Congelación y descongelación células estaminales embrionarias humanas

Hola, soy Leah Kent de STEM Gen. Hoy les mostraremos cómo descongelar y congelar células madre embrionarias humanas. Así que comencemos.

Para descongelar células madre embrionarias humanas, se retira un vial de criogenia del nitrógeno líquido y se descongela rápidamente en un baño de agua a 37 grados Celsius. La suspensión celular se transfiere del vial de criogenia a un tubo cónico, se diluye con medio de cultivo para células madre humanas y se centrifuga. Para formar un pequeño botón celular, se elimina entonces el sobrenadante y el botón celular se resuspende con medio de cultivo fresco para células madre humanas en el tubo, antes de sembrarlo en un pocillo de una placa de cultivo celular de seis pocillos previamente preparada con una capa de células alimentadoras irradiadas.

Un día antes de descongelar las células ES humanas, siembre una capa de alimentación de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados, o mes en cultivo meth. Medio en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos recubierta con gelatina. Incube la placa durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Para garantizar un descongelamiento eficiente y exitoso, asegúrese de tener listos todos los equipos y reactivos necesarios antes de retirar el ESL humano del nitrógeno líquido. Utilizando pinzas metálicas, retire un vial criogénico de ESL humano del tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido.

Rollee el vial entre las manos enguantadas durante tres a cinco segundos. Para eliminar la escarcha, registre la información en la etiqueta del vial utilizando pinzas de metal. Sumerja el vial en un baño de agua a 37 grados Celsius.

Agite suavemente el vial y observe con frecuencia pero rápidamente el progreso del descongelamiento sosteniendo el vial frente a la luz. Para ver el tamaño del cristal de hielo. No sumerja la tapa del vial en el baño de agua, ya que esto podría contaminar las células.

Cuando solo quede un pequeño cristal de hielo, sumerja el vial en etanol para esterilizarlo dentro de una cabina de seguridad biológica estéril y transfiera el contenido del vial criogénico directamente al fondo de un tubo cónico de 15 mililitros. Añada lentamente cuatro mililitros de cultivo de células madre embrionarias humanas. Medio al tubo.

Agite suavemente el tubo para mezclar continuamente las células mientras se añade el nuevo medio al tubo. Centrifugue las células E es humanas durante cinco minutos a 200 Gs mientras las células están en la centrífuga. Recupere la placa de alimentadores de metilo preparada previamente del incubador a 37 grados Celsius y etiquétela con la información correspondiente de ESL humana, como la línea celular, el número de pase y la fecha de descongelación.

Aspire el medio de cultivo de MEF y agregue un mililitro de PBS al pocillo. Lleve el pellet de E ESL humano de vuelta a la cabina de seguridad biológica y aspire cuidadosamente el sobrenadante. Tenga cuidado de no aspirar el pellet celular, pero elimine tanto sobrenadante como sea posible, ya que esta solución contiene DMSO del medio de congelación.Resus.

Suspenda muy suavemente el sedimento añadiendo 2,5 mililitros de medio de cultivo humano ESL. Utilizando una pipeta de vidrio de cinco mililitros y pipetando de tres a cuatro veces, aspire el PBS del alimentador de MEF. Añada cuidadosa y lentamente los 2,5 mililitros completos de la suspensión de células madre embrionarias humanas a la cavidad preparada de la placa de seis cavidades.

Coloque la placa en el incubador a 37 grados Celsius y deslícela cuidadosamente hacia adelante y hacia atrás, y de lado a lado, para distribuir uniformemente las células por todo el pocillo. Para evitar concentrar las colonias en el centro. No mueva la placa en un patrón circular.

Deje que las células se adhieran durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, al día siguiente del descongelamiento. Retire el medio con cualquier célula flotante y agregue 2,5 mililitros de medio fresco de cultivo de células ES humanas al pocillo.

Incubar las placas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante la noche y continuar el cultivo hasta que las colonias estén listas para ser pasajeadas. El protocolo de congelación de células ES humanas comienza con colonias de células ES humanas de tamaño medio sanas cultivadas en una placa de seis pocillos. Después de incubar el cultivo con la enzima colagenasa IV, las colonias se raspan con una pipeta de vidrio de cinco mililitros, se recogen en un tubo cónico y se centrifugan para formar un sedimento celular suelto.

Después de aspirar el sobrenadante, el botón celular se resuspende. Primero con medio de cultivo para células ES humanas y luego se diluye con dos volúmenes de medio de criopreservación. Las células se distribuyen uniformemente en alícuotas de un mililitro y se congelan en viales criogénicos.

Mientras las células están en la centrífuga, etiquete los viales criogénicos dentro del gabinete de seguridad con el número de pasaje de la línea celular y la fecha de congelación. La densidad típica para congelar células ES humanas es una pocilga de células de una placa de seis pocilgas por vial criogénico. Cuando las células ES humanas hayan sido centrifugadas, lleve el tubo de vuelta al gabinete de seguridad biológica.

Aspire el sobrenadante del tubo. Tenga cuidado de no perturbar el sedimento celular suelto. Suspender el sedimento celular con la cantidad adecuada de cultivo humano ESL.

Medio de 0,5 mililitros de cultivo de ESL humano. Medio por vial criogénico. Sea muy cuidadoso al pipetear, ya que las células madre embrionarias humanas se recuperan mejor cuando se congelan en fragmentos de colonia relativamente grandes; agregue lentamente, mientras agita suavemente el tubo, la cantidad adecuada de medio de congelación para células madre embrionarias humanas 2x a las células.

Una vez que se ha añadido el medio de congelación, mezcle la solución extremadamente suave, de uno a dos veces rápidamente, pero con cuidado añada un mililitro de la suspensión celular a cada archivo criogénico. Transfiera los viales a un recipiente de congelación con isopropanol y colóquelos en un congelador a menos 80 grados Celsius durante la noche. Las células se congelarán a un grado Celsius por minuto en el recipiente de congelación con isopropanol al día siguiente.

Transfiera rápidamente los viales congelados a un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido utilizando pinzas metálicas. El primer día después de que las células ES humanas se piensan, las colonias pequeñas pueden parecer transparentes y pueden ser difíciles de ver bajo el microscopio. Dado que recién pensadas, las células ESL humanas tienden a proliferar bastante lentamente.

Pueden tardar algunos días en cultivo en aparecer como colonias establecidas. Acabamos de mostrarle cómo descongelar y congelar cultivos de células madre embrionarias humanas. Eso es todo.

Gracias por vernos y mucha suerte con sus experimentos.