Electrospinning andamios fibroso polímero para ingeniería de tejidos y cultivos celulares

Este vídeo muestra la electrospunificación de polímeros, una técnica popular en ingeniería de tejidos y cultivo celular para crear andamios de fibras que imitan la arquitectura y la escala de tamaño de la matriz extracelular nativa. Aquí realizamos la electrospunificación de un ácido hialurónico fotoreactivo capaz de reticularse mediante exposición a la luz e introducimos aplicaciones adicionales de procesamiento, como el fotopatroneado, un proceso que crea canales y andamios con porosidad a múltiples escalas para aumentar la infiltración celular y la distribución del tejido. Además, utilizamos la formación de andamios de múltiples polímeros, lo que permite la electrospunificación de dos polímeros diferentes en una misma malla, permitiendo ajustar las propiedades mecánicas y la degradación del andamio, así como personalizar la porosidad para facilitar la infiltración celular.

Hola, soy Jamie Kovi del laboratorio de Jason Burdick en el Departamento de Bioingeniería de la Universidad de Pensilvania. Hola, soy Harini Swin, también del Laboratorio Burdick. Hoy les mostraremos un procedimiento para la electrospinning de andamios de fibras para ingeniería de tejidos.

También presentaremos las capacidades adicionales de procesamiento mediante el estampado fotográfico y la formación de andamios de múltiples polímeros. Utilizamos estos procedimientos en nuestro laboratorio para estudiar las interacciones y las infiltraciones de células HMSE en andamios de ácido hialurónico. Asimismo, empleamos estas técnicas con varios polímeros distintos para estudiar tejidos reforzados con fibras, como el menisco y el miocardio.

Así que comencemos. Prepare una solución al 0,5 % en peso del iniciador fotográfico I 2 9 5 9 o I 2 9 5 9 en agua desionizada disolviéndolo a 37 grados Celsius durante varios días.

Se utiliza I cure si se necesita un polímero fotoreactivo para la electrohilado. Para preparar la solución de electrohilado combinada a concentraciones finales en agua desionizada, 2 % en peso de ácido hialurónico metilado o MEHA, 3 % en peso de poli(óxido de etileno) o PEO y 0,05 % en peso de solución de I 2 9 5 9, se agita en vórtex durante cinco minutos e incuba a 37 grados Celsius durante la noche. Para disolver la solución, transfiérase la solución a una jeringa y colóquese una aguja de calibre 18, de seis pulgadas de largo y extremo romo en el extremo.

A continuación, utilice una bomba de jeringa y ajústela para expulsar a una velocidad de 1,2 mililitros por hora. Inserte la aguja del motor de la jeringa en la bomba de jeringa. Conecte el cable conectado a tierra de una fuente de alto voltaje al aparato de recolección.

En este procedimiento, utilizaremos un mandril que gira a aproximadamente 10 metros por segundo. Para recolectar fibras alineadas, conecte el cable cargado positivamente a la aguja y ajuste la aguja o el dispositivo de recolección de modo que haya una distancia de 15 centímetros entre ambos. Inicie el flujo de la bomba de jeringa y, cuando se visualice el líquido en la punta de la aguja, encienda la fuente de alimentación y ajuste el voltaje a 22 kilovoltios.

Recopile las fibras sobre el andamio hasta alcanzar el grosor deseado. El tiempo de recopilación depende del grosor deseado y del volumen de la solución de electrohilado utilizada. Para el grabado fotográfico, utilizamos membranas de electrohilado hiladas durante 16 horas.

Retire el andamio del aparato de recolección una vez finalizada la recolección y guárdelo bajo vacío durante toda la noche para eliminar completamente el disolvente. Corte muestras de cinco milímetros por cinco milímetros del tapete de andamio con tijeras. Coloque cada andamio sobre un portaobjetos de vidrio cubierto con papel de aluminio para prepararlo para el entrecruzamiento, coloque directamente la máscara fotográfica sobre el andamio, cúbralo con un portaobjetos de vidrio limpio y sujete ambos extremos del portaobjetos con clips sujetapapeles.

Utilizando una cámara de nitrógeno, purgue el andamio para inhibir la reducción del entrecruzamiento debido a la exposición al oxígeno. Coloque el montaje del andamio en la cámara de nitrógeno bajo una luz de 365 nanómetros a aproximadamente 10 milivatios por centímetro cuadrado con un adaptador de colimación durante cinco minutos. Retire cada andamio y colóquelo en una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos.

Agregue dos mililitros de agua desionizada en cada uno. Perfile bien la placa para evitar la aberración de EVA del agua y colóquela a 37 grados Celsius durante 24 horas. Cambie el agua cada ocho horas utilizando una pipeta al vacío para aspirar el agua desionizada del pocillo entre los lavados.

Prepare una solución al 5% en peso de PEO en etanol al 90% sobre una placa calefactora. Agite a 700 RPM a 50 grados Celsius durante al menos dos horas antes del procedimiento. Después de agitar, añada DPI para obtener una concentración final de 10 microgramos por mililitro.

Transfiera la solución de PEO y DPI a una jeringa de tres mililitros y envuélvala con papel de aluminio para protegerla de la luz. A continuación, prepare la solución de electrohilado descrita en la segunda sección y añada metoxietil biocarbono molécula varilla dominio B para obtener una concentración final de 25 micromolar. Pase la solución a una jeringa de tres mililitros y envuélvala con papel de aluminio para protegerla de la luz.

Utilice con cuidado cinta adhesiva para fijar los bordes de cubreobjetos de vidrio metilado de 22 milímetros por 22 milímetros sobre la superficie del mandril, de manera que los cubreobjetos se ajusten alrededor de la circunferencia del mandril. Utilizando un trozo de tubo de silicona de cinco milímetros de longitud, conecte un extremo a una de las jeringas con accesorios de bloqueo tipo aguja. Conecte el otro extremo a una aguja, inserte la jeringa en la bomba de jeringa y pase la aguja a través del orificio en el ventilador.

Los abanicos traducen la longitud del mandril y se utilizan para garantizar una distribución uniforme de ambos polímeros en el andamio resultante. Asegúrese de que las puntas de las agujas estén centradas en el mandril para la jeringa que contiene MEHA. Coloque la punta de la aguja a 15 centímetros del mandril y ajuste el abanico a una distancia de seis centímetros de la punta de la aguja.

Programe la bomba de jeringa para que suministre 1,2 mililitros por hora y ajuste la fuente de alimentación a 22 kilovoltios. Prepare la jeringa con PEO de la misma manera exactamente, pero coloque la punta de la aguja a 10 centímetros del mandril y ajuste la fuente de alimentación a 15 kilovoltios. A continuación, apague las luces y encienda el mandril y las bombas de jeringa.

Retire el papel de aluminio de las jeringas cuando el líquido sea visible en las puntas de ambas agujas. Encienda simultáneamente las fuentes de alimentación y conecte los ventiladores cuando la recolección esté completa. Apague con cuidado las fuentes de alimentación y el mandril, y desconecte los ventiladores.

Retire los cubreobjetos y la cinta utilizando una cuchilla de afeitar. Las fibras pueden visualizarse en un microscopio fluorescente equipado con filtros para rumina y dpi. Coloque cada cubreobjeto con el polímero electroesponjoso unido en un pocillo individual de una placa de seis.

Incube los andamios en dos mililitros de PBS durante la noche para asegurar la eliminación completa del solvente y los contaminantes. Después de 24 horas, use vacío para aspirar el PBS de la placa de pocillos, coloque los andamios bajo una lámpara UV germicida en una cabina de flujo laminar durante 30 minutos. Para la esterilización, realice el cultivo celular estándar y prepare una suspensión celular concentrada a la densidad celular deseada.

Por ejemplo, utilice 100 mililitros de suspensión celular para un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros. Incube durante una hora. Añada la cantidad adecuada de medio de cultivo celular a cada uno.

Coloque nuevamente los andamios en el incubador. Tiña las células utilizando un kit comercial de viables y muertas de Invitrogen para visualizar las células y las fibras mediante un microscopio fluorescente equipado con filtros para trissy y fitzy, tal como se esperaba en los andamios recolectados sobre una placa plana conectada a tierra. Produzca fibras distribuidas aleatoriamente mientras que los andamios se recolectan sobre un mandril giratorio.

Produce fibras alineadas cuando se observan mediante microscopía electrónica de barrido durante la reticulación fotoiniciada del andamiaje; colocamos una máscara fotográfica entre el andamiaje y la fuente de luz después de sumergir el andamiaje en agua desionizada y ha no reactiva. Las áreas bloqueadas de la luz y el PEO se eliminan, y observamos la formación de macroporos, evidente mediante el colorante fluorescente. La electrospun simultánea de los chorros de MEHA y PEO da como resultado un andamiaje compuesto que contiene poblaciones distintas de fibras compuestas por los polímeros individuales.

Los HMC parecen interactuar positivamente con las fibras. No solo permanecen viables, como lo demuestra la tinción verde, sino que también parecen orientarse de manera que se alinean a lo largo de las fibras rojas. Acabamos de mostrarle cómo electrohilasar andamios de fibras para ingeniería de tejidos.

También hemos introducido capacidades adicionales, como el moldeado fotográfico y el electrohilado de múltiples polímeros. Al realizar este procedimiento, es importante recordar optimizar los parámetros de electrohilado de cada polímero para formar fibras uniformes antes de intentar cualquier otro experimento. Eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.