Name: La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-10T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprende a extraer ADN genómico de alto peso molecular de suelos y sedimentos para estudiar comunidades microbianas. Este método permite analizar la diversidad y el potencial metabólico de microorganismos en diferentes horizontes del suelo.

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Nos gustaría agradecer a la Fundación Canadiense para la Innovación, de la Columbia Británica Fondo para el Desarrollo del Conocimiento, Genoma Columbia Británica y el British Columbia Ministerio de Bosques y de rango para el apoyo a los estudios en curso de la productividad del suelo forestal. SL fue apoyado por una beca de la Fundación Centro TULA financiado por la diversidad microbiana y la evolución.

Parte I: La extracción de ADN Procedimiento 1. 8 horas son necesarias, para el procesamiento de seis muestras de exclusión de la cuantificación de ADN. Antes de iniciar la extracción, tendrá que pre-chill mortero, mano de mortero y una espátula en un congelador a -20 ° C o el uso de nitrógeno líquido. Además, pre-frío tubos de 50 ml que contiene 20 ml de cloroformo alcohol isoamílico (24:1) en el hielo. Ajuste el horno de hibridación a 65 ° C para precalentar. Compruebe solución CTAB, si se cristaliza caliente a 60 ° C para fundir los cristales. Completar la solución de desnaturalización y tampón de extracción mediante la adición de los últimos ingredientes justo antes de iniciar la extracción (ver receta a continuación). Llevar a cabo todos los procedimientos de extracción en una campana extractora. 2. Prepare el tampón de desnaturalización y tampón de extracción. Nota: Para maximizar el rendimiento de ADN, es fundamental para hacer precisamente buffers siguiendo las instrucciones. 3. Poner 2 g de suelo en un mortero previamente enfriado. Nota: Suelo recolectado en el campo debe ser congelado en hielo seco para el transporte y se almacenan a -80 ° C. Deshielo y el suelo tamizado con un tamiz de 2 mm antes de la extracción de ADN. Puede aumentar el importe de partida de suelo de hasta 10 g. 4. Añadir 1 ml de solución de desnaturalización de la tierra. 5. Congelar y triturar el suelo en N 2 líquido utilizando un mortero hasta que las partículas del suelo mirar en polvo y homogénea. Repetir dos veces por congelación y la trituración. Nota: Mantenga la muestra de suelo helado durante la molienda, utilizando nitrógeno líquido suficiente para cubrir la totalidad de la muestra de suelo. Fusión leve durante la molienda es aceptable. 6. Transferir el suelo de tierra a un tubo cónico de 50 ml con una espátula de pre-enfriado. Nota: La muestra de suelo de tierra pueden ser almacenadas a -80 ° C en este punto, si es necesario. 7. Añadir 9 ml de tampón de extracción. Para mezclar la solución y el suelo, agitar brevemente a baja velocidad. Nota: Para garantizar el buffer es homogénea, que se caliente a 60 ° C durante 10-15 minutos antes de su uso. Mantenga el resto de amortiguamiento a 60 ° C a lo largo de la extracción. Vortex a velocidad 8 (en una escala donde 10 es el máximo). 8. Incubar durante 40 min a 65 ° C en un horno de hibridación. Durante la incubación, girar continuamente los tubos a la velocidad más baja, o invierta suavemente los tubos cada 10 min. Nota: Coloque el tubo en horizontal en un horno de hibridación para permitir buffer ponerse en contacto con el suelo sobre una superficie más grande. La solución puede parecer un poco viscosa durante la incubación. 9. Centrifugar a 1800 x g, durante 10 minutos a 10-14 ° C. Transferir el sobrenadante en el pre-enfriado tubo cónico de 50 ml que contienen 20 ml de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), mantener en hielo. Nota: Cuando se transfiere el sobrenadante, tenga cuidado de no alterar la capa orgánica (capa inferior). Agregar 1-2 ml de sobrenadante, si es necesario con el fin de recoger sólo sobrenadante limpio. A menudo se puede ver una capa de color beige (aproximadamente 1-3 mm de espesor) en la parte superior del sobrenadante. No moleste a esta capa al recoger el sobrenadante. Pruebe a deslizar la punta a lo largo de la pared del tubo para evitar la rotura de esta capa de color beige. Si el sobrenadante es demasiado turbia, repetir la extracción de alcohol de cloroformo-isoamílico una vez más en el sobrenadante. No utilizar pipetas desechables de plástico para transferir el cloroformo, el cloroformo se derrita el plástico. Use una pipeta de vidrio, o un vaso cilindro graduado, o verter cloroformo directamente en tubos de 50 ml cónicos. 10. Extracto de las pastillas de suelo 2 veces más; 10.1. Añadir 5 ml de tampón de extracción de los sedimentos del suelo, mezcle suavemente con una punta ml seguido de agitación breve a baja velocidad. Nota: Agitar y mezclar el búfer antes de su uso. 10.2. Se incuba a 65 ° C durante 10 minutos en horno de hibridación. Centrifugar a 1800 x g, durante 10 minutos a 10-14 ° C. Transferir el sobrenadante en el tubo en el paso 9. Mantener el tubo con sobrenadante recogido y el alcohol cloroformo-isoamílico en hielo durante la extracción. Nota: Asegúrese de agregar el sobrenadante al mismo tubo, sin cruzar la mezcla entre las muestras. 10.3. Repetir 9.1 y 9.2 una vez más. 11. El uso de un plato giratorio, con mucha suavidad oscilar el tubo que contiene el sobrenadante recogido (14-19 ml) y cloroformo-alcohol isoamílico a 1,25 rpm durante 10 minutos. Nota: Cierre la tapa muy bien para evitar fugas. Coloque una toalla de papel en la placa oscilante antes de colocar el tubo de manera alguna fuga se puede detectar fácilmente. 12. Centrifugar a 1800 x g, durante 20 minutos a 10-14 ° C. 13. Transferencia de fase acuosa a un tubo nuevo. Nota: No molestar, la interfase entre la fase acuosa (capa superior) y organizacionesnic (capa inferior) cuando se transfiera el sobrenadante. Deje aproximadamente 1,5-2 ml de sobrenadante para garantizar la recogida de sólo sobrenadante limpio. 14. Recuperar el ADN con alcohol isopropílico (paso 15.a - 21.a). Por otra parte, el uso Amicon ® Ultra-15 dispositivos centrífugos de filtro (paso 15.b - 21.b) si espera muy baja cantidad de biomasa en la muestra, que se produce apenas visible precipitado por precipitación alcohol isopropílico que es difícil de recuperar. 15.a. Coloque el sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga nuevo. 16.a. Agregar el alcohol isopropílico al sobrenadante recogido en una proporción de volumen de 0,6:1. Invertir los tubos suavemente varias veces para mezclar. 17.a incuba durante 30 min a temperatura ambiente. 18.a. Centrifugar a 16.000 x g, durante 20 minutos a 20 - 25 ° C. Asegúrese de que los pesos de todos los tubos están bien equilibradas antes de la centrifugación. Nota: Marque la dirección de la fuerza centrífuga en el tubo, para que pueda detectar el pellet de ADN con mayor facilidad cuando el rendimiento de ADN es baja. 19.A. Eliminar el alcohol isopropílico por decantación o la aspiración al vacío. Tenga cuidado de no alterar el pellet de ADN. Nota: Eliminar el alcohol isopropílico, tan pronto como la centrifugación se ha completado. Tenga mucho cuidado de no perder el pellet de ADN. El tamaño del pellet de ADN puede variar ampliamente dependiendo del tipo de suelo, de muy visible (~ 9 mm de diámetro) que apenas se ve. Se recomienda para eliminar los residuos de alcohol isopropílico por la aspiración a lo largo de la pared del tubo que no cuidado para que al succionar el pellet de ADN. 20.A. Seco en pelets de ADN a temperatura ambiente durante 5 - 20 min. Nota: No más seco en pelets de ADN, de lo contrario será difícil de disolver el ADN. 21.A. Resuspender el pellet de ADN en 200 l de TE. Se mezcla con unos golpecitos suaves. La transferencia de la solución de ADN en un tubo de 1,5 ml. Mantener el tubo a 4 ° C durante la noche con el fin de disolver completamente el ADN. Nota: Dependiendo del tamaño del pellet, es posible ajustar el volumen de TE que añadir. Por lo general, 200 a 400 l de TE funciona bien. * Como alternativa, siga los pasos 15.b - 21.b. 15.b. Prelavado un Amicon ® Ultra-15 dispositivos de filtro centrífugo, agregar 15 ml de TE en el dispositivo y se centrifuga a 3500 x g, durante 10 minutos. Deseche el flujo continuo. 16.b. Coloque la solución de ADN a partir del paso 13 al filtro Amicon pre-lavado. Centrifugar a 3500 x g hasta que el volumen del ADN se reduce a 200 a 500 l. Deseche el flujo continuo. 17.B. Lavar el ADN con el doble de TE, agregar 10 ml de TE a los dispositivos de Amicon filtro. Centrifugar a 3500 x g hasta que el volumen del ADN se reduce a aproximadamente 200 l. Deseche el flujo continuo. Repetir una vez más. 18.b. La transferencia de la solución de ADN en el filtro a un tubo de 1,5 ml nuevo. 19.b. Añadir 40 ml TE al filtro Amicon. Lave ambos lados de la membrana de filtro pipeteando arriba y abajo con el fin de recuperar los residuos de ADN en el filtro. Añadir esta solución de lavado en el tubo de paso 18.b. 20.b. Si es necesario, el ADN puede ser más concentrado por Microcon ® Ultracel YM-30 Unidad de filtro centrífugo, pre-lavado del filtro mediante la adición de 200 l de TE y centrifugar a 10.000 x g durante 7 minutos. Añadir la solución de ADN al filtro y centrifugar a 5000 x g durante 1 min. Repetir la centrifugación hasta que la cantidad de solución de ADN en el filtro reduce a 50 l aproximadamente. Nota: El volumen máximo inicial de la muestra para Microcon filtro es de 500 l. No centrifugar a velocidades de más de 14.000 x g. No más de centrífuga hasta que se seque completamente la membrana. Asegúrese de que algo de líquido todavía cubre el filtro después de la centrifugación. Si más de centrifugado y la membrana se seca, a continuación, añadir 15 l TE, se agita suavemente durante 30 segundos, y continúe con el paso 21.b. 21.b. Coloque la unidad del filtro boca abajo en un tubo de Microcon nuevas y centrifugar a 1000 xg durante 3 minutos para recuperar el ADN. 22. Cuantificar el ADN de gel de TAE (0,8%, 0.5xTAE, 50 V de 4 horas), y por espectrofotómetro Nanodrop o Pico-verde de ensayo y lector de placas. Nota: la cantidad de ADN se puede estimar mediante la comparación de la banda de la muestra a la banda con marcador de concentración conocida (marcadores moleculares de ADN de alta o λHindIII) en el gel. 23. Compruebe la integridad del ADN de alto peso molecular mediante electroforesis en campo pulsado (PFGE) con un 1%, 1xTAE gel (Para más detalles vea el Paso II, part2 en <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387</a> , doi: 10.3791/1387 por Taupp et al 2009).. Nota: Se puede utilizar gel de agarosa normal para este propósito de control de calidad en lugar de agarosa de baja fusión. En electropho breve,las condiciones de resistencia son los siguientes: 2-250 kb, 6 voltios, el tiempo inicial de conexión: 5 segundos, tiempo final de conmutación: 15 segundos, una duración de 12 horas a 14 ° C. SYBR Gold mancha durante una hora para visualizar el ADN en el gel. 24. Si los pesos moleculares de ADN extraído son satisfactorios, a continuación, proceder a la siguiente etapa CsCl centrifugación de gradiente. Por otra parte, el ADN puede ser almacenado a -20 ° C o -80 º C antes de la centrífuga CsCl. El tamaño medio del ADN debe ser igual o superior a 36 Kb, si usted quiere construir una gran inserción de la biblioteca metagenómica ADN. Parte II. De purificación de ADN usando ultracentrifugación gradiente de cloruro de cesio Preparación de la centrífuga: 1,5 - 2 horas Centrifugación: 18 horas La eliminación de bromuro de etidio (EtBr) y la concentración de ADN después de la centrifugación: 3 horas Procedimiento Para más información, consulte Wright et al. . 2.009 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> , doi: 10.3791/1352 Resultados representante / Resultados La cantidad total de ADN genómico aislado de 2 g de bosque orgánica del suelo (O horizonte) y horizontes minerales (AE, AB, y los horizontes Bt) (la muestra de la productividad del suelo a largo plazo (LTSP) sitio ubicado en Skulow lago, BC, Canadá y gestionados por BC Ministerio de Bosques y rango) fue de 10 mg a 180 mg. El tamaño medio de ADN fue aislado por lo general entre 40 a 60 kb (Figura 1). La relación de absorbancia a 260 nm/280 nm entre 1.3 a 1.6 y se produjo un pico de 230 nm, lo que puede indicar contaminación de ácidos húmicos observa con frecuencia en las muestras de suelo. La centrifugación en gradiente de CsCl reduce drásticamente la contaminación y también aumentó la proporción de 260/280 a 1,8 a 1,9 como se muestra en la Figura 2a y 2b. <img src="files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. PFGE imágenes del ADN genómico extraído antes de ultracentrifugación CsCl. lane1: 1 kb marcador de 100 ng, carril 2: λHind III marcador de 100 ng, carril 3: λHind III marcador de 250 ng, carril 4: λHind III marcador de 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb marcador de 100 ng, calle 6 y 7: genómica ADN aislado de las Ae horizonte mineral del suelo, carril 8 y 9: ADN genómico aislado de la AB horizonte mineral del suelo en el sitio LTSP encuentra Skulow lago, BC <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /></a> Chromograms la figura 2. De ADN genómico detectado por espectrofotometría antes (A) y después de la ultracentrifugación CsCl (B). Tenga en cuenta la reducción en el valor de absorbancia a la longitud de onda 230 nm después de la ultracentrifugación CsCl, lo que indica una mejora en la calidad del ADN genómico.

<ol><li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22AEM%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li>
<li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+insert+environmental+genomic+library+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Receta * La desnaturalización solución 4 M guanidina isotiocianato 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 1 mM EDTA 0,5% 2-mercaptoetanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Solución de desnaturalización: 10 ml en total </td></tr><tr><td> Guanidina isotiocianato (118,16 MW) </td><td> 4,73 g </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl (pH 7,0) </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> 20 l </td></tr><tr><td colspan="2"> Agregue el agua a 9,95 ml en total. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave. </td></tr><tr><td colspan="2"> Añadir 50 l de 2-mercaptoetanol justo antes del uso. (5 l de 2-mercaptoetanol por 1 ml de solución desnaturalizante) Nota: Mantenga la solución de desnaturalización a 4 ° C. No utilice buffer más de una semana. Si es posible, una solución tampón fresca para su uso. </td></tr></table> ** Tampón de extracción 100 mM tampón fosfato de sodio [pH 7.0] 100 mM Tris-HCl [pH 7.0] 100 mM EDTA [pH 8.0] 1,5 M NaCl 1% hexadeciltrimetilamonio (CTAB) SDS al 2% <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Buffer de extracción de una L en el total de </td></tr><tr><td> De sodio 1M tampón fosfato [pH 7.0] * </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl [pH 7.0] </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA [pH 8.0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave y conservar a temperatura ambiente. </td></tr><tr><td colspan="2"> Añadir 200 ml, el bromuro de 5% hexadeciltrimetilamonio (CTAB, autoclave) y 100 ml, 20% SDS (autoclave), justo antes de su uso. Si CTAB se cristalizó, se derrite a 60 ° C. * 1M tampón fosfato de sodio: 57,7 ml, de sodio 1M fosfato monobásico (NaH 2 PO 4) y 42,3 ml, 1 M de fosfato sódico dibásico (NaH 2 PO 4). Ajustar el pH a 7.0 Nota: No use el 20% SDS si tiene la precipitación. Es normal ver suspensión lechosa cuando se agrega a la solución de SDS. Una vez que se agrega el desarrollo sostenible, colocar el tampón de extracción a 60 ° C para asegurar la SDS está bien suspendido. </td></tr></table>

la extracción de adn de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

El microbioma del suelo es un reservorio inmenso y relativamente inexplorado de la diversidad genómica y la innovación metabólica que está íntimamente asociado a los nutrientes y el flujo de energía dentro de los ecosistemas terrestres. Cultivo independiente de genómica ambiental, también se conoce como metagenómica, enfoques promesa de un acceso sin precedentes a esta información genética con respecto a la reconstrucción de la vía y el cribado funcional de alto valor terapéutico y los procesos de conversión de biomasa. Sin embargo, el microbioma de la tierra sigue siendo un reto en gran parte debido a la dificultad en la obtención de ADN de alto peso molecular de una calidad suficiente para la producción de grandes bibliotecas de inserción. Aquí presentamos un protocolo para la extracción de alto peso molecular, el ADN genómico de la comunidad microbiana de los suelos y sedimentos. La calidad del ADN genómico aislado es ideal para la construcción de grandes bibliotecas de insertar genómica ambiental para las aplicaciones posteriores de secuenciación y detección. El procedimiento se inicia con la lisis celular. Paredes y membranas celulares de los microorganismos se lisan por fuerzas mecánicas (trituración) y químicos (β-mercaptoetanol). ADN genómico se aísla con tampón de extracción, el alcohol cloroformo-isoamílico y alcohol isopropílico. Los tampones utilizados para la lisis y etapas de extracción incluyen isotiocianato de guanidina y el bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) para preservar la integridad de la alta molecular del ADN genómico de peso. Dependiendo de su aplicación posterior, el ADN genómico aislado puede ser purificado con cloruro de cesio (CsCl) ultracentrifugación gradiente, lo que reduce las impurezas tales como los ácidos húmicos. El primer procedimiento, la extracción, dura aproximadamente 8 horas, sin incluir la cuantificación de ADN paso. El gradiente de CsCl ultracentrifugación, es un proceso de dos días. Durante todo el procedimiento, el ADN genómico debe ser tratada con cuidado para evitar la esquila, evitar la agitación grave y dura pipeteo repetitivo.

Una metodología para aislar de alto peso molecular y ADN genómico de alta calidad de la comunidad microbiana del suelo se describe.

La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

El microbioma del suelo es un vasto y relativamente inexplorado reservorio de diversidad genómica e innovación metabólica que está íntimamente asociado con...

Hola, soy San Lee del laboratorio de Stephen Harlem en el Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Columbia Británica. Hoy les mostramos un procedimiento para la extracción de ADN genómico de alto peso molecular a partir de suelo forestal, que también es aplicable a una amplia variedad de tipos de suelo y sedimento. Utilizamos el ADN genómico de alto peso molecular para construir la biblioteca metagenómica de las comunidades microbianas del suelo.Con estas bibliotecas en mano, podemos estudiar la diversidad y el potencial metabólico de las comunidades microbianas distribuidas entre diferentes horizontes del suelo. Así que comencemos. Este protocolo comienza con la lisis celular.El primer paso consiste en completar el tampón desnaturalizante añadiendo etanol beta-mercapto hasta una concentración del 0,5 %. Para obtener los mejores resultados, prepare la solución desnaturalizante fresca cada vez. Alternativamente, utilice tampón con menos de una semana de antigüedad que se haya mantenido a cuatro grados Celsius. Para el siguiente paso, necesitará un recipiente con nitrógeno líquido, un autoclave y un mortero, un pistilo y una espátula previamente enfriados. Coloque una muestra de suelo congelado de dos gramos en el mortero previamente enfriado. Añada un mililitro de la solución desnaturalizante. Luego, agregue nitrógeno líquido hasta cubrir completamente el suelo.Utilice un mortero previamente enfriado para moler la muestra hasta que las partículas de suelo tengan aspecto pulverulento y homogéneo y la muestra comience a fundirse. A continuación, agregue más nitrógeno líquido y repita el paso de molienda. Esto completa el paso de lisis celular utilizando una espátula previamente enfriada.Transfiera la muestra pulverizada a un tubo cónico de 50 mililitros. Mantenga la muestra en hielo para proceder inmediatamente al paso de extracción de ADN o almacénela a menos 80 grados Celsius. Para uso en litros, justo antes de comenzar la extracción de ADN, complete el tampón de extracción añadiendo bromuro de hexadeciltrimetilamonio o CTAB y SDS primero.Compruebe si el CTAB está cristalizado, y en caso afirmativo, disuélvalo a 60 grados Celsius antes de continuar. A continuación, añádalo a la solución para obtener una concentración total del 1%. Después, agregue la solución de SDS al 20% para alcanzar una concentración final del 2%. La suspensión lechosa que se forma es normal.Una vez que se haya agregado el SDS, mantenga el tampón de extracción completado homogéneo almacenándolo a 60 grados Celsius durante 10 a 15 minutos. Una vez que el tampón de extracción esté bien disuelto y homogéneo, agregue nueve mililitros de tampón de extracción a la muestra de suelo y vortexee brevemente a baja velocidad para mezclar. Incube la muestra con el tampón de extracción en un horno de hibridación a 65 grados Celsius durante 40 minutos.Durante la incubación, invierta suavemente los tubos cada 10 minutos o rote continuamente los tubos a la velocidad más baja del rotor. Durante la incubación, la solución puede presentar una ligera viscosidad tras la incubación. El siguiente paso consiste en utilizar cloroformo-álcohol isoamílico para purificar el ADN separándolo del material orgánico presente en la mezcla de lisis.Comience por centrifugar la muestra durante 10 minutos a 1800 Gs a aproximadamente 10 a 14 grados Celsius en la campana, recolecte el sobrenadante que contiene ADN deslizando cuidadosamente la punta de su pipeta a lo largo del costado del tubo, evitando la capa beige en la parte superior y la capa orgánica en la parte inferior. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 50 mililitros previamente enfriado que contenga 20 mililitros de alcohol ISL de cloroformo o i a a a continuación, repita el proceso de extracción otras dos veces en la misma muestra. Mientras tanto, mantenga el extracto de ADN y el cloroformo i a a sobre hielo en la campana.Para la segunda extracción de ADN, regrese al tubo que contiene el pellet de suelo con el tampón de extracción residual y agregue cinco mililitros más de tampón de extracción. Mezcle suavemente con una punta de un mililitro y vortexee brevemente para resuspender el pellet como antes. Incube esta vez a 65 grados Celsius durante 10 minutos.Luego, centrifugue a 1800 Gs durante 10 minutos. A aproximadamente 10 a 14 grados Celsius en la campana, transfiera el sobrenadante al tubo que contiene cloroformo, alcohol isoamílico o cloroformo i a a y el sobrenadante de la extracción anterior. Repita todo el proceso de extracción una vez más para extraer la mayor cantidad posible de ADN de la muestra de suelo.Cuando haya completado un total de tres extracciones en su muestra de suelo, agite muy suavemente el tubo que contiene el sobrenadante recolectado y cloroformo i a a en una placa rotatoria a 1.25 RRP m durante 10 minutos. Después de esta etapa de mezclado, centrifugue el tubo a 1800 Gs durante 20 minutos a aproximadamente 10-14 grados Celsius. Tras la centrifugación, transfiera cuidadosamente la fase acuosa a un nuevo tubo de ultracentrífuga, dejando uno o dos mililitros de SNAT para evitar perturbar la interfase entre las fases acuosa y orgánica. Ahora, para precipitar el ADN, agregue 0.6 mililitros de alcohol isopropílico.A cada mililitro del sobrenadante recolectado, invierta suavemente los tubos varias veces para mezclar. En este momento, es posible que pueda ver el precipitado de ADN formándose en largos hilos. A continuación, incube el ADN con el isopropanol durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después de la incubación, es momento de pelotar el ADN mediante centrifugación; marque una esquina del tubo al colocarlo en la centrífuga para saber dónde esperar el pellet de ADN. Centrifugue a 16.000 ×g durante 20 minutos a una temperatura de 20 a 25 grados Celsius. Tras la centrifugación, elimine el alcohol isopropílico vertiéndolo o mediante succión al vacío. Tenga cuidado de no perder el pellet de ADN, cuyo tamaño varía desde apenas visible hasta nueve milímetros de ancho, dependiendo de la eficiencia de la extracción y de la biomasa presente en las muestras de suelo. Seque el pellet de ADN a temperatura ambiente durante cinco a 20 minutos. Tenga cuidado de no secarlo en exceso cuando el pellet esté seco.ReSuspender el ADN en 200 a 400 microlitros de te. Mezclar mediante golpecitos suaves. Transferir la solución de ADN a un tubo de 1,5 mililitros.Mantenga el ADN a cuatro grados Celsius durante la noche. Para disolver completamente el ADN una vez que se ha extraído de la muestra de suelo, los pasos restantes para verificar la concentración e integridad del ADN de la muestra son procedimientos estándar, que se describen en detalle en otro protocolo de JoVE del laboratorio Hallam. Determine la concentración de ADN utilizando el método de su elección.También verifique la integridad del ADN de alto peso molecular mediante la electroforesis en gel con campo pulsado o PFGE, utilizando entre 10 y 20 microlitros de su muestra de ADN. El tamaño mediano del ADN debe ser de 36 kilobases o mayor, dependiendo de su aplicación posterior. Continúe con el siguiente paso de centrifugación en gradiente de cloruro de cesio; alternativamente, el ADN puede almacenarse a menos 20 grados Celsius o menos 80 grados Celsius antes de la ultracentrifugación.El siguiente paso consiste en utilizar la centrifugación en gradiente de cloruro de cesio para purificar aún más el ADN eliminando las impurezas, tras lo cual se concentra y se purifica adicionalmente el ADN mediante dispositivos de filtración centrífuga AmCon y MicroCon. La centrifugación en gradiente de cloruro de cesio es fundamental para obtener ADN de alta calidad y se describe detalladamente en otro protocolo de JoVE del laboratorio Hallam. Tras realizar los pasos de centrifugación en gradiente de cloruro de cesio y concentración, verifique la concentración de ADN utilizando el método de su elección.A continuación, verifique una vez más la integridad del ADN de alto peso molecular analizando una pequeña muestra del ADN mediante electroforesis en gel pulsado (PFGE). La cantidad total de ADN genómico aislado a partir de dos gramos de suelo forzado oscila entre 10 y 180 microgramos, como se muestra en la electroforesis realizada antes y después de la ultracentrifugación en cloruro de cesio. El rango de tamaño del ADN aislado suele oscilar entre 40 y 60 kilobases; aquí se muestra un cromatograma de muestras de ADN genómico antes y después de la ultracentrifugación en cloruro de cesio.Este paso mejora la pureza del ADN, aumentando la relación 260 sobre 280 de 1,3 a 1,6 antes, a 1,8 a 1,9 después. Además, el pico de absorbancia a 230 nanómetros, que indica contaminación por ácido húmico, se redujo satisfactoriamente tras la centrifugación. Acabamos de mostrarle cómo aislar ADN genómico de alto peso molecular de comunidades microbianas del suelo.Al realizar este procedimiento, es importante recordar preparar el tampón de extracción y el tampón desnaturalizante siguiendo con precisión las instrucciones. Tenga cuidado de no alcanzar su paleta de ADN después de la precipitación con alcohol isopropílico. Cuando recupere la banda de ADN tras la centrifugación en gradiente de cloruro.No olvide enjuagar la jeringa con el tampón TE para maximizar la recuperación del ADN. Y finalmente, verifique la cantidad y calidad del ADN aislado en todos los pasos sugeridos. Eso es todo.Gracias por ver el video y mucha suerte con su experimento.

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Investigación

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Biología

Se describe un método para la extracción de ADN de alto peso molecular genómico a partir de biomasa planctónica se concentró en 0,22 micras filtros Sterivex, seguido por centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio para la purificación.

Extracción de ADN de 0,22 M Filtros Sterivex y centrifugación de densidad de cloruro de cesio Gradient

Este video muestra el protocolo para la extracción de ADN de fijado en formol e incluido en parafina de material. Este es un procedimiento de varios días en los que las secciones de tejido se deparaffinized con xileno, rehidratada con etanol y se tratan con proteinasa K para purificar y aislar el ADN para su posterior análisis de genes específicos o en todo el genoma.

Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos

Ofrecemos un protocolo mejorado para la extracción de ADN de alto peso molecular de tapetes microbianos hipersalinos. Las células microbianas son separados de la matriz de alfombra antes de la extracción y purificación del ADN. Esto mejora la concentración, calidad y tamaño de la DNA. El protocolo puede ser utilizado para otras muestras de refractario.

La extracción de ADN de alto peso molecular a partir de tapetes microbianos

extracción de ADN de la saliva puede proporcionar una fuente fácilmente disponible de ADN de alto peso molecular, con poca o ninguna degradación/fragmentación.  Este protocolo proporciona parámetros optimizados para la recolección/almacenamiento de saliva y la extracción de ADN para que sean de calidad y cantidad suficientes para ensayos de ADN posteriores con requisitos de alta calidad.

Recolección y extracción de ADN de la saliva de Next Generation Sequencing

La criosfera ofrece acceso a los organismos conservados que persistieron en las condiciones ambientales del pasado. Un protocolo se presentará a recoger y descontaminar los núcleos de permafrost de suelos y hielo. La ausencia de colonias exógenos y el ADN sugiere que los microorganismos detectados representan el material, en lugar de la contaminación de la perforación o de procesamiento.

La eliminación de materiales exógenos de la parte exterior de congelados Núcleos para Investigar la antigua comunidades biológicas albergaba el interior

Aquí se describe un método para la extracción, purificación y control de calidad del ADN genómico del patógeno fúngico biotrófico obligado, el mildiú polvoriento, para su uso en la secuenciación del genoma de lectura larga.

Purificación de ADN de alto peso molecular genómico de oídio para Long-Read Sequencing

Aquí, describimos un protocolo para obtener datos de la secuencia del amplicón del suelo, rizosfera y raíz endosphere microbiomes. Esta información puede utilizarse para investigar la composición y diversidad de las comunidades microbianas asociadas de planta y es conveniente para el uso con una amplia gama de especies de plantas.

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

Aquí, presentamos una técnica simple para evaluar la resistencia a los antimicrobianos (RAM) ambiental mediante el aumento de la proporción de ADN extracelular de bajo peso molecular. El tratamiento previo con PEG al 20%-30% y NaCl 1,2 M permite la detección de genes de AMR tanto genómicos como transferidos horizontalmente. El protocolo se presta a un proceso sin kits con optimización adicional.

Extracción mejorada de ADN de bajo peso molecular de aguas residuales para una evaluación integral de la resistencia a los antimicrobianos 

Este protocolo describe el método CTAB para extraer ADN de alta calidad de micobacterias, superando los desafíos que plantean sus duras paredes celulares ricas en ácido micólico. El proceso implica digestión enzimática, lisis celular con CTAB y purificación del ADN mediante extracción orgánica y precipitación de etanol. Este método produce ADN adecuado para estudios moleculares y es fiable para la investigación micobacteriana.

Extracción de ácido desoxirribonucleico de genoma completo de especies de Mycobacterium mediante la técnica de bromuro de cetiltrimetilatonio

El aislamiento de ADN genómico de colas de ratón

Aprende a extraer ADN genómico de alto peso molecular de suelos y sedimentos para estudiar comunidades microbianas. Este método permite analizar la diversidad y el potencial metabólico de microorganismos en diferentes horizontes del suelo.

La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

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