Name: Montaje, ajuste y uso de un microscopio de campo Apertureless de Infrarrojo Cercano para la imagen de proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-25T03:33:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Aprende a ensamblar y alinear un microscopio de infrarrojo de campo cercano para imagen de agregados proteicos. Este método combina microscopía de fuerza atómica y láser visible para optimizar la señal infrarroja.

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<ol><li>Mueller, K., Yang, X., Paulite, M., Fakhraai, Z., Gunari, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+imaging+of+the+surface+of+self-assembled+polystyrene-b-poly%28methyl+methacrylate%29+diblock+copolymer+films+using+apertureless+near-field+IR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Chemical imaging of the surface of self-assembled polystyrene-b-poly(methyl methacrylate) diblock copolymer films using apertureless near-field IR microscopy.</a> Langmuir. 24, 6946-6951 (2008).</li>
<li>Lahrech, A., Bachelot, R., Gleyzes, P., Boccara, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared-reflection-mode+near-field+microscopy+using+an+apertureless+probe+with+a+resolution+of+lambda%2F600%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Infrared-reflection-mode near-field microscopy using an apertureless probe with a resolution of lambda/600.</a> Opt. Lett. 21, 1315-1317 (1996).</li>
<li>Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+visible+and+mid-infrared+scattering-type+near-field+optical+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Performance of visible and mid-infrared scattering-type near-field optical microscopes.</a> J. Microsc. 210, 311-314 (2003).</li>
<li>Kim, Z. H., Leone, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-selective+mapping+of+near-field+intensity+and+phase+around+gold+nanoparticles+using+apertureless+near-field+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization-selective mapping of near-field intensity and phase around gold nanoparticles using apertureless near-field microscopy.</a> Optics Express. 16, 1733-1741 (2008).</li>
<li>Bridger, P. M., McGill, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nanometer-scale+optical+property+discrimination+by+use+of+a+near-field+scanning+apertureless+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of nanometer-scale optical property discrimination by use of a near-field scanning apertureless microscope.</a> Opt. Lett. 24, 1005-1007 (1999).</li>
<li>Stebounova, L., Akhremitchev, B. B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+weak+scattered+signal+in+apertureless+near-field+scanning+infrared+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the weak scattered signal in apertureless near-field scanning infrared microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 74, 3670-3674 (2003).</li>
<li>Akhremitchev, B. B., Pollack, S., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apertureless+Scanning+Near-Field+Infrared+Microscopy+of+a+Rough+Polymeric+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Apertureless Scanning Near-Field Infrared Microscopy of a Rough Polymeric Surface.</a> Langmuir. 17, 2774-2781 (2001).</li>
<li>Hecht, B., Bielefeldt, H., Inouye, Y., Pohl, D. W., Novotny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facts+and+Artifacts+in+Scanning+Near-Field+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Facts and Artifacts in Scanning Near-Field Optical Microscopy.</a> J. Appl. Phys. 81, 2492-2498 (1997).</li>
<li>Labardi, M., Patane, S., Allegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifact-free+near-field+optical+imaging+by+apertureless+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Artifact-free near-field optical imaging by apertureless microscopy.</a> Appl. Phys. Lett. 77, 621-623 (2000).</li>
<li>Palanker, D. V., Simanovskii, D. M., Huie, P., Smith, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+Contrast+Parameters+and+Topographic+Artifacts+in+Near-Field+Infrared+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">On Contrast Parameters and Topographic Artifacts in Near-Field Infrared Microscopy.</a> J. Appl. Phys. 88, 6808-6814 (2000).</li>
<li>Akhremitchev, B. B., Sun, Y., Stebounova, L., Walker, G. C. Monolayer-Sensitive Infrared Imaging of DNA Stripes Using Apertureless Near-Field Microscopy.Langmuir. 18, 5325-5328 (2002).</li>
<li>Brehm, M., Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+Spectroscopic+Mapping+of+Single+Nanoparticles+and+Viruses+at+Nanoscale+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Infrared Spectroscopic Mapping of Single Nanoparticles and Viruses at Nanoscale Resolution.</a> Nano Lett. 7, 1307-1310 (2006).</li>
<li>Dazzi, A., Prazeres, R., Glotin, F., Ortega, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nano-chemical+mapping+performed+by+an+AFM-based+%28%22AFMIR%22%29+acousto-optic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Analysis of nano-chemical mapping performed by an AFM-based ("AFMIR") acousto-optic technique.</a> Ultramicroscopy. 107, 1194-1200 (2007).</li>
<li>Yang, D. S., Yip, C. M., Huang, T. H. J., Chakrabartty, A., Fraser, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+the+Amyloid-%CE%B2+Aggregation+Pathway+with+Chemical+Chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Manipulating the Amyloid-β Aggregation Pathway with Chemical Chaperones.</a> J. Biol. Chem. 274, 32970-32974 (1999).</li>
<li>Meadows, P. Y., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Microscopy+Studies+of+Fibronectin+Adsorption+and+Subsequent+Cellular+Adhesion+to+Substrates+with+Well-Defined+Surface+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Force Microscopy Studies of Fibronectin Adsorption and Subsequent Cellular Adhesion to Substrates with Well-Defined Surface Chemistries.</a> Langmuir. 21, 4096-4107 (2005).</li>
</ol>

montaje, ajuste y uso de un microscopio de campo apertureless de infrarrojo cercano para la imagen de proteínas

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

Este documento tiene como objetivo instruir al lector en el montaje y operación de un infrarrojo cercano microscopio de campo para obtener imágenes más allá del límite de difracción. El apertureless cerca de microscopio de campo es una dispersión de luz, tipo de instrumento que proporciona espectros infrarrojos a una resolución de alrededor de 20 nm. Una lista completa de componentes y un protocolo de paso a paso para su uso se proporciona. Errores comunes en el montaje y ajuste de instrumentos se discuten. Un conjunto de datos representativo que muestra la estructura secundaria de un amiloide fibrilar se presenta.

El montaje de un microscopio de campo cercano infrarrojo de agregados de proteínas de imagen se describe.

Montaje, ajuste y uso de un microscopio de campo Apertureless de Infrarrojo Cercano para la imagen de proteínas

Este artículo tiene como objetivo instruir al lector en el ensamblaje y funcionamiento de un microscopio de campo cercano infrarrojo para la obtención de imágenes más allá del límite de difracción. El ...

El montaje inicial del sistema óptico se completa configurando el microscopio óptico y el microscopio de fuerza atómica multimodal. El alineamiento del haz infrarrojo invisible se facilita alineando primero con un láser visible de helio-neón rojo. La línea continua debe superponerse al infrarrojo, representado por la línea punteada, con el objetivo de observar la luz láser impactando en el ápice de la punta del cantiléver y en el detector de infrarrojos.El alineamiento final del haz infrarrojo se realiza ajustando la posición del microscopio óptico, así como la de los espejos, para obtener una señal F única con la forma adecuada cuando se obtiene la señal de campo cercano deseada. Simultáneamente, se recopilan imágenes de topografía FM y de campo cercano utilizando el software nano scope. Hola, soy el profesor Gilbert Walker del Departamento de Química de la Universidad de Toronto.Hola, soy Melissa Paulite, también del laboratorio de Gilbert Walker. Hoy les mostraremos el procedimiento para el ensamblaje inicial y la alineación de la lista de aperturas, microscopio infrarrojo de escaneo de campo cercano. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar agregados proteicos.Así que comencemos. Antes de describir el montaje y ajuste del sistema de imagen, veamos primero una breve descripción general del sistema completo. Las partes del sistema de imagen que describiremos en este video incluyen la mesa óptica, la base del microscopio de fuerza atómica multimodal, o FM, el escáner del AFM multimodal, la plataforma óptica elevada, los espejos guía, el tubo óptico con diafragma y centro.Bloquee el cubo óptico con el reflector parcial de seleniuro de cinc, el tubo óptico utilizado para asegurar el montaje sobre la plataforma elevadora. El objetivo infrarrojo, el tubo óptico para la luz dispersada hacia atrás recogida. El cubo con un espejo paraboloide desalineado, el cubo para sostener la placa de germanio a 45 grados.El ocular del microscopio, el orificio de alfiler montado en la etapa XY, el detector infrarrojo de telururo de mercurio y cadmio o MCT. El preamplificador del detector infrarrojo, la etapa XY para mover la posición del haz, la mesa elevadora para enfocar el haz, la etapa Z para posicionar el detector infrarrojo y la etapa X para posicionar el detector infrarrojo. Para comenzar el ensamblaje del montaje óptico, utilice espejos de ajuste para colocar el haz de helio-neón paralelo a la mesa óptica.A continuación, sin divisor de haz en el cubo y con el tubo óptico alargado en el otro extremo del cubo, dirija el haz de helio-neón a través de las iris fijadas en los extremos de los tubos. Ahora retire el escáner y coloque el tubo óptico alargado en lugar del objetivo infrarrojo. Inserte el reflector parcial de seleniuro de cinc para dirigir el haz hacia la muestra.Debe montarse de forma que el haz de helio-neón incida sobre la superficie frontal del reflector en el centro geométrico del cubo óptico. Al girar el reflector parcial, dirija el haz a través de la salida cerrada. Iris, dado que el soporte del reflector parcial no lo mantiene exactamente perpendicular, utilizamos dos tornillos de ajuste instalados en casa para permitir el movimiento vertical del haz.A continuación, utilice arandelas de goma en forma de O para montar el espejo de paraloide apretando los tornillos. Las arandelas se comprimen, lo que permite el ajuste del espejo. Utilice espejos adicionales para dirigir el haz de helio-neón en la dirección opuesta, ajustándolo para que pase a través de las iris utilizadas previamente.Este haz se utilizará para ajustar el espejo paraboloide. El espejo paraboloide colocado en el cubo óptico refleja la luz hacia el detector, que se colocará después del orificio de alfiler. Los tornillos de ajuste permiten dirigir el haz a través del orificio de alfiler colocado en la salida del cubo.Después de ajustar el haz mediante el orificio, coloque el detector MCT cerca del orificio. Ajuste la posición del detector de infrarrojos de manera que el haz de helio-neón incida sobre el elemento sensor del detector. Desplace el detector hacia abajo aproximadamente dos milímetros.Ahora inserte el soporte con la ventana de germanio en el cubo óptico situado antes del diafragma. La ventana de germanio con recubrimiento reflectante sirve como filtro de infrarrojos y permite observaciones visuales del cantiléver y la muestra. A continuación, coloque el ocular.Girar el ángulo del cubo permite orientar el ocular en la dirección deseada mediante la rotación del soporte de la ventana de germanio. Dirija el haz de helio-neón a través del centro del ocular. Conecte el objetivo infrarrojo y un escáner FM, y coloque el obturador del haz.Coloque una muestra en el escáner y dirija el haz de helio-neón a través del tubo óptico de entrada. Asegúrese de que el haz sea lo suficientemente ancho como para desbordarse sobre el haz. Deténgase ajustando el tornillo del ocular.Obtenga una imagen nítida del haz enfocado sobre la muestra. A continuación, coloque una cabeza de FM y acople la sonda a la muestra. Enfoque el haz de helio-neón sobre el extremo del cantiléver de imagen.Si lo hace, el haz se desplazará del centro del tubo óptico de entrada. Repita los pasos de ajuste hasta que el haz esté centrado. Para comenzar los ajustes finales del espejo parabólico, sustituya el orificio de salida por el diafragma en la posición focal del espejo paraboloide y retire la ventana de germanio y el detector de infrarrojos.Recuerde marcar la posición del detector de infrarrojos. Coloque una lente adicional después del diafragma a la distancia focal aproximada de la lente. Ahora debería ser visible la ménsula acoplada a través de la lente.Ajuste la posición del espejo paraboloide para centrarlo en el extremo de la punta a través del iris cerrado. Tenga en cuenta que cuando el haz de helio-neón está correctamente enfocado sobre la punta, aparece un destello brillante entre la punta y su reflejo en la superficie de la muestra. Vuelva a colocar la ventana de germanio y ajústela para facilitar la observación visual del cantiléver.Sustituya el iris por el orificio de alfiler. Recuerde que el orificio de alfiler utilizado para la detección infrarroja debe desplazarse fuera del centro debido al desplazamiento del haz infrarrojo provocado por la ventana de germanio. Coloque el detector infrarrojo en la posición previamente marcada y dirija el haz infrarrojo para que viaje junto con el haz visible utilizado para el ajuste.Ahora estamos listos para observar el procedimiento de ajuste rutinario. La configuración es más fácil de alinear con el haz visible del helio-neón que con el haz infrarrojo invisible. La trayectoria del haz de helio-neón y la del haz infrarrojo se unen en el espejo orientable.Si este espejo se inclina hacia abajo, puede pasar el helio-neón. Si el espejo está en posición, el infrarrojo va al campo cercano. Configuración para la alineación de uno de los haces.Utilice dos espejos que no sean comunes con la otra trayectoria. Si observa el haz en el brazo homo-dino, debería ver un perfil de haz similar a una corona. Ahora, el a FM está acoplado con retroalimentación de fuerza para un alineado fino con la etapa de campo cercano.Mueva el objetivo del microscopio reflectante para enfocar la luz en la punta donde se dispersa. Coloque la ventana de germanio en el cubo óptico. Después del espejo paraloide, el haz se enfoca en este punto mediante un espejo paraloide.Mueva la platina hacia atrás o hacia adelante hasta que pueda ver una imagen nítida de la punta y su reflejo sobre la superficie de la muestra utilizando la ventana de germanio. Ahora mire a través del telescopio, donde puede ver el cantiléver y la punta sin el haz de helio-neón. Aún puede ver algo de luz roja, pero esta es luz interna del control de distancia del microscopio de fuerza atómica.Mueva la platina hacia la derecha, la izquierda y en direcciones arriba y abajo hasta obtener un destello rojo brillante en la punta. Para superponer el campo de homodina con la luz dispersa, primero abra el brazo de homodina. Luego, mire a través del ocular.Verá tres o más puntos en una línea con intensidad decreciente. Mueva el espejo en el brazo homo-dino de modo que el segundo punto se superponga con la imagen de la punta donde la punta y su reflejo se unen. Para colocar el detector, retire el espejo adicional.El haz de helio-neón ahora irá en dirección al detector detrás del tubo. Puede observar al menos dos manchas con forma de anillo. La segunda mancha desde la derecha debe pasar a través del orificio en la lámina de protección térmica frente al detector y debe impactar en el elemento sensor.El punto con la mayor intensidad debe observarse en el centro del orificio una vez completado el ajuste rutinario. Examinemos la alineación del haz infrarrojo. Para alinear el haz infrarrojo, utilice una línea láser de monóxido de carbono con una intensidad de al menos 100 milivatios.Esto facilitará el alineado. Para comenzar, llene el detector con nitrógeno líquido. Gire el espejo montado en un soporte cinemático abatible para que el haz infrarrojo se dirija hacia el microscopio.Coloque un medidor de potencia detrás del primer iris y ajuste el espejo ubicado antes del espejo montado en una montura cinemática giratoria. Para obtener la máxima potencia, sostenga el medidor de potencia detrás del iris más cercano al plano cercano y mueva el espejo inclinable hasta alcanzar la potencia máxima. Durante el proceso de alineación, repita estos pasos varias veces mientras observa la señal F1.Para verificar la señal de un F, cambie la referencia del bloqueo en el amplificador a un f igual a la frecuencia de oscilación FM y vaya a un tamaño de escaneo Zs de tres metros en el modo de gráfico de fuerza. Si tiene una mala alineación, verá un pico ancho en la escala de tres metros. Para corregir esto, deberá repetir continuamente los pasos anteriores hasta que mejore la alineación.Si tiene un alineamiento medio, la curvatura del primer pico parecerá ligeramente cóncava, aunque el segundo pico será más grande que el primero. Aquí puede intentar corregir el alineamiento ajustando uno o ambos espejos de alineación. Si su alineamiento es bueno, verá únicamente dos picos y el primero será más alto que el segundo.La curvatura en el lado derecho del primer pico será negativa. Una vez que tenga una buena alineación, puede mover los espejos para aumentar el máximo del primer pico. La señal F debe estar en algún lugar entre cinco y doce voltios, aunque la forma del primer pico es más crítica.Finalmente, cambie a dos F e intente mejorar un poco más la señal. Al girar ligeramente los espejos y cambiar así la fase, la señal de dos F debería situarse entre 0,6 y dos voltios. Topografía experimental y campo cercano.Se muestran imágenes de 21 a 31 fibrillas de péptidos. La escala superior muestra la altura en nanómetros y la escala inferior muestra el contraste de campo cercano en voltaje de bloqueo; aquí se presenta una imagen de topografía recopilada simultáneamente con la imagen de campo cercano obtenida usando 1.631 centímetros inversos de radiación. Una imagen de topografía recopilada simultáneamente con la imagen de campo cercano obtenida usando 1.691 centímetros inversos.Se muestra la radiación. Las etiquetas representan FIs particulares y se utilizan para resaltar el tipo de confirmación secundaria que tiene cada FI. Acabamos de mostrarle cómo armar una línea y utilizar una lista de aberturas en un microscopio infrarrojo de exploración de campo cercano.Recuerde los pasos realizados durante el alineamiento para poder volver sobre ellos si su alineamiento es incorrecto, y sobre todo, sea paciente. Eso es todo. Gracias por vernos.Buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

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