Name: Aislamiento y purificación de Drosophila Clasificación de las neuronas periféricas por bolas magnéticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Aprende a aislar y purificar neuronas periféricas de Drosophila mediante clasificación con bolas magnéticas. Este método permite obtener poblaciones de neuronas de alta pureza para análisis genéticos y moleculares posteriores.

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Agradecemos a los Dres. Yuh-Nung Jan y Grueber Wes para proporcionar poblaciones de moscas utilizadas en este estudio. Los autores agradecen la F. Thomas y Kate Miller Jeffress Memorial Trust para el apoyo de esta investigación (DNC) y la Oficina de la Universidad George Mason Provost (EPRI).

Comentarios generales sobre clasificación magnética de bolas de Drosophila neuronas periféricas (El tiempo total para la conclusión del Protocolo: 2.5-3 horas) Procedimientos estándar de laboratorio para el mantenimiento de un medio ambiente limpio, libre de ARNasa deben ser observadas en todo momento para evitar la degradación del ARN. Cuando la cutícula larval de Drosophila se diseca y se coloca en el buffer de disociación celular, las neuronas periféricas son una de las celdas última a desprenderse de la cutícula. Hemos explotado esta propiedad y diseñado este protocolo para eliminar la mayoría de las células no específicas de la cutícula, como el músculo y la grasa antes de aislar las neuronas da. Con la práctica, todo el protocolo puede ser completado con éxito dentro de aproximadamente 2,5 horas. La preparación de cuentas recubiertas de anticuerpos debe ser completado antes de que el experimento comienza. 1. La preparación de partículas magnéticas de las células Encuadernación: Este paso debe ser completado antes del inicio del experimento. Las cuentas preparadas pueden ser preparadas y almacenadas a 4 º C hasta que se necesite. <ol><li> Lavado de 100 l de Dynabeads M-280 bolas recubiertas de estreptavidina tres veces en PBS por resuspensión en 500 l de PBS y granulación en un campo magnético fuerte cada vez. </li><li> Finalmente volver a suspender las cuentas directamente en 100 l de puro rata con biotina de anticuerpos anti-ratón-CD8a (concentración de anticuerpos es de 100 ug / ml). </li><li> Incubar la mezcla durante 1 hora en hielo con agitación ocasional leve para evitar la sedimentación. [1 l de Dynabeads M-280 se puede obligar a 0,05-0,10 mg de anticuerpos con biotina]. </li><li> Lave la mezcla de grano de anticuerpos tres veces como se describe en el paso 1.1 para eliminar el exceso de anticuerpos. Las bolas magnéticas están recubiertas con anticuerpos y listo para ser utilizado. Guarde la mezcla de bolas de anticuerpos en 100 l de PBS 1X a 4 º C hasta su uso. </li></ol> 2. Selección y lavado de larvas: (10-15 minutos) <ol><li> Elige misma edad 30-50 larvas de tercer estadio y colocarlos en un tubo de microcentrífuga con 1,6 ml de fosfato de 1 a 1,2 ml 1X solución salina (PBS). (3-5 minutos) </li><li> Cerrar el tubo y agitar en el que el valor máximo tres veces durante 1 segundo cada uno. </li><li> El uso de un pulido al fuego pipeta Pasteur de descartar el sobrenadante por completo. Repita el lavado (2.1) y agitar (2,2) los pasos 3-4 veces hasta que el sobrenadante es visiblemente libres de cualquier partícula de alimentos y residuos. </li><li> Brevemente repetir el lavado con 1 ml de etanol al 70% y descartar el sobrenadante. </li><li> Lave las larvas dos veces con 1 ml de H 2 Odd y descartar el sobrenadante. </li><li> Brevemente repetir el lavado de nuevo con 1 ml de RNasa-AWAY y descartar el sobrenadante. </li><li> Lavado de las larvas de tres veces en 1 ml de ddH2O para asegurar la eliminación completa de la RNasa-AWAY. </li></ol> 3. Disección: (10-12 minutos) <ol><li> Coloque 10-12 larvas en el centro de una placa de 35 mm recubierto Sylgard Petri. Posición a un poco de distancia el uno del otro. [Paso Crítico: Desechar cualquier larva que no parecen estar en la etapa de desarrollo apropiada] </li><li> Corte el extremo anterior de las larvas con un par de tijeras de disección fina de todas las larvas. </li><li> Con un par de aburridos Dumont N º 5 pinzas de invertir las larvas de dentro a fuera. Insertar una pinza en el interior de la cutícula larval todo el camino hasta el extremo posterior. Apriete la punta de la pinza en conjunto para agarrar el extremo posterior de la cutícula (Figura 1a) (prueba a pulsar la cutícula hacia abajo en la superficie Sylgard para hacer más fácil). Usando el segundo par de pinzas, empuje la cutícula larval de adentro hacia afuera. [Paso Crítico: Trate de practicar este método un par de veces antes de intentar el experimento de aislamiento de células. Trate de obtener las larvas completamente invertido, para asegurarse de que todos los tejidos blandos están expuestos a la solución para facilitar la disociación.] </li><li> Después de la disección de las larvas de 3-4, trasladarlos de inmediato a frescas, helado de PBS (se coloca el tubo en hielo) en un tubo de microcentrífuga de 1,6 ml. </li><li> Repita los pasos 3,1 a 3,4 hasta que todas las larvas requieren son recogidos (larvas de 30-40 en este protocolo). [Paso Crítico:. Anticipar 10-20% de pérdida durante la disección y la disociación, y planificar en consecuencia] </li></ol> 4. La eliminación de baja adherencia no específica las células: (2-3 minutos) [Este paso ayuda a la limpieza de baja adherencia no tejidos específicos, tales como cuerpos grasos y el SNC.] <ol><li> Tome el tubo de 1,6 ml de microcentrífuga que contiene la cutícula larval invertida y sustituir el sobrenadante con aproximadamente 700 a 800 l de agua dulce helado de PBS. </li><li> Pulse-vórtice del tubo de microcentrífuga 5 veces (3 segundos por pulso) a toda velocidad. </li><li> Descartar el sobrenadante y reemplazarlo con aproximadamente 700-800 l fresco, helado de PBS. </li><li> Repita los pasos 4,2 y 4,3 veces tres. </li><li> Resuspend la cutícula larval en 400 l de agua dulce, helado de PBS </li></ol> 5. Disociar el tejido en una suspensión de células individuales: (18-20 minutos) [Paso Crítico: Más de disociación puede causar la pérdida del marcador de superficie celular que conduce a producir células pobres y la viabilidad celular baja. El tejido de las larvas se pueden disociar, ya sea mecánica disociación (ultrasonidos, douncing), la disociación enzimática (tripsina, colagenasa, etc) o una combinación de ambos. A medida que estos tejidos larvarios son difíciles de disociar, se encontró que una combinación de mecánica y enzimática disociación dado los mejores resultados.] <ol><li> Añadir 1,5 l de Liberase 1X Blendzyme 3 (28 W nsch unidades / vial) a la cutícula larval suspendieron en 400 l de PBS. </li><li> Vortex la solución 2-3 veces durante 1 segundo cada uno en posición máxima (Esto debería eliminar las células de baja adherencia de la cutícula en la solución). </li><li> Incubar la solución a temperatura ambiente (22-25 ° C) durante 5 minutos. [Paso crítico: el tiempo de incubación afecta en gran medida la eficiencia de las células de clasificación final. El tiempo de incubación recomendado debería ser suficiente para aflojar el tejido. No exceda de 15 minutos.] </li><li> Pulse-vórtice del tubo de 20-30 veces en la configuración máxima de 2 segundos por pulso a toda velocidad. Esto debería libera el tejido muscular y otros en la solución. Inspeccionar una pequeña muestra de la solución bajo un microscopio de fluorescencia estéreo en cada paso. (Con la experiencia de uno debe ser capaz de determinar el grado de disociación al observar el tubo de microcentrífuga directamente bajo una fluorescencia permitió estéreo-microscopio) </li><li> Lave la cutícula larval 2-3 veces con agua dulce, helado de PBS y finalmente se resuspenden en 500 l de BSA frescas, helado de PBS con 1%. </li><li> Para evitar la cutícula larval se pegue a la superficie de cristal del triturador de tejidos 2 ml Kontes y mano gran distancia, antes de cubrir el triturador de tejidos y mortero con una BSA al 1% en solución de PBS y después de un breve enjuague descartar la solución de BSA. Posteriormente, utilizando una pipeta Pasteur pulida al fuego, la transferencia de las cutículas del paso 5.5 al triturador de tejidos recubiertos con BSA. [Paso Crítico: Pre-enfriar el triturador de tejidos / mortero, colocándolo en hielo durante unos minutos para prevenir el daño celular / lisis]. </li><li> Dounce el tejido con movimientos lentos y firmes, para evitar formación de espuma (aproximadamente 20 a 30 golpes). [Paso Crítico:. Dounce lenta y constante, de lo contrario, las células pueden lisar] </li><li> Para evaluar los niveles de células disociación, limpie la pared exterior del triturador de tejidos con un pañuelo limpio Kimwipe, e inspeccionar debajo de un fluorescente estereomicroscopio. Las neuronas que se han desprendido de la cutícula, y se puede ver en la solución. Si esto resulta ser difícil, en su defecto pipeta una pequeña muestra de la solución, y observarlo bajo un microscopio estereoscópico fluorescente. Un buen indicador de disociación celular es la ausencia de las neuronas de la cutícula larval. Sin embargo, si uno sigue observando las neuronas unido a la cutícula, u observa las células incompletamente disociado, Dounce más hasta que las células lograr una suspensión de células individuales. </li><li> Triturar la solución 5 veces con una pipeta Pasteur pulida al fuego redujo a aproximadamente el 50% del diámetro de la punta estándar, seguido de 10 veces con una pipeta Pasteur pulida al fuego redujo a aproximadamente el 25% del diámetro de la punta estándar. [Paso Crítico: trituración enérgica puede dañar las células. Monitor de las células entre los pasos, y ajustar el procedimiento de acuerdo]. </li><li> Filtrar la solución a través de un filtro de 30 micras de células y recoger el celular filtrado en un tubo de microcentrífuga de 1,6 ml. La solución resultante debe consistir en una suspensión de células individuales y ya está listo para la clasificación de células magnéticas. </li></ol> 6. Clasificación magnética celular bolas: (45 - 75 minutos, depende del tiempo de incubación de anticuerpos) <ol><li> Añadir 15 l de anticuerpos magnéticas recubiertas con 500 l de suspensión celular (paso 5,10). El resto de anticuerpos magnética cuentas conjugado puede ser almacenado hasta que sea necesario para aislamientos celulares siguientes. </li><li> Se incuban las células con anticuerpos magnéticas recubiertas por 30-60 minutos en hielo con ocasionales mezcla manual. [Paso Crítico: La incubación a una temperatura más alta o más tiempo puede dar lugar a la unión de anticuerpos no específicos.] </li><li> Coloque el tubo de microcentrífuga en un fuerte campo magnético durante 2 minutos. Todas las células seleccionadas positivamente con cuentas no consolidadas se separará a un lado del tubo. </li><li> Poco a poco pipeta el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular. </li><li> Lavar las células 3-4 veces en agua dulce, helado de PBS para eliminar cualquier resto de células no específicas. </li><li> Resuspender las células en 30 l de agua dulce, helado de PBS. </li><li> Para aproximar la pureza y el rendimiento de las células, pipeta de 5 l de la susp celularension sobre la superficie pulida de un hemocitómetro y contar todas las células fluorescentes visibles bajo el microscopio estereoscópico fluorescente. También puedes ver la cantidad de células no fluorescentes y cualquier signo de impurezas. Normalmente, la muestra será altamente enriquecido para fabricar células fluorescentes. </li></ol> 7. Aislamiento del ARN de las células de bolas magnéticas Ordenado: (60 - 75 minutos) <ol><li> Después de contar, que sedimenten las células en un campo magnético, descartar el sobrenadante y añadir 20 l de tampón de extracción de la PicoPure ™ de aislamiento de ARN Kit (Molecular Devices). Dependiendo del número de células que se pueden necesitar para añadir un mayor volumen de tampón de extracción. </li><li> Vórtice del tubo a la máxima velocidad para permitir la mezcla de pellet de células con tampón de extracción. </li><li> Incubar el tubo a 42 ° C durante 30 minutos. </li><li> Para asegurar la eliminación de las partículas magnéticas antes de la purificación de columna de la ARN (véase el paso 7.5), el tubo se centrifuga brevemente a 2.000 (x) g durante 2 minutos para que sedimenten las partículas magnéticas. El tubo se coloca en un campo magnético fuerte para retener el sedimento y el sobrenadante se transfiere a un tubo de microcentrífuga nuevo. </li><li> Extraer y purificar la columna ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante PicoPure extracción de RNA kit. DNasa tratamiento es opcional, y se puede realizar en la columna durante la purificación de ARN de acuerdo con el requisito de análisis. Por último, eluir el ARN unido total en un volumen pequeño (11-30 l) de tampón de elución y almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para su uso. Si se desea una alícuota de 1 l se puede utilizar para evaluar la calidad total de ARN en un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.). </li></ol> Los resultados representativos: Clasificación de esferas magnéticas se utilizó para aislar las neuronas da Drosophila (Figura 1). El ARN purificado a partir de estas neuronas aisladas da (Figura 2a) se encontró que era de excelente calidad, como se indica por la presencia de fuerte 5.8S, 18S y 28S del RNA ribosomal picos cuando se analiza en un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) ( Figura 2b). A partir de las larvas de tercer estadio 30-40 que éramos capaces de aislar a un promedio de 300-500 IV clase neuronas da con el controlador de PPK-GAL4 y 1500-2000 neuronas da (Clase I, II, III y IV) con la pan- da específica de neuronas GAL4 21-7 conductor. Para evaluar el enriquecimiento neuronal específica de las células aisladas se realizó cuantitativos transcripción reversa PCR (QRT-PCR) utilizando dos genes específicos de marcadores neuronales (elav y futsch). Estos análisis revelaron un importante enriquecimiento veces de genes marcadores que indican tanto un enriquecimiento muy específico para las neuronas da en comparación con el flujo mediante el uso de nuestro protocolo (Figura 3). Finalmente, el ARN aislado de los pan-da neuronas y de clase IV neuronas da se utilizó para realizar perfiles de expresión transcripcional de Agilent Drosophila melanogaster todo el genoma de microarrays oligo (4 x 44K) (Figura 4). Estos análisis identificó numerosos reguladores anteriormente implicados de la morfogénesis da neurona dendrita, además de un amplio espectro de moléculas previamente caracterizados y de supuestas vías de transducción de señal que potencialmente desempeñan importantes funciones en el desarrollo da la neurona. Estudios diseñados para evaluar el papel potencial (s) de estas moléculas no caracterizado previamente en la mediación da el desarrollo de las neuronas, las dendritas y morfogénesis en concreto, están actualmente en curso. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> Figura 1:. Esquema de clasificación de bolas magnéticas de Drosophila neuronas da (a) emparejados por edad larvas de tercer estadio que lleva el da neuronal específica GAL4, UAS-mCD8-GFP reportero transgén son disecados mediante la inversión de la cutícula larval de adentro hacia fuera, para exponer la PNS a la disociación de amortiguación y almacenarse en helado de PBS. (b) la disociación enzimática se lleva a cabo mediante la adición de Liberase Blendzyme 3 a la solución que contiene la cutícula larval. (c) Los tejidos de las larvas son más disociado por una combinación de agitación, trituración y douncing para eliminar de forma no específica tejidos etiquetados como grasa cuerpos, intestino y sistema nervioso central. (d, e), las células se filtra utilizando un filtro de 30 micras de células. La solución contiene una única suspensión de células de diferentes tipos de células incluyendo epitelio, músculo y las neuronas. (F) Anti-ratón-CD8a recubiertas de anticuerpos Dynabeads M-280 se añaden a la suspensión celular, y se incubaron en hielo durante 30-60 minutos. ( g) Las partículas magnéticas se une a las neuronas que se da a un ratón que expresan CD8 etiquetado proteína GFP de fusión. (h, i) La bola recubierta de células magnético se separan mediante la colocación de la solución en un fuerte campo magnético. Se desecha el sobrenadante y las células se lavan tres veces para eliminar cualquier residuo no específicos de las células, dando lugar a (j) highly poblaciones purificadas de neuronas DA. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> Figura 2: (a) representante de la imagen positiva seleccionados, GFP fluorescentes de clase IV neuronas da aisladas por disociación celular y la clasificación de cuentas magnéticas. La población resultante de las neuronas se determinó que era altamente enriquecido para la clase IV neuronas da con poca o ninguna célula impurezas contaminantes. (B) Un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) electroferograma de ARN total aislado de perlas magnéticas ordenados neuronas DA , mostrando una excelente calidad de ARN total como se indica por la presencia de 5.8S, 18S, 28S y ARNr. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> Figura 3: QRT-PCR análisis de la expresión del gen marcador neuronal en neuronas aisladas da (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) y el flujo a través de la fracción se realizó por triplicado. Los niveles de expresión de los dos genes marcadores neuronales específicos (elav y futsch) fueron evaluados por QRT-PCR. Los valores obtenidos de estos análisis se normalizaron con el control endógeno (rp49), y los niveles relativos a los observados en el flujo a través de la fracción se calcula utilizando el método ΔΔCτ 6. Ambos elav y futsch se enriquecieron de manera significativa en la aislada población de neuronas da en comparación con el flujo a través de la fracción. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> Figura 4: Representante de la Clase IV-da neuronal específica Cy3 etiquetado de archivos de imagen de microarrays. Aquí se muestra un Agilent Drosophila melanogaster todo el genoma-oligo microarrays (4 x 44K) hibridado con Cy3-labeld ARN total aislado de la clase IV neuronas da purificado por la clasificación de cuentas magnéticas. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 4.

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

El protocolo que aquí se presenta ha sido optimizado para el aislamiento y purificación de las neuronas periféricas, que se adhieren firmemente a la superficie interna de la Drosophila cutícula tercer estadio larval con un cordón magnético de la estrategia de clasificación de células. A pesar de que han utilizado este protocolo para aislar específicamente Drosophila neuronas da, la aplicación de este protocolo para el aislamiento de otros tipos de células que se adhieren a la cutícula de las larvas o pupas de las etapas...

Equipo <ul><li> (10) imanes de neodimio de bloque (K &amp; J Magnetics, Inc., cat. # B444B), en su defecto dynamag ™ 2 (Invitrogen, cat. # 123-21D) puede ser utilizado. </li><li> Glass Kontes tejido Grinder, 2 ml de capacidad de trabajo, con su correspondiente mano gran distancia (Cat. # 885300-0.002) </li><li> Filtros de la célula, por ejemplo, MACS Pre-filtro de separación (Miltenyi Biotec, cat. # 130-041-407) </li><li> 35 mm placas petri cubiertas con Sylgard (Dow Corning Corporation, cat. # 3097358 a 1.004) </li><li> Herramientas de disección: dos pares de pinzas Dumont N º 5 (Herramientas Artes Ciencia, Cat # 11251-20). </li><li> Vannas primavera microdisección tijeras (Herramientas Artes Ciencia, cat. # 15000 a 08) </li><li> Pipetas (P-1000, P-100, P-10) con puntas desechables </li><li> Hemocitómetro estándar para contar las células y la pureza de estimación </li><li> Pipetas Pasteur con puntas pulidas al fuego de diámetro estándar, se redujo a aproximadamente el 50% del diámetro normal y reducido a ~ 25% del diámetro estándar para la trituración </li><li> Para la mesa de microcentrífuga (1-16,000 (x) g) </li><li> Vórtice </li><li> Fluorescentes estereomicroscopio (a MZ16FA Leica fue utilizada en este protocolo) </li></ul>

aislamiento y purificación de drosophila clasificación de las neuronas periféricas por bolas magnéticas

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

La<em&gt; Drosophila</em&gt; Del sistema nervioso periférico (SNP) es un poderoso modelo para la investigación de los complejos procesos de desarrollo neuronal y la morfogénesis de las dendritas a nivel funcional y molecular. Para ayudar en estos análisis, hemos desarrollado una estrategia para el aislamiento de una subclase de las neuronas PNS llamada arborización dendrítica (da), las neuronas que han sido ampliamente utilizados para el estudio de la morfogénesis dendrita<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Estas neuronas son muy difíciles de aislar en una población pura, debido en parte a su ocurrencia muy baja y su-difícil de alcanzar ubicación por debajo de la cutícula larval dura de quitina. Nuestro nuevo método supera estos desafíos, y se basa en una celda de enriquecimiento rápido y específico mediante anticuerpos recubiertos con partículas magnéticas. Para nuestros estudios magnéticos clasificación de cuentas, hemos utilizado la misma edad larvas de tercer estadio que expresa una proteína del ratón CD8 etiquetado de fusión GFP (<em&gt; UAS-GFP-mCD8</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Bajo el control de cualquiera de la arborización dendrítica de clase IV (da) neuronal específica<em&gt; Carterista (PPK)-GAL4</em&gt; Conductor<sup&gt; 4</sup&gt; O el control de la pan-da neuronal específica GAL4<sup&gt; 21-7</sup&gt; Conductor<sup&gt; 5</sup&gt;. Aunque este protocolo ha sido optimizado para aislar las células PNS que se unen a la pared interna de la cutícula de las larvas, mediante la variación de algunos parámetros, el mismo protocolo que podría ser utilizado para aislar diferentes tipos de células adjunta a la cutícula en las etapas de larva o pupa desarrollo (por ejemplo, epitelios, muscular, etc oenocytes), u otros tipos de células de los órganos de las larvas dependiendo del modelo de driver GAL4 expresión específica. El ARN aislado por este método es de alta calidad y puede ser fácilmente utilizada para posteriores análisis genómico, tales como estudios de microarrays perfiles de expresión génica. Este enfoque ofrece una nueva y poderosa herramienta para llevar a cabo estudios sobre el aislamiento<em&gt; Drosophila</em&gt; Arborización dendrítica (da), las neuronas lo que proporciona nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la morfogénesis de dendritas.

En este video-artículo se presenta un método para el aislamiento y purificación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuronas periféricas con una rápida estrategia de asistencia con bolas magnéticas clasificación de células. ARN obtenido a partir de las células aisladas pueden ser fácilmente utilizada para aplicaciones posteriores incluyendo el análisis de microarrays.

Aislamiento y purificación de Drosophila Clasificación de las neuronas periféricas por bolas magnéticas

El sistema nervioso periférico (SNP) de Drosophila es un modelo potente para investigar los procesos complejos del desarrollo neuronal y de las dendritas...

Se utilizan larvas de Drosophila que portan un transgén reportero de fusión GFP específico de neuronas CD8 para aislar neuronas DA. Las larvas se disecan invirtiendo su cutícula al revés, lo que expone el sistema nervioso periférico. Las larvas invertidas se someten a una disociación enzimática, seguida de una disociación mecánica mediante vortex, agitación y sedimentación.A continuación, las células se filtran para obtener una suspensión de células individuales que contiene principalmente epitelio, músculo y neuronas. Se añaden perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos a la suspensión celular, donde se unen a las neuronas que expresan la proteína de fusión GFP marcada con CD ocho. Finalmente, las neuronas recubiertas con perlas magnéticas se aíslan colocando la solución en un campo magnético fuerte, obteniendo poblaciones de neuronas altamente purificadas.Hola, soy Dan Cox del Departamento de Biología Molecular y Microbiología del Instituto Krasno para Estudios Avanzados en la Universidad George Mason. Hola, soy Ish AER del laboratorio del Dr. Dan Cox. Hoy les mostraremos un procedimiento para el aislamiento y purificación de neuronas periféricas DLO mediante clasificación por microperlas magnéticas.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la morfogénesis específica de clase y correcta. Comencemos. Para iniciar este procedimiento, seleccione de 30 a 50 larvas de tercer estadio con edades coincidentes y colóquelas en un tubo microcentrífugo de 1,6 mililitros que contenga de 1 a 1,2 mililitros de PBS 1X.Cierre el tubo y vortexéelo a la máxima velocidad tres veces durante un segundo cada vez. Utilizando una pipeta con la punta pulida con fuego, deseche completamente el sobrenadante. Añada un mililitro de PBS y repita los pasos de lavado y vortexeo tres veces hasta que el sobrenadante esté visiblemente libre de partículas de alimento y restos.Repita brevemente el lavado con un mililitro de etanol al 70 %. Luego, lave las larvas dos veces con un mililitro de agua doblemente destilada. Y finalmente, repita el lavado una vez más con un mililitro de RNasa Away y tres veces con un mililitro de agua doblemente destilada para la eliminación completa de la RNasa. Las larvas ya están listas para la disección.Coloque 10 a 12 larvas en el centro de una placa de Petri de 35 milímetros recubierta con guardia de ventana. Colóquelas ligeramente separadas entre sí y deseche cualquier larva que no parezca estar en la etapa de desarrollo adecuada. A continuación, use un par de tijeras de disección finas para abrir la punta anterior de las larvas utilizando un par de pinzas romas Dumont.Número cinco, pinzas. Invierta las larvas del revés. Comience insertando una pinza dentro de la cutícula larval hasta el extremo posterior.Presione las puntas de la pinza para agarrar el extremo posterior de la cutícula. Presionar la cutícula contra la superficie del protector de sílice facilita la manipulación. Con un segundo par de pinzas, empuje la cutícula larval del revés.Asegúrese de que las larvas estén completamente invertidas para que todos los tejidos blandos queden expuestos a la solución para una disociación fácil. Practique esto varias veces antes de intentar disociar las células. Después de diseccionar de tres a cuatro larvas, transfiéralas inmediatamente a PBS frío recién preparado en un tubo microcentrífugo.Repita hasta recolectar las 30 a 40 larvas necesarias antes de proceder a eliminar las células no específicas. Tenga en cuenta que se espera una pérdida del 10 al 20 % durante la disección y asociación, ahora que todas las larvas han sido disecadas. Elimine los tejidos no específicos débilmente adheridos, como los cuerpos grasos y las células del sistema nervioso central.Sustituyendo el snat del tubo que contiene las cutículas larvales invertidas con 700 a 800 microlitros de PBS frío recién preparado. Por último, pulse. Vortexe el tubo microfuga cinco veces durante tres segundos por pulso a velocidad máxima.Luego deseche el sobrenadante y reemplácelo con aproximadamente de 700 a 800 microlitros de PBS frío con hielo. Repita este paso tres veces y, finalmente, re suspenda las cutículas larvarias en 400 microlitros de PBS frío con hielo.PBS frío antes de pasar a disociar las células para aislar las neuronas larvales de arborización dendrítica o da. Utilice una combinación de disociación enzimática y mecánica. Tenga cuidado con la sobredisociación, que puede provocar la pérdida del marcador de superficie celular, lo que lleva a un bajo rendimiento celular y una viabilidad celular reducida.Inicie la disociación añadiendo 1,5 microlitros de una x liasa zima tres a 28. Una vez unidades por vial a las cutículas larvales suspendidas en 400 microlitros de PBS. Vortexee la solución de dos a tres veces durante un segundo cada vez, al máximo nivel, para separar las células débilmente adheridas de las cutículas y llevarlas a la solución.Luego, incubar la solución a temperatura ambiente durante cinco minutos. Dado que el tiempo de incubación afecta en gran medida la eficiencia final de clasificación celular. No exceder 15 minutos al final del pulso de incubación.Vortexee el tubo de 20 a 30 veces a velocidad máxima, con pulsos de dos segundos cada uno. Este procedimiento debe liberar el músculo y otros tejidos no específicos en la solución. Inspeccione la muestra periódicamente bajo un estereomicroscopio con fluorescencia activada para determinar si los neuronas periféricos aún están adheridos a la cutícula.Inspeccione una pequeña muestra de la solución observando directamente el tubo de microcentrífuga bajo un microscopio estereoscópico con capacidad de fluorescencia para determinar el grado de disociación. Continúe realizando este procedimiento en cada paso de la disociación, deteniendo el vortex cuando los neuronas periféricos comiencen a disociarse de la cutícula hacia la solución. Lave brevemente las cutículas de larva con dos o tres cambios de un mililitro cada uno de PBS frío recién preparado.Y finalmente, resuspender. Suspéndalos en 500 microlitros de PBS frío fresco que contenga 1 % BSA para continuar con la disociación mecánica de las células. Use un molinillo de tejidos de dos mililitros con pistilo de gran holgura y una solución de 1 % BSA en PBS. Después de un breve lavado, deseche la solución de BSA.Esto evitará que las cutículas larvarias se adhieran a las superficies de vidrio. Posteriormente, preciele el molinillo de tejidos y el pistilo colocándolos en hielo durante unos minutos para prevenir daños celulares o lisis. A continuación, utilice una pipeta con la punta flameada para transferir las cutículas al molinillo de tejidos.Ahora, homogenice el tejido con movimientos lentos y constantes, evitando la formación de espuma durante aproximadamente 20 a 30 movimientos. Asegúrese de hacerlo lentamente y de manera constante. De lo contrario, las células podrían romperse.Para evaluar los niveles de disociación celular, limpie la pared del molinillo de tejidos con un hisopo limpio tipo Kim y examine al microscopio estereoscópico fluorescente. Las neuronas deben haberse separado de la cutícula y pueden observarse en la solución. Un buen indicador de disociación celular es la ausencia de neuronas en la cutícula larvaria.Sin embargo, si aún se observan neuronas adheridas a la cutícula o se observan en células completamente disociadas, disocie más hasta que las células alcancen una suspensión de células individuales. Continúe la disociación mecánica utilizando una pipeta con la punta pulida al fuego. Reduzca el diámetro de la punta a aproximadamente el 50 % del diámetro estándar y pase la solución cinco veces, seguido de diez veces con una pipeta con la punta pulida al fuego.Estreche hasta aproximadamente el 25 % del diámetro estándar de la punta. Tenga en cuenta que una tracción fuerte puede dañar las células. Observe las células entre pasos y ajuste el procedimiento en consecuencia.Termine filtrando la solución a través de un filtro celular de 30 micrómetros y recoja el filtrado celular en un tubo microfuga de 1,6 mililitros. La solución resultante debe consistir en una suspensión de células individuales y ya está lista para la clasificación magnética de células. Perlas magnéticas recubiertas con un anticuerpo anti CD ocho.Se prepararon como se describe en el protocolo escrito adjunto y las neuronas DA expresan una proteína de fusión GFP CD ocho dirigida por el anticuerpo. Inicie el ordenamiento celular añadiendo 15 microlitros de perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo a 500 microlitros de suspensión celular. Incube las células con las perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo durante 30 a 60 minutos en hielo con mezclas manuales ocasionales; la incubación a una temperatura más alta o durante un tiempo más prolongado puede resultar en unión no específica del anticuerpo.A continuación, coloque el microtubo en un campo magnético fuerte durante dos minutos. Todas las células positivamente seleccionadas junto con las perlas no unidas se adherirán al costado del tubo; aspire lentamente el sobrenadante sin perturbar el botón celular y lave las células de tres a cuatro veces con PBS frío recién preparado. Este paso elimina cualquier célula restante no específica.Finalmente, resuspenda las células en 30 microlitros de PBS fresco y frío para estimar la pureza y el rendimiento celular. Pipetee cinco microlitros de la suspensión celular sobre la superficie pulida de un hemocitómetro y cuente todas las células fluorescentes visibles bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia. También verifique la cantidad de células no fluorescentes y cualquier signo de impurezas.Normalmente, la muestra estará muy enriquecida con células fluorescentes. Por último, utilice el kit de aislamiento de ARN pico puro para aislar el ARN de las células unidas a las perlas. Añada el tampón de extracción a las células ordenadas, pero retire las perlas utilizando un imán antes del paso de purificación en columna; use un microlitro del ARN extraído para evaluar la calidad total del ARN en un analizador Bioanalyzer 2100 de Agilent.El ARN purificado de las neuronas DA aisladas es de excelente calidad, como lo indica la presencia de picos nítidos de ARN ribosómico 5,8 s y 28 s al analizarse en un Agilent 2100 Bioanalyzer. A partir de larvas de tercer instar, pudimos aislar en promedio entre 300 y 500 neuronas DA de clase cuatro utilizando el conductor PPK gal4, y entre 1500 y 2000 neuronas DA de las clases 1, 2, 3 y 4. Mediante un conductor gal4 específico para neuronas PANDA, el análisis cuantitativo de RT-PCR con L11 fch, que son marcadores específicos de neuronas, reveló un enriquecimiento significativo en ambos casos, lo que indica un alto grado de especificidad en el aislamiento de neuronas DA mediante el protocolo descrito, en comparación con el flujo directo. Finalmente, el ARN aislado tanto de neuronas PANDA como de neuronas DA de clase cuatro se utilizó para realizar perfiles de expresión transcripcional en microarreglos oligonucleotídicos de genoma completo de Agilent para Drosophila melanogaster, identificándose así muchos factores implicados en la morfogénesis de las neuronas DA.Le hemos mostrado cómo aislar y purificar neuronas periféricas de Drosophila mediante clasificación magnética con microesferas a partir de la tercera etapa de larva. Al realizar este procedimiento, es importante equilibrar los pasos de disociación enzimática y mecánica. Una disociación enzimática excesiva puede provocar la degradación de los marcadores de superficie celular CD8, lo que conduce a una clasificación celular ineficaz o fallida.También es importante mantener condiciones libres de ARN durante todo el procedimiento para preservar la integridad del ARN purificado de las neuronas aisladas. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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