La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

Hola, soy San Lee del laboratorio de Stephen Harlem en el Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Columbia Británica. Hoy les mostramos un procedimiento para la extracción de ADN genómico de alto peso molecular a partir de suelo forestal, que también es aplicable a una amplia variedad de tipos de suelo y sedimento. Utilizamos el ADN genómico de alto peso molecular para construir la biblioteca metagenómica de las comunidades microbianas del suelo.

Con estas bibliotecas en mano, podemos estudiar la diversidad y el potencial metabólico de las comunidades microbianas distribuidas entre diferentes horizontes del suelo. Así que comencemos. Este protocolo comienza con la lisis celular.

El primer paso consiste en completar el tampón desnaturalizante añadiendo etanol beta-mercapto hasta una concentración del 0,5 %. Para obtener los mejores resultados, prepare la solución desnaturalizante fresca cada vez. Alternativamente, utilice tampón con menos de una semana de antigüedad que se haya mantenido a cuatro grados Celsius. Para el siguiente paso, necesitará un recipiente con nitrógeno líquido, un autoclave y un mortero, un pistilo y una espátula previamente enfriados.

Coloque una muestra de suelo congelado de dos gramos en el mortero previamente enfriado. Añada un mililitro de la solución desnaturalizante. Luego, agregue nitrógeno líquido hasta cubrir completamente el suelo.

Utilice un mortero previamente enfriado para moler la muestra hasta que las partículas de suelo tengan aspecto pulverulento y homogéneo y la muestra comience a fundirse. A continuación, agregue más nitrógeno líquido y repita el paso de molienda. Esto completa el paso de lisis celular utilizando una espátula previamente enfriada.

Transfiera la muestra pulverizada a un tubo cónico de 50 mililitros. Mantenga la muestra en hielo para proceder inmediatamente al paso de extracción de ADN o almacénela a menos 80 grados Celsius. Para uso en litros, justo antes de comenzar la extracción de ADN, complete el tampón de extracción añadiendo bromuro de hexadeciltrimetilamonio o CTAB y SDS primero.

Compruebe si el CTAB está cristalizado, y en caso afirmativo, disuélvalo a 60 grados Celsius antes de continuar. A continuación, añádalo a la solución para obtener una concentración total del 1%. Después, agregue la solución de SDS al 20% para alcanzar una concentración final del 2%. La suspensión lechosa que se forma es normal.

Una vez que se haya agregado el SDS, mantenga el tampón de extracción completado homogéneo almacenándolo a 60 grados Celsius durante 10 a 15 minutos. Una vez que el tampón de extracción esté bien disuelto y homogéneo, agregue nueve mililitros de tampón de extracción a la muestra de suelo y vortexee brevemente a baja velocidad para mezclar. Incube la muestra con el tampón de extracción en un horno de hibridación a 65 grados Celsius durante 40 minutos.

Durante la incubación, invierta suavemente los tubos cada 10 minutos o rote continuamente los tubos a la velocidad más baja del rotor. Durante la incubación, la solución puede presentar una ligera viscosidad tras la incubación. El siguiente paso consiste en utilizar cloroformo-álcohol isoamílico para purificar el ADN separándolo del material orgánico presente en la mezcla de lisis.

Comience por centrifugar la muestra durante 10 minutos a 1800 Gs a aproximadamente 10 a 14 grados Celsius en la campana, recolecte el sobrenadante que contiene ADN deslizando cuidadosamente la punta de su pipeta a lo largo del costado del tubo, evitando la capa beige en la parte superior y la capa orgánica en la parte inferior. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 50 mililitros previamente enfriado que contenga 20 mililitros de alcohol ISL de cloroformo o i a a a continuación, repita el proceso de extracción otras dos veces en la misma muestra. Mientras tanto, mantenga el extracto de ADN y el cloroformo i a a sobre hielo en la campana.

Para la segunda extracción de ADN, regrese al tubo que contiene el pellet de suelo con el tampón de extracción residual y agregue cinco mililitros más de tampón de extracción. Mezcle suavemente con una punta de un mililitro y vortexee brevemente para resuspender el pellet como antes. Incube esta vez a 65 grados Celsius durante 10 minutos.

Luego, centrifugue a 1800 Gs durante 10 minutos. A aproximadamente 10 a 14 grados Celsius en la campana, transfiera el sobrenadante al tubo que contiene cloroformo, alcohol isoamílico o cloroformo i a a y el sobrenadante de la extracción anterior. Repita todo el proceso de extracción una vez más para extraer la mayor cantidad posible de ADN de la muestra de suelo.

Cuando haya completado un total de tres extracciones en su muestra de suelo, agite muy suavemente el tubo que contiene el sobrenadante recolectado y cloroformo i a a en una placa rotatoria a 1.25 RRP m durante 10 minutos. Después de esta etapa de mezclado, centrifugue el tubo a 1800 Gs durante 20 minutos a aproximadamente 10-14 grados Celsius. Tras la centrifugación, transfiera cuidadosamente la fase acuosa a un nuevo tubo de ultracentrífuga, dejando uno o dos mililitros de SNAT para evitar perturbar la interfase entre las fases acuosa y orgánica. Ahora, para precipitar el ADN, agregue 0.6 mililitros de alcohol isopropílico.

A cada mililitro del sobrenadante recolectado, invierta suavemente los tubos varias veces para mezclar. En este momento, es posible que pueda ver el precipitado de ADN formándose en largos hilos. A continuación, incube el ADN con el isopropanol durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después de la incubación, es momento de pelotar el ADN mediante centrifugación; marque una esquina del tubo al colocarlo en la centrífuga para saber dónde esperar el pellet de ADN. Centrifugue a 16.000 ×g durante 20 minutos a una temperatura de 20 a 25 grados Celsius. Tras la centrifugación, elimine el alcohol isopropílico vertiéndolo o mediante succión al vacío. Tenga cuidado de no perder el pellet de ADN, cuyo tamaño varía desde apenas visible hasta nueve milímetros de ancho, dependiendo de la eficiencia de la extracción y de la biomasa presente en las muestras de suelo. Seque el pellet de ADN a temperatura ambiente durante cinco a 20 minutos. Tenga cuidado de no secarlo en exceso cuando el pellet esté seco.

ReSuspender el ADN en 200 a 400 microlitros de te. Mezclar mediante golpecitos suaves. Transferir la solución de ADN a un tubo de 1,5 mililitros.

Mantenga el ADN a cuatro grados Celsius durante la noche. Para disolver completamente el ADN una vez que se ha extraído de la muestra de suelo, los pasos restantes para verificar la concentración e integridad del ADN de la muestra son procedimientos estándar, que se describen en detalle en otro protocolo de JoVE del laboratorio Hallam. Determine la concentración de ADN utilizando el método de su elección.

También verifique la integridad del ADN de alto peso molecular mediante la electroforesis en gel con campo pulsado o PFGE, utilizando entre 10 y 20 microlitros de su muestra de ADN. El tamaño mediano del ADN debe ser de 36 kilobases o mayor, dependiendo de su aplicación posterior. Continúe con el siguiente paso de centrifugación en gradiente de cloruro de cesio; alternativamente, el ADN puede almacenarse a menos 20 grados Celsius o menos 80 grados Celsius antes de la ultracentrifugación.

El siguiente paso consiste en utilizar la centrifugación en gradiente de cloruro de cesio para purificar aún más el ADN eliminando las impurezas, tras lo cual se concentra y se purifica adicionalmente el ADN mediante dispositivos de filtración centrífuga AmCon y MicroCon. La centrifugación en gradiente de cloruro de cesio es fundamental para obtener ADN de alta calidad y se describe detalladamente en otro protocolo de JoVE del laboratorio Hallam. Tras realizar los pasos de centrifugación en gradiente de cloruro de cesio y concentración, verifique la concentración de ADN utilizando el método de su elección.

A continuación, verifique una vez más la integridad del ADN de alto peso molecular analizando una pequeña muestra del ADN mediante electroforesis en gel pulsado (PFGE). La cantidad total de ADN genómico aislado a partir de dos gramos de suelo forzado oscila entre 10 y 180 microgramos, como se muestra en la electroforesis realizada antes y después de la ultracentrifugación en cloruro de cesio. El rango de tamaño del ADN aislado suele oscilar entre 40 y 60 kilobases; aquí se muestra un cromatograma de muestras de ADN genómico antes y después de la ultracentrifugación en cloruro de cesio.

Este paso mejora la pureza del ADN, aumentando la relación 260 sobre 280 de 1,3 a 1,6 antes, a 1,8 a 1,9 después. Además, el pico de absorbancia a 230 nanómetros, que indica contaminación por ácido húmico, se redujo satisfactoriamente tras la centrifugación. Acabamos de mostrarle cómo aislar ADN genómico de alto peso molecular de comunidades microbianas del suelo.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar preparar el tampón de extracción y el tampón desnaturalizante siguiendo con precisión las instrucciones. Tenga cuidado de no alcanzar su paleta de ADN después de la precipitación con alcohol isopropílico. Cuando recupere la banda de ADN tras la centrifugación en gradiente de cloruro.

No olvide enjuagar la jeringa con el tampón TE para maximizar la recuperación del ADN. Y finalmente, verifique la cantidad y calidad del ADN aislado en todos los pasos sugeridos. Eso es todo.

Gracias por ver el video y mucha suerte con su experimento.