA 180 1, TRA uno 60, SSEA cuatro y SS EEA tres, así como marcadores nucleares, T cuatro, SOX dos y Nanog. Las colonias aisladas de IPS fueron positivas para todos los marcadores. Los resultados del ICC muestran que las células IPS exhibieron el patrón de expresión de marcadores de pluripotencia apropiado, lo que demuestra que estas células IPS se parecen mucho a las células E es humanas indiferenciadas.

Acabamos de mostrarte cómo generar células IPS mediante la reprogramación de fibroblastos humanos con genes madre. Conjunto de lentivirus del factor de reprogramación humana. A la hora de realizar este procedimiento, es importante tener en cuenta varios factores.

En primer lugar, es posible que sea necesario modificar la relación entre el virus activo y el objetivo durante el paso de transducción primario para lograr una eficiencia de transducción óptima. En segundo lugar, la condición de crecimiento de las células objetivo puede afectar. La reprogramación de células sanas y proliferativas es más susceptible a la reprogramación.

En tercer lugar, al modificar el protocolo para diferentes números de celdas, se recomienda que los números de células objetivo se ajusten proporcionalmente al área de superficie de la placa de cultivo. Por último, se debe considerar la aplicación de inhibidores de rocas como Y 2 7 6 3 2 para ayudar a garantizar una reprogramación exitosa, ya que estudios recientes han demostrado su utilidad para mejorar la supervivencia de las colonias humanas. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.