Name: La disección de embriones de ratón 6,5 dpc (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprende a disecar embriones de ratón de 6,5 dpc para estudiar patrones de expresión génica y decisiones de linaje celular en biología del desarrollo. Este protocolo sistemático facilita el aislamiento de embriones en etapa de raya primitiva.

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La disección de los órganos reproductores de una hembra de ratón <ol><li> Los animales en gestación son sacrificados por asfixia de CO 2 de gas comprimido. </li><li> Coloque el animal en decúbito supino almohadilla absorbente y sumergirlo en etanol al 70% para reducir el riesgo de contaminación de la disección con el pelo del ratón. </li><li> Pellizcar la piel y hacer una pequeña incisión lateral en la línea media con regulares tijeras quirúrgicas. Mantener la piel firme por encima y por debajo de la incisión de la piel y tirar hacia fuera de la cabeza y la cola para exponer el abdomen. </li><li> Sujete el peritoneo con una pinza y se corta a exponer la cavidad abdominal. </li><li> Localizar los órganos reproductivos en la región dorsal de la cavidad del cuerpo: dos cuernos uterinos, el oviducto y los ovarios. </li></ol> Raya primitiva etapa (6,5 dpc) Disección <ol><li> Quitar el cuerno uterino, tome el útero por debajo del oviducto y cortar libre a lo largo del mesometrio. Lugar útero disecados en PBS enfriado con hielo. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_7_8_2/160_figure-1.jpg" alt="Figura 1" width="263" height="132"> Figura 1 </li><li> Separe cada embrión, por el corte entre los lugares de implantación a lo largo de los cuernos uterinos. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_7_8_3/160._figure-2.jpg" alt="Figura 2" width="575" height="171"> Figura 2 </li><li> Sujete el revestimiento del útero muscular deslizando pinzas de relojero entre la capa muscular y el tejido circundante decidua envuelto. Pele la capa muscular, la exposición de la decidua. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_4/160_Figure-3.png" alt="Figura 3" width="593" height="166"> Figura 3 </li><li> Clip de una porción de la decidua expuestos en el vértice (aproximadamente 1 / 5 de los tejidos decidua), que expondrá la punta midventral o distal del embrión encerrado. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_5/160_Figure-4.png" alt="Figura 4" width="589" height="212"> Figura 4 </li><li> El embrión puede ser bombardeado a cabo utilizando las puntas de unas pinzas. Pierce la decidua con unas pinzas que rodea al embrión y pinzas abiertas al desgarro decidua aparte. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_6/160_Figure-5.png" alt="Figura 5" width="249" height="200"> Figura 5 </li><li> Una vez que se extrae de embriones, la membrana Reichart todavía puede estar unido, así como el cono ectoplacental (trofoblasto). El embrión puede ser diseccionado más de una cuidadosa disección. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_7/160_Figure-6.png" alt="Figura 6" width="356" height="222"> Figura 6 </li></ol>

<ol><li>Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).</li>
</ol>

Post-implantación en el ratón produce entre 4,5 dpc y el parto. Este método de disección puede ser aplicado, esencialmente como se describe, para aislar antes o después de los embriones en etapa de 5.5-8.5 DPC.

<table><tbody><tr><td>Pinzas microquirúrgicas dentadas, rectas</td><td>Herramienta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5130</td><td>2 pares</td></tr><tr><td>Tijeras microquirúrgicas Patrón n.º 55 INOX</td><td>Herramienta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td>2 pares</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfatos de Dulbecco&amp;rsquo;s (1x)</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri estéril de poliestireno Fisherbrand</td><td>Herramienta</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído al 4 % en PBS</td><td>Reactivo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección rectas de punta afilada</td><td>Herramienta</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Ratas hembra preñadas</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la disección de embriones de ratón 6,5 dpc

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Análisis de patrones de expresión génica durante las primeras etapas del desarrollo embrionario de mamíferos pueden proporcionar pistas importantes sobre la función del gen, la célula-célula la interacción y los mecanismos de señalización que guía los patrones embrionarias. Sin embargo, la disección del embrión de ratón de la decidua, poco después de la implantación puede ser un procedimiento difícil y detalladas paso a paso la documentación de este proceso es insuficiente. Aquí se demuestra cómo después de la implantación (6,5 dpc), los embriones se encuentran aisladas por primera disección del útero de un ratón embarazadas (detección de coitum el tapón vaginal fue designado poist días 0,5) y, posteriormente, la disección del embrión a partir de la decidua materna. La disección de la membrana de Reichert se describe así como la eliminación del cono ectoplacental.

El aislamiento de embriones etapa post-implantación, permite estudiar los patrones de genes y analizar células de linaje toma de decisiones durante el desarrollo embrionario, aunque la disección adecuada del embrión temprano puede ser un desafío. Este protocolo describe un método para aislar las primeras etapas primitivas racha de embriones (~ 6,5 días post coitum [dpc]).

La disección de embriones de ratón 6,5 dpc

El análisis de los patrones de expresión génica durante las etapas tempranas del desarrollo embrionario de los mamíferos puede proporcionar pistas importantes sobre la función génica, la interacción célula-célula...

Me llamo Kelly Shea y soy la encargada del laboratorio y también técnica de investigación en el Laboratorio de Neilsen, es muy difícil porque muchas personas no saben cómo distinguir las diferentes capas del tejido. Por lo tanto, lo que debe hacerse es esencialmente separar todas las capas del tejido para exponer el embrión subyacente, que en este momento no está muy vascularizado. Por eso es muy transparente y difícil de distinguir.Tome pinzas y tijeras bastante robustas. Lo primero que debe hacer es pellizcar al animal justo alrededor de la línea media y realizar un primer corte. A partir de ese punto, simplemente puede separar la piel, exponiendo el abdomen del animal.Hay una capa delgada del peritoneo que vas a levantar con la pinza y luego puedes cortar con tijeras y desplazar hacia un lado. Debes cortar a lo largo de la línea media del animal y separar ambos cuernos uterinos, que están conectados en el centro. Puedes cortar justo en la base.Probablemente obtendrá mucha grasa junto con él. Y tome todo el cuerno uterino del animal. Simplemente colóquelo directamente en el PBS.Entonces, esto está en el cuerno. Estos son los sitios de implantación, 1, 2, 3, 4, 5. Lo que desea hacer es separarlos.Básicamente, puedes cortar entre los sitios de implantación justo aquí. Puedes agarrar simplemente el embrión por su lado y, esencialmente, separarlo. En este momento, estás exponiendo el deum, que es un tejido más esponjoso situado debajo.Por lo tanto, el embrión debe estar justo en el centro, justo aquí. Este es el ápice del órgano temporal. Desea orientarlo hacia arriba con el ápice.Lo que hará es cortar aproximadamente un quinto del camino desde el ápice hacia abajo. El embrión debe quedar justo en el centro aquí. Lo que hago es orientarlo de lado, tomar un par de pinzas y sujetarlo de cierta manera, mantenerlo presionado con la otra, cortar la punta y luego separarlo.Entonces, una vez que se retira esa tapa, coloque el embrión sobre su borde. Y como puede ver, hay una abertura justo en el lugar donde se quitó la tapa. Solo debe introducir la pinza allí. Sí.En este momento, el embrión queda muy suelto dentro del deum. Una vez que abra el deum, prácticamente puede sacarlo con relativa facilidad, siempre que logre colocarse debajo de su base. Es muy pequeño.También hay algunos tejidos aún adheridos al embrión. Tiene el cono ectoplacentario, que se encuentra justo aquí en el ápice del embrión. Y también tiene algunos otros tejidos aún adheridos.Así que tomo la pipeta y lo aspiro. En este momento, desea fijar los embriones. Por lo tanto, tengo un recipiente con PFA.Queríamos analizar genes candidatos. Básicamente, estamos utilizando técnicas de ARN en montaje completo e hibridación in situ para visualizar la producción de ácidos nucleicos in situ dentro de un embrión. Estos genes específicos que nos interesan codifican marcadores putativos de precursores de células germinales, y además se predice que se expresan en el embrión de ratón en un punto temporal específico que ayuda a las células germinales a desarrollarse y madurar desde precursores putativos de células germinales hasta células germinales.Uno de esos factores que nos interesa mucho en primer lugar, y que fue el primer factor en el que realizamos una hibridación in situ completa en estos embriones de día 6,5, fue la proteína morfogenética ósea o BMP4. Es un miembro de la familia superadora del TGF-beta. Es muy importante y es absolutamente necesaria en la maduración de las células germinales.Y también es necesario que las células germinales se transloquen a través del embrión y se ubiquen cerca de la línea primitiva del embrión. Y la BMP-4 desempeña un papel fundamental tanto en la señalización como en la maduración que deben experimentar las células germinales para poder ubicarse en la línea primitiva. Por lo tanto, en primer lugar, debe asegurarse de saber qué está buscando, conocer su pequeño tamaño, la escala con la que está trabajando, y también sentarse a planificar con mucha atención.La técnica, especialmente con qué tipo de microscopio estereoscópico va a trabajar. Una de las dificultades técnicas es que esto implica muchas manipulaciones y movimientos de mano muy, muy firmes para no dañar el embrión. Por lo tanto, se necesita un microscopio estereoscópico con mucho espacio para manipular, y también asegúrese de tener todo preparado para el experimento, de modo que no tenga que realizar más manipulaciones de las necesarias durante la disección.Así que, aparte de eso, creo que es necesario avanzar muy lentamente y separar las capas de tejido individuales con mucha lentitud para saber con qué está trabajando. Y asegúrese de saber dónde se encuentra el embrión.

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Investigación

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Biología

La capacidad de las células germinales embrionarias a diferenciarse en células germinales primordiales durante etapas tempranas del desarrollo es un modelo perfecto para hacer frente a nuestra hipótesis sobre el cáncer y la infertilidad. Este protocolo se muestra la forma de aislar las células germinales primordiales de las gónadas en desarrollo de embriones de 10.5 a 11.5 días después de ratón coitum.

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

Las proyecciones estereotipadas de aferencias sensoriales en la médula espinal de roedores ofrecen un sistema experimental de fácil acceso para estudiar la ramificación axonal a través del rastreo de los axones individuales.

DII-etiquetado de las neuronas DRG para el Estudio de ramificación axonal en una preparación Todo el montaje del cable del ratón embrionario espinal

Un protocolo para la separación de ectodermo y el mesénquima facial embrión se describe. Utilizamos Dispasa II para el tratamiento de embriones enteros en primer lugar, analizar las prominencias faciales completas, y luego separar el ectodermo facial y mesénquima.

La separación de Ratón Facial ectodermo embrionario y mesénquima

Los cultivos neuronales embrionarios primarios disociados del hipocampo son útiles para investigar los mecanismos de señalización implicados en la muerte neuronal. El sexado de los embriones antes del aislamiento y disociación del hipocampo permite la preparación de cultivos masculinos y femeninos separados, lo que permite al investigador identificar e investigar la señalización celular específica del sexo.

Cultivos neuronales estratificados por sexo para estudiar las vías de muerte de las células isquémicas

La placa notocordal y nodo son transitorios los organizadores en el desarrollo de embriones de ratón que pueden visualizarse mediante varias técnicas de señalización. Aquí, describimos en detalle cómo realizar dos de las técnicas para estudiar su estructura y morfogénesis: 1) microscopía electrónica de barrido (SEM); y 2) todo Monte inmunofluorescencia (WMIF).

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

Presentamos los protocolos para examinar el desarrollo del corazón de ratón utilizando microscopía epifluorescente Monte todo en embriones de ratón disecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato reportero knock-en ratones. Este método nos permite visualizar directamente cada etapa de la formación del ventrículo durante el desarrollo del corazón de ratón sin mano de obra intensiva métodos histoquímicos.

Análisis del desarrollo de la cámara cardiaca durante la embriogénesis de ratón usando todo de Monte de epifluorescencia

Aquí, proporcionamos un protocolo de disección requerido para obtener imágenes en vivo de la gónada masculina embrionaria tardía de Drosophila . Este protocolo permitirá la observación de procesos celulares dinámicos en condiciones normales o después de la manipulación transgénica o farmacológica.

Disección e imágenes en vivo de la Drosophila gonad embrionaria tardía

Aquí, describimos herramientas y métodos computacionales que permiten la visualización y el análisis de datos de imágenes tridimensionales y cuatridimensionales de embriones de ratón en el contexto de la elongación y segmentación axial, obtenidos por tomografía de proyección óptica in toto, y por imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo mediante microscopía multifotónica.

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Aprende a disecar embriones de ratón de 6,5 dpc para estudiar patrones de expresión génica y decisiones de linaje celular en biología del desarrollo. Este protocolo sistemático facilita el aislamiento de embriones en etapa de raya primitiva.

La disección de embriones de ratón 6,5 dpc

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