La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

Hola, soy San Lee del laboratorio de Stephen Harlem en el Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Columbia Británica. Hoy les mostramos un procedimiento para la extracción de ADN genómico de alto peso molecular del bosque al suelo que también es aplicable a una amplia variedad de tipos de suelos y sedimentos. Utilizamos la genómica de alto peso molecular, el ADN, para construir la biblioteca de medidores forestales de las comunidades microbianas del suelo.

Con estas bibliotecas en la mano, podemos estudiar la diversidad y el potencial metabólico de las comunidades microbianas que se dividen entre diferentes horizontes del suelo. Así que comencemos. Este protocolo comienza con la lisis celular.

El primer paso es completar el tampón desnaturalizante agregando etanol betta mer capto a una concentración de 0.5%Para obtener mejores resultados, haga que la solución desnaturalizante esté fresca cada vez. Alternativamente, use un tampón de menos de una semana que se haya mantenido a cuatro grados centígrados. Para el siguiente paso, necesitará un hacedor de nitrógeno líquido y un autoclave y un mortero y una espátula preenfriados.

Coloque una muestra de suelo congelado de dos gramos en el mortero preenfriado. Agrega un mililitro de la solución desnaturalizante. Luego agregue nitrógeno líquido para cubrir completamente el suelo.

Use un mortero preenfriado para moler la muestra hasta que las partículas de tierra se vean polvorientas y homogéneas y la muestra comience a derretirse. Luego agregue más nitrógeno líquido y repita el paso de molienda. Esto completa el paso de lisis celular utilizando una espátula preenfriada.

Transfiera la muestra molida a un tubo cónico de 50 mililitros. Mantenga la muestra en hielo para proceder inmediatamente a la etapa de extracción de ADN o almacene a menos 80 grados centígrados. Para el uso de litros, justo antes de comenzar la extracción de ADN, complete el tampón de extracción agregando bromuro de trimetilamonio hexa deco o CTAB y SDS. Primero.

Compruebe si el CTAB está cristalizado y, de ser así, disuélvalo a 60 grados centígrados antes de continuar. Luego agréguelo a la solución para obtener una concentración total de 1%A continuación, agregue 20%SDS solución a una concentración final de 2%La suspensión lechosa. Eso se forma es normal.

Una vez que se haya agregado la SDS, mantenga homogéneo el tampón de extracción completo almacenándolo a 60 grados centígrados después de 10 a 15 minutos. Una vez que el tampón de extracción esté bien disuelto y homogéneo, agregue nueve mililitros de tampón de extracción a la muestra de suelo y vórtice brevemente a baja velocidad para mezclar. Incubar la muestra con tampón de extracción en un horno de hibridación a 65 grados centígrados durante 40 minutos.

Durante la incubación, invierta suavemente los tubos cada 10 minutos o gírelos continuamente a la velocidad más baja del rotor. Durante la incubación, la solución puede parecer ligeramente viscosa después de la incubación. El siguiente paso es usar alcohol isoamílico de cloroformo para purificar el ADN y alejarlo del material orgánico en la mezcla de lisis.

Comience centrifugando la muestra durante 10 minutos a 1800 Gs a unos 10 a 14 grados centígrados en la campana, recoja el ADN que contiene el sobrenadante deslizando con cuidado la punta de la pipeta por el lado del tubo, evitando la capa beige en la parte superior y la capa orgánica en la parte inferior. Transfiera el sobrenadante a un tubo preenfriado de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de alcohol cloroformo ISL o a continuación, repita el proceso de extracción dos veces más en la misma muestra. Mientras tanto, mantenga el extracto de ADN y el cloroformo en hielo en el capó.

Para la segunda extracción de ADN, regrese al tubo que contiene el pellet de tierra con tampón de extracción residual y agregue cinco mililitros más de tampón de extracción. Revuelva suavemente con una punta de un mililitro para mezclar y agite brevemente para volver a suspender el pellet como antes. Incuba a 65 grados centígrados esta vez durante 10 minutos.

Luego centrifugar a 1800 Gs durante 10 minutos. A unos 10 a 14 grados centígrados en la campana, transfiera el sobrenadante al tubo que contiene cloroformo, alcohol isoamílico o cloroformo i a a y el sobrenadante de la extracción anterior. Repita todo el proceso de extracción una vez más para extraer la mayor cantidad de ADN posible de la muestra de suelo.

Cuando haya completado un total de tres extracciones en su muestra de suelo, agite muy suavemente el tubo que contiene el supranadante recogido y el cloroformo i a a en una placa giratoria a 1,25 RRP m durante 10 minutos. Después de este paso de mezcla, centrifugar el tubo a 1800 Gs durante 20 minutos a unos 10 a 14 grados centígrados. Después de la centrifugación, transfiera con cuidado la fase acuosa a un nuevo tubo de ultracentrífuga, dejando uno o dos mililitros de SNAT para evitar perturbar la interfaz entre las fases acuosa y orgánica. Ahora, para precipitar el ADN, agregue 0,6 mililitros de alcohol isopropílico.

Por cada mililitro de sobrenadante recogido, invierta los tubos suavemente unas cuantas veces para mezclar. En este punto, es posible que puedas ver que el ADN se precipita en hilos largos. A continuación, incubar el ADN con el isopropanol durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después de la incubación, es el momento de pellet el ADN por centrifugación, marque una esquina del tubo a medida que lo coloca en la centrífuga para que sepa dónde esperar el pellet de ADN. Gire a 16, 000 GS durante 20 minutos a 20 a 25 grados centígrados después de la centrifugación, retire el alcohol isopropílico por decantación y/o succión al vacío. Tenga cuidado de no perder el pellet de ADN, que varía en tamaño desde apenas visible hasta nueve milímetros de ancho, dependiendo de la eficiencia de extracción y la biomasa en las muestras de suelo, seque el pellet de ADN a temperatura ambiente durante cinco a 20 minutos. Tenga cuidado de no secar demasiado cuando el pellet esté seco.

Vuelva a suspender el ADN en 200 a 400 microlitros de te. Mézclalo dando golpecitos suaves. Transfiera la solución de ADN a un tubo de 1,5 mililitros.

Mantenga el ADN a cuatro grados centígrados durante la noche. Con el fin de disolver completamente el ADN una vez que el ADN se ha extraído de la muestra de suelo, los pasos restantes para verificar la concentración y la integridad del ADN de la muestra son procedimientos estándar, que se describen en detalle en otro protocolo JoVE del laboratorio Hallam. Determine la concentración de ADN utilizando el método de su elección.

También verifique la integridad del ADN de alto peso molecular agotando de 10 a 20 microlitros de su muestra de ADN utilizando electroforesis en gel de campo pulsado o PFGE. El tamaño medio del ADN debe ser de 36 kilobases o más, dependiendo de su aplicación posterior. Proceda al siguiente paso de centrífuga de gradiente de cloruro de cesio alternativamente, el ADN se puede almacenar a menos 20 grados Celsius o menos 80 grados Celsius antes de la ultracentrifugación.

El siguiente paso es utilizar la centrifugación en gradiente de cloruro de cesio para purificar aún más el ADN mediante la eliminación de impurezas, siguiendo el concentrado de centrifugación en gradiente de cloruro de cesio, y purificar aún más el ADN utilizando dispositivos de filtro centrífugo AmCon y MicroCon. La centrifugación en gradiente de cloruro de cesio es clave para lograr ADN de alta calidad y se describe en detalle en otro protocolo JoVE del laboratorio Hallam. Después de realizar los pasos de centrifugación y concentración en gradiente de cloruro de cesio, verifique la concentración de ADN utilizando el método de su elección.

A continuación, compruebe la integridad del ADN de alto peso molecular una vez más utilizando una pequeña muestra del ADN utilizando PFGE. La cantidad total de ADN genómico aislado de dos gramos de suelo forzado oscila entre 10 y 180 microgramos, como se muestra en la ejecución del gel antes y después de la ultracentrifugación de cloruro de cesio. El rango de tamaño del ADN aislado generalmente oscila entre 40 y 60 kilobases, aquí se muestra un cromatograma de muestras de ADN genómico antes y después de la ultracentrifugación de cloruro de cesio.

Este paso mejora la pureza del ADN, aumentando la proporción de dos 60 sobre dos 80 de 1,3 a 1,6 antes a 1,8 a 1,9 después. Además, la absorbancia máxima a 230 nanómetros, lo que implica que la contaminación por ácido húmico se redujo con éxito después de la centrifugación. Acabamos de mostrarle cómo aislar el ADN genómico de alta molécula de las comunidades microbianas del suelo.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar hacer el tampón de extracción y desnaturalización siguiendo exactamente las instrucciones. Y tenga cuidado de no llegar a su paladar de ADN después de la precipitación de alcohol isopropílico. Cuando se recupera la banda de ADN después de la concentración en gradiente de cloruro.

No olvide enjuagar la jeringa con el TE para maximizar la recuperación del ADN. Y, por último, comprobar la cantidad y calidad de su ADN aislado en todos los pasos sugeridos. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tu experimento.