Una técnica para visualizar simultáneamente específica para el virus las células CD8 + T y células infectadas por virus In situ

Mediante la combinación de la hibridación in situ y la tetratinción en una técnica conocida como ISTH, se pueden determinar los números relativos y las relaciones espaciales entre las células efectoras inmunitarias específicas del antígeno viral y las células y tejidos infectados por el virus. ISTH comienza incorporando tejido fresco infectado con SIV en agros. El tejido se corta en secciones de 200 micras de espesor con un vibrato y se tiñe para el antígeno viral.

Células CD ocho positivas específicas que utilizan tetrámeros MHC marcados con ajuste C. Después de la congelación, estas secciones de tinción se cortan en secciones de ocho micrómetros de espesor utilizando un criostato y se realiza una hibridación in situ para localizar las células infectadas viralmente. La microscopía confocal se utiliza para obtener imágenes de las secciones de doble tinción y, en última instancia, reconstruir las secciones gruesas originales para revelar la relación entre el efector inmunitario y las células diana.

El uso de este procedimiento para examinar la infección temprana por VIS ha demostrado ser un buen predictor de la gravedad de la enfermedad resultante. Hola, soy Chinen Lee, del árbol de laboratorio de Ashley HA en el Departamento de Microbiología de la Universidad de Minnesota. Soy Pam Skinner, profesora asistente en el Departamento de Ciencias Biomédicas Veterinarias de la Universidad de Minnesota.

Hoy les mostraremos un procedimiento para la hibridación interna en el instituto o ISTH para abreviar. Además de utilizar la tinción de inci teer combinada con la hibridación de inci teer como estamos demostrando hoy, también utilizamos de forma rutinaria la tinción de inci teer combinada con inmunohistoquímica para determinar la ubicación, la abundancia y el perfil de expresión de proteínas de las células T CD ocho específicas del antígeno in situ. Ayudándonos hoy con la tinción in situ con las secciones gruesas estarán el Dr. Heon Kim y Terry Matala y asistiéndonos con la preparación de la sección delgada y la hibridación in situ será Así que comencemos.

Para comenzar este procedimiento, enfríe el baño Vibram que contiene PBSH estéril hasta que alcance dos grados centígrados. Ajuste el ángulo de la cuchilla del vibrador a 27 grados. Siempre que sea posible, mantenga los pañuelos frescos refrigerados en hielo y comience el procedimiento dentro de las 24 horas posteriores a la recolección de los pañuelos.

Con el fin de minimizar el enfriamiento por degradación, el vibram también facilita el corte de un tejido fresco, recorte el tejido conectivo y corte la muestra con bisturí en trozos pequeños y coloque los trozos en un bote de suero y cúbralos con un 4% de bajo punto de fusión. Los agros en PBS se derritieron a unos 40 grados centígrados. Asegúrese de que el pañuelo esté en contacto con el fondo del plato y empuje los trozos de pañuelo hacia abajo si flotan, solidifique en hielo durante tres a cinco minutos.

Aquí se utiliza tejido del bazo, pero también se pueden utilizar ganglios linfáticos, vagina, cuello uterino, útero u otros tejidos frescos con bisturí. Corte los agros alrededor del tejido y, con pinzas, transfiera cuidadosamente el tejido incrustado en el agros al bloque de tejido. Continúe cubriendo un bloque de tejido Vibram con pegamento Loctite.

No mueva el pedazo de tejido una vez que esté colocado en el bloque de tejido. Deje secar durante unos 10 minutos sobre hielo. A continuación, monta el bloque de tejido en el vibrador y corta el tejido en secciones de 200 micrómetros de grosor utilizando una velocidad de avance lenta y una amplitud relativamente alta.

Use un pincel para transferir las secciones cortadas a una cámara de tejido especializada ubicada en el pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos precargada con un mililitro de PBSH refrigerado. Coloque hasta cuatro secciones de tejido en cada cámara de tejido. Etiquete las muestras y asegure la tapa a la placa con una banda elástica para teñir las secciones de tejido en busca de células T virales específicas.

Los tetrámeros conjugados ZI se diluyen primero en tampón de bloqueo a nwt 0,5 microgramos por mililitro. La solución se pipetea en una placa de 24 pocillos a un mililitro por pocillo. El tejido recién cortado se transfiere a la placa en las cámaras de tejido y se deja mecer durante la noche a cuatro grados centígrados.

Mantenga un pocillo vacío entre las cámaras de tejido que contienen diferentes muestras para evitar la contaminación cruzada de las soluciones en los pasos posteriores. En este paso se pueden añadir anticuerpos dirigidos contra proteínas extracelulares o de la superficie celular. Para el lavado, prepare una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos que contenga PBSH enfriado después de la incubación primaria.

Lavado dos veces transfiriendo las cámaras de tejido a una placa precargada durante 20 minutos cada vez, asegúrese de drenar la mayor parte del líquido de las cámaras de tejido antes de transferir. Además, no gotee el contenido de una muestra en otra al mover las cámaras de tejido y controle las secciones en las cámaras de tejido para asegurarse de que no se peguen a los lados. Fije las secciones con 4% de paraldehído fresco en PBS durante dos horas a temperatura ambiente después de la fijación.

Se lavó dos veces con PBSH frío durante cinco minutos cada vez para amplificar la señal de los tetrámeros. Incubar las secciones con anticuerpos anti fitzy de conejo en una proporción de uno a 10.000 en tampón de bloqueo durante uno a tres días. En esta etapa, se pueden agregar anticuerpos contra epítopos intracelulares.

Asegurarse de permear las células y bloquear sitios inespecíficos antes de la adición del anticuerpo. También puede ser necesaria la recuperación del antígeno después de la segunda incubación larga destinada a amplificar la señal. Lave las secciones en PBSH tres veces durante al menos 20 minutos y hasta varias horas cada vez.

Realizar una incubación final con anticuerpos apropiados marcados con fluorescencia. Por ejemplo, se puede usar cabra anti conejo SI tres para unirse a los anticuerpos anti conejo para hacer que las células teñidas de tetrámero sean fluorescentes rojas. Si se usaron anticuerpos de ratón para contrarrestar la tinción de proteínas de interés, como el CD ocho, para visualizar las células T asesinas, se puede usar Alexa 488 anti-US para unirse a los anticuerpos del ratón y hacer que las células de tinción de anticuerpos sean fluorescentes, las diluciones de cada anticuerpo deben determinarse empíricamente.

Incubar durante uno a tres días, mantener las secciones protegidas de la luz envolviendo las placas y el papel de aluminio durante esta incubación y, posteriormente, a medida que la luz se apague, la flora cae. Finalmente, fije las secciones nuevamente para asegurar los tetrámeros y los anticuerpos en su lugar. Lavar y montar en un portaobjetos de microscopio con gelatina de glicerol que contenga cuatro miligramos por mililitro de galato de perfil N para almacenarlo a menos 20 grados Celsius hasta que se preparen secciones delgadas para la hibridación in situ.

Las secciones de tinción de tetrámero in situ ahora se pueden analizar con un microscopio confocal para determinar la localización, abundancia y patrón de expresión de proteínas de las células T positivas CD ocho específicas del antígeno en la imagen que se muestra: las secciones de tejido del bazo de un meac de receso infectado con SIV se tiñeron con tetrámeros gag para marcar las células T positivas CD ocho específicas del VIS, los anticuerpos CD 20 y los anticuerpos CD tres. Dado que los contadores se manchan con anticuerpos en el siguiente paso. Es importante analizar los tetrámeros in situ antes de seguir adelante.

Comience el procedimiento de corte delgado calentando las secciones de 200 micras de espesor a 70 grados Celsius durante cinco minutos en un bloque de calor para separar las secciones gruesas del portaobjetos. Una vez que se hayan separado las secciones, insértelas en OCT sobre hielo seco llenando primero el fondo del molde de plástico con OCT. A continuación, coloque el pañuelo encima de la OCT y cúbralo con OCT.

Utilice un criostato para cortar secciones de ocho micras de espesor de las secciones incrustadas de OCT y adhiera las secciones de ocho micras a portaobjetos aislados. A continuación, los portaobjetos pueden almacenarse a menos 80 grados centígrados en una caja sellada para su posterior hibridación in situ. La hibridación in situ estándar se utiliza para detectar células infectadas viralmente a través de sondas de costillas específicas del virus marcadas con S 35.

El procedimiento también incluye el recubrimiento de secciones con emulsión de orugas nucleares y correderas de montaje. En un medio fluorescente compatible, las imágenes confocales se adquieren utilizando un microscopio confocal BioRad MRC 1000, que está equipado con un dispositivo de reflexión azul de tubo epi. La tinción de tetra in situ se visualiza utilizando el EPI one 605 para el tetrafluorocromo rojo y el EPI 2 522 DF 32 para el fluorocromo CD ocho verde para la hibridación in situ.

Utilice la reflexión azul EPI dos para los granos de plata resultantes de la señal de hibridación in situ en los autógrafos de radio desarrollados. Para comenzar la adquisición de imágenes, adquiera las imágenes de cada sección de izquierda a derecha y de arriba a abajo y asegúrese de capturar cada imagen con una superposición de aproximadamente el 20% con sus imágenes vecinas. Para evitar huecos en la imagen de montaje reconstruida, asigne un nombre a cada imagen según su hermano y columna en un archivo de Excel.

Cuando se complete la recopilación de datos de las diapositivas, use el software de asistente confocal para proyectar imágenes en serie Z para cada canal en una sola imagen utilizando un procedimiento de siete acciones de Photoshop disponible en los autores, combine automáticamente la imagen proyectada de los tres canales en una imagen RGB. A continuación, une las imágenes fusionadas en capas para generar una imagen de montaje de toda la sección. Asocie los granos de plata individuales y la tinción de tetrámero con las celdas del montaje mediante metamorfosis o Photoshop.

Asigne las coordenadas XY de los centros o OID de las células positivas para ARN viral y tetrámero positivo. Exporte los datos de OID a archivos de Excel como números numéricos para cada celda y utilice los datos recopilados en los archivos de Excel para determinar las proporciones de células efectoras inmunitarias o células E con respecto a objetivos virales o células T a partir del número total de células tetrámeras positivas y células positivas para ARN viral en sección para capturar las relaciones espaciales entre las células tetrámeras positivas y las células positivas para ARN. Copie y pegue sus respectivos trazados de los archivos de Excel en un documento de Photoshop en Photoshop.

Disminuya la opacidad de una capa para alinear y escalar las cuadrículas de modo que coincidan con el color, seleccione y, a continuación, copie y pegue en una nueva capa. Las posiciones de las células positivas de ARN azul descartan la capa utilizada para alinear las rejillas, y las posiciones de las células tetrámeras positivas y las células positivas de ARN viral se revelarán en la imagen aplanada. Utilizando el método ISTH que se muestra aquí, podemos seguir la respuesta inmunitaria a la infección por VIS después de la inoculación intravaginal en este portal de entrada y en los tejidos linfáticos a los que se propaga la infección.

Hay un gran número de células infectadas en estos sitios de tejido a los 10 días después de la infección, pero hasta tres días después, hay células CD A positivas para la tinción verde, pero todavía no. Células tetra positivas específicas para el VIS teñidas de rojo. Por lo tanto, la respuesta inmunitaria es demasiado tardía para eliminar la infección.

Sin embargo, a las tres semanas después de la infección, se observa claramente una disminución de las células infectadas, especialmente en el portal de entrada. Utilizamos ISTH para demostrar que el grado de reducción se correlacionó con la proximidad espacial y el número relativo de células efectoras inmunitarias positivas para tetrámeros. Células diana N-S-I-V-R-N-A positivas, llamamos a esto la relación E a T in vivo.

Las relaciones espaciales se visualizan fácilmente utilizando este método, con células efectoras en rojo y objetivos virales en azul en este ganglio linfático infectado. Muchas células efectoras y diana están muy cerca y hay zonas en las que muchas células efectoras rodean a una sola célula S-I-V-R-N-A, mientras que en otras zonas una célula S-I-V-R-N-A es independiente. La relación de ETT se calcula simplemente a medida que las posiciones de las celdas se determinan y se registran mediante los números de cada una en el archivo de Excel.

El mejor control de la infección viral se correlaciona con un gran exceso de efectores rojos sobre los objetivos verdes 43 a uno. En este caso, en el cuello uterino y la vagina, donde se inició la infección, las proporciones de TET fueron más bajas en los ganglios linfáticos. La correlación positiva entre las altas tasas de ETT y la reducción de la carga viral desde el pico indica que una respuesta inmunitaria más robusta en el portal de entrada se traduce en un mejor control de la infección.

Acabamos de mostrarle cómo detectar simultáneamente las células CDAT muy específicas y la célula de infección viral in situ. Esta técnica nos permite visualizar simultáneamente células T específicas de antígeno y células infectadas por virus en los tejidos. Esta técnica se puede aplicar para evaluar la vacuna basada en células T CD ocho positivas y la otra interacción entre el patógeno y el huésped sin valor al realizar este procedimiento.

Es importante mantener todos los ARN de los reactivos libres antes de la hibridación. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.