Name: La microinyección de ADN en intranucleares disociada neuronas de mamíferos adultos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-10T17:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: Aprende la microinyección intranuclear de ADN en neuronas disociadas de mamíferos adultos para expresar proteínas heterólogas. Esta técnica permite estudiar la función proteica en células post-mitóticas difíciles de transfectar.

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Nuestro laboratorio de investigación es apoyado por el Programa de Investigación Intramural del NIH, el Instituto Nacional sobre el Abuso de Alcohol y Alcoholismo.

<html> I. Preparación para la inyección Esta sección describe los pasos de preparación que deben tomarse antes de la inyección de cDNA en el núcleo de las neuronas. El procedimiento de aislamiento de las neuronas está fuera del alcance de este artículo, pero es importante que las neuronas disociadas en las células individuales y adherirse bien a la superficie inferior de 35 placas de cultivo celular mm (véase la discusión de consejos útiles para lograr esto). Aunque una variedad de diferentes neuronas podría ser utilizado, los ganglios periféricos, tales como los ganglios cervical superior (SCG) o los ganglios de la raíz dorsal son los preferidos para la disección, porque son de fácil acceso y el rendimiento de un gran número de neuronas. Otras ventajas de la utilización de las neuronas SCG es que son una población relativamente homogénea de las células y bien caracterizados 1,2,3,4. A. Preparación del plásmido cDNA para la inyección <ol><li> Para evitar la contaminación o degradación del ADN, se deben usar guantes durante la preparación. </li><li> ADN que codifica la proteína de interés se subclona en un vector de expresión adecuado de mamíferos, tales como PCI (Promega, Madison, WI), bajo el control del citomegalovirus muy activa y constitutiva (CMV). Si la proteína no está etiquetado, un plásmido reportero, EGFP codificación, por ejemplo (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), es co-inyección para confirmar el éxito de la inyección y la expresión. El ADN es aislado mediante una columna de separación de alta calidad (por ejemplo, QIAfilter Midi-prep kit, Qiagen, Chatsworth, CA) y se purifica aún más con una unidad de filtro centrífugo con un filtro PVDF (0,1 micras, Millipore, Bedford, MA) para eliminar las partículas en el preparación de plásmidos, que pueden obstruir las pipetas de inyección durante el proceso de inyección. Los plásmidos son almacenadas a -20 ° C a una concentración de aproximadamente 1 mg / l en un buffer de ADN de almacenamiento adecuado (por ejemplo, tampón TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Inmediatamente antes de la microinyección, ADNc del plásmido se diluyen y se mezcla con la concentración final deseada en buffer TE o H 2 O. Por lo general, 5-10 ng / l del gen reportero es suficiente para marcar a las células inyectadas, y la concentración total de cDNA para ser inyectado no debe superar los 200 ng / l ya que el ADN es viscoso en altas concentraciones y puede obstruir las pipetas de inyección. Un pequeño volumen de cDNA para la inyección (50 a 10 l) se prepara mezclando gotas de la solución sobre la superficie limpia de un pequeño trozo de Parafilm (lateral por debajo del soporte de papel). Mezclar las gotas de la solución, junto con pipeta hacia arriba y abajo varias veces con un pipetor y evitar la introducción de burbujas de aire durante la mezcla. </li><li> Usando una punta de pipeta microloader (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), la transferencia de la solución de cDNA a un tubo de hematocrito especialmente preparado (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Vea la sección de materiales para obtener instrucciones sobre la preparación de los tubos de hematocrito (Tabla de Materiales). Coloque el tubo de hematocrito que contiene la solución inyectable de cDNA en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar el tubo durante 15-30 min a 10 000 g en una microcentrífuga equipado con un rotor de cubeta de ángulo fijo o balanceo (Eppendorf), a temperatura ambiente (20-24 ° C) a las partículas de sedimento en la solución de cDNA que pueda bloquear las microinyección pipeta. La solución inyectable de ADNc se pueden mantener a temperatura ambiente durante la sesión de la inyección. </li></ol> B. La fabricación de pipetas de inyección <ol><li> Pipetas desechables microinyección de vidrio están disponibles comercialmente (por ejemplo, Femtotips, Eppendorf), que son convenientes, pero caro ($ 10 por pipeta de microinyección). Pipetas de inyección se pueden fabricar en el laboratorio usando un P-97 programable extractor Flaming pipeta Brown (Empresa Sutter Instrument, Novato, CA) y filamented, de paredes delgadas tubos capilares de borosilicato (Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL). Esta opción es más rentable y permite el control de la forma y el tamaño de pipeta de microinyección. </li><li> Un programa de dos etapas se utiliza para tirar estrechas puntas de pipeta de microinyección. Desde la apertura de pipetas de microinyección es demasiado estrecho para examinarla bajo el microscopio de luz, la calidad de las pipetas de inyección tienen que ser evaluadas directamente mediante la inyección de unas pocas células antes de la configuración del programa se finalicen. Los siguientes son los valores aproximados para los ajustes de calor, la atracción, la velocidad y el tiempo: (la 1) 600, 115, 15, 250, (pull 2) 640, 130, 65, 200. Estos valores varían con diferentes lotes de vidrio y por la condición de que el filamento de calentamiento en el extractor, y debe ajustarse según sea necesario. Para más detalles véase el punto 5. </li><li> Tire de varias (2-5) pipetas de inyección por plato de neuronas que se inyecta, en caso de daños o problemas durante la sesión de la inyección. Tienda de pipetas de inyección en un recipiente tapado para evitar que entre polvo en la punta de la pipeta de microinyección. </li></ol> II. Microinyección intranucleares tienda de campaña &quot;&gt; En esta sección se detalla el proceso de inyección de cDNA en el núcleo de las neuronas. Una microinyección de configuración básica incluye una fase invertida microscopio de contraste (por ejemplo, Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY) para visualizar el proceso, micromanipulador (por ejemplo, Eppendorf 5171) para controlar el movimiento de la pipeta de inyección y una presión de inyección (por ejemplo, Eppendorf FemtoJet Express) para expulsar a la solución de cDNA a partir de la pipeta. Conexión de la presión de inyección para el micromanipulador permite la sincronización de los dos últimos procesos durante las inyecciones. Otros opcional, pero altamente recomendable, componentes incluyen un sistema de video vigilancia montado (cámara CCD, Cohu Inc., San Diego, CA, en blanco y negro monitor de vídeo, Sony Corporation, Tokio, Japón). Este sistema no es un requisito absoluto para inyecciones; Sin embargo, el monitor en blanco y negro ofrece un alto contraste para una mejor visualización del núcleo celular y ofrece una experiencia de visualización más cómoda durante las sesiones de inyección de largo. Además, un ordenador portátil con software para operar un controlador de mano se puede utilizar para semi- automatizar el proceso de inyección (véase la discusión para más detalles). El momento ideal para inyectar las neuronas SCG es de 3-6 horas después de la disociación. En esta etapa, las células son esféricas, muy bien fijadas a la parte inferior del plato, y el núcleo es claramente visible, con un microscopio de contraste de fase, como un centro de orgánulos ronda con una membrana oscura, que contiene una sola o múltiples nucleolos (Figura 1A). <ol><li> Coloque un plato de neuronas disociadas en el centro de la platina del microscopio. Ajustar el enfoque y optimizar la óptica de contraste de fase del microscopio de modo que el núcleo de las neuronas son claramente visibles. </li><li> Pipeta de 2 l de solución preparada cDNA en una pipeta de microinyección con una punta de pipeta microloader. Que elaborar una solución en la parte inferior del tubo de hematocrito, ya que podría despertar las partículas que se establecieron durante la centrifugación. El filamento de la pipetas de microinyección debe ayudar en la elaboración de una solución a la punta, pero si persisten las pequeñas burbujas de aire, dé golpecitos en el lado del vidrio para desalojarlos. </li><li> Inserte la pipeta de microinyección en el titular de la presión capilar de inyección y asegurar el soporte para el micromanipulador. El soporte se fija en un ángulo de 45 °. </li><li> Baje la pipeta de microinyección en el plato. A medida que la pipeta entre en el medio de cultivo, el menisco se forma que afecta a la refracción de la luz y reduce la calidad de la imagen de las neuronas. Para aliviar este problema, la torre del anillo de fase puede ser ligeramente desplazado hasta el núcleo de las neuronas son claramente visibles de nuevo. </li><li> Algunos sistemas de inyección a alta presión tienen una &quot;limpia&quot; la función que se aplica la presión máxima del aire de la punta de la pipeta de microinyección de un corto período. Utilice esta función para borrar la pipeta de escombros antes de comenzar y durante las inyecciones si la punta aparece tapado. Si el líquido disipado no es visible en la pantalla mientras se utiliza esta función, vuelva a colocar con una pipeta nueva inyección. </li><li> El centro de la pipeta de microinyección en el monitor de visualización y alinear la punta al lado de una neurona y en el mismo plano focal que el nucléolo. Establecer esta posición como la más baja del eje z límite en el micromanipulador. Esta posición es la profundidad de la pipeta de microinyección avanzarán a durante las inyecciones. Ahora la posición de la punta de unos 30 m por encima de este punto para la pipeta de microinyección elimina la parte superior de las neuronas. </li><li> El &quot;inyectar&quot; el modo de un micromanipulador Eppendorf 5171 se puede definir con los siguientes valores para realizar inyecciones intranucleares. La función de inyectar está activada, mientras que la función es atravesar la dejó. Un camino de inyección de diagonal (a lo largo del X y Z) produce la menor cantidad de daño celular, y por lo tanto el modo axial se debe utilizar para preparaciones inyectables. Una velocidad de inyección de 300 m / s es suficiente, y sincronizar la acumulación de presión cuando la pipeta de microinyección alcanza el conjunto del eje z límite. </li><li> La presión de inyección controla la cantidad de solución de cDNA se inyecta en el núcleo. En el modo &quot;automático&quot; de la inyección, la entrega de ADN es controlada en el tiempo e iniciado por el micromanipulador conectado. La presión de inyección (Pi) se debe establecer entre 100 a 200 hectopascales (hPa, 1 hPa ~ 0,015 psi); mayores presiones de inyección no mejoran las tasas de éxito o la calidad de las inyecciones y puede indicar otros problemas con el tamaño de la microinyección de ADN punta de la pipeta o la pureza . Una duración de la inyección (TI) de 0,3 s y una compensación de presión (Pc), de 30 hPa, que suministra una presión positiva constante para evitar la entrada de oclusión de las partículas del medio de cultivo en la punta de la pipeta, se debe utilizar. </li><li> Posición de la neurona que se inyecta debajo de la punta de la pipeta de microinyección con el microscopio de xy el eje de control de la etapa. Alinee la punta de la pipeta por encima del centro del núcleo, centrándose ida y vuelta entre tque la punta y el nucléolo. </li><li> Inyectar el núcleo pulsando el botón de inyección (en el micromanipulador). Para el paso de la inyección, el movimiento de la pipeta de microinyección y el lanzamiento de la solución de cDNA son controlados por el micromanipulador. Es difícil confirmar el éxito inyecciones intranucleares a ojo, pero la inyección de la solución de viscosidad relativamente baja cDNA (en comparación con el medio ambiente nuclear viscoso), a menudo aparece como un penacho blanco bajo la óptica de contraste de fase y se puede utilizar como un indicador de inyección en el núcleo. A veces la pipeta de microinyección no penetra en la membrana nuclear y simplemente empuja el núcleo. Un intento de la segunda inyección en la misma posición puede conducir a un éxito de la inyección de ADN en el núcleo. Hinchazón de la célula es generalmente indicativo de la inyección citoplasmática no intencional. Además, la hinchazón significativa nuclear no es bien tolerado por las neuronas y generalmente resulta en la muerte celular poco después, por lo que la presión de inyección y la duración no debe superar los valores sugeridos. </li><li> Continuar inyectando neuronas mediante el reposicionamiento de la platina del microscopio para alinear la siguiente neurona en la pipeta de microinyección. Sistemáticamente navegar a través de la antena para inyectar aproximadamente 50 a 100 núcleos antes de devolver el plato de las neuronas a la incubadora de incubación durante la noche. Neuronas con éxito inyectada puede ser identificado al día siguiente por la expresión del gen reportero. </li></ol> III. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: ganglio cervical superior (SCG), las neuronas. La imagen de contraste de fase de las neuronas SCG 3 horas después de la disociación (A). En esta etapa, el núcleo se ve claramente que ayuda a la alineación de la punta de la pipeta de microinyección. El núcleo aparece en el centro de las neuronas con una sola (izquierda) o múltiples (derecha) nucleolos oscuros. SCG neuronas 16 horas después de la inyección de EGFP cDNA en el núcleo (B). Izquierda, SCG neuronas se observa bajo la iluminación de contraste de fase. Derecha, imagen de epifluorescencia de las mismas neuronas que muestra la inyección con éxito y que resulta la expresión EGFP en una neurona. Barra blanca escala es de 20 micras. <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2: Plenario de células grabaciones de las corrientes a través de heteróloga-expresado acoplados a proteína G por dentro rectificación de K + (GIRK) canales de las neuronas SCG. GIRK corrientes (I GIRK) fueron evocados por una rampa de voltaje de 200 ms -140 a 40 mV desde un potencial de mantenimiento de -60 mV (en el recuadro de la A) tras la activación endógena de α 2-adrenérgicos de norepinefrina (NE, 10 M) . Huellas superpuestas son las grabaciones de la misma neurona e indicar antes (negro) y después de la aplicación de cualquiera de NE solo (azul) o NE más de 10 mM Ba 2 + (rojo). Las líneas discontinuas indican el nivel actual de cero. Para la grabación de I GIRK, la solución externa que contiene (en mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 10 HEPES, 10 de CaCl 2, 0,8 MgCl 2, 15 glucosa, sacarosa 15, y 0,0003 TTX, ajustada a pH 7,4 con NaOH. La solución de grabación interna contenía (en mM) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP, y el 0,3 Na 2 GTP, ajustado a pH 7,2 con KOH. La falta de corriente provocada por la rampa de tensión en la presencia de NE en las neuronas SCG no inyectadas (A) demuestra que las neuronas SCG no expresan canales GIRK endógeno. Inyección de éxito de un plásmido que codifica cDNA funcional GIRK canal 11 da lugar a grandes corrientes en la rampa de tensión cuando se expone al NE (B, izquierda). Corrientes tienen las características típicas de las corrientes a través de canales GIRK: la activación de un agonista de los receptores acoplados a proteína G (NE), rectificación hacia adentro, y el bloque de corrientes por el bloqueador del canal GIRK supuesto, Ba 2 + (B, derecha trazo rojo). Los círculos vacíos y llenos representan I GIRK en la explotación y el pico de corriente, respectivamente. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 2.

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<li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+%CE%B2%CE%B3+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein βγ subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li>
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<li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4%2C+the+two+subunits+of+the+KACh+channel%2C+using+functional+homomeric+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li>
</ol>

Problemas comunes y sugerencias: Como se mencionó anteriormente inyecciones, nuclear éxito dependerá de que las células adheridas a las placas de cultivo de tejidos. Aplazar el inicio de las inyecciones de un par de horas después del procedimiento de disociación de células permite que las neuronas se adhieren al fondo de los platos. Además, platos con revestimiento de 0,1 mg / ml de alto peso molecular de poli-L-lisina (Sigma, St. Louis, MO) la adhesión de las neuronas ayudas a la superficie inferior de los platos. La obstrucción de pipetas de microinyección, especialmente cuando se trata de inyectar una alta concentración de ADN, puede ser un problema frecuente. Con alta calidad de las columnas de separación para aislar y purificar el ADN plásmido, y la realización de las etapas de purificación adicionales que se mencionan (filtros de giro, girar en los tubos de hematocrito) puede ayudar a eliminar las partículas antes de la inyección. Durante las inyecciones, la &quot;limpia&quot; en función de la presión de inyección se pueden utilizar (por 0,2 s es suficiente), pero si eso no resuelve el problema, una pipeta nueva inyección debe ser utilizado. Si la mayoría de las pipetas de microinyección se tapan durante una sesión de inyección, considerar la modificación de la configuración del extractor pipeta de vidrio para producir puntas de pipeta de microinyección con una abertura más grande. Otra cuestión que se plantea durante las inyecciones nuclear es la irregularidad de la superficie inferior de placas de cultivo de tejidos. Esta variabilidad afecta directamente a la precisión de la focalización de las puntas de pipeta de inyección para el núcleo ya que la profundidad de la pipeta atraviesa durante las inyecciones es fijo. Por lo tanto, este límite del eje z debe ser ajustado durante el curso de las inyecciones en el mismo plato. Será evidente que un ajuste es necesario: no habrá ninguna indicación de la inyección nuclear (no penacho blanco en el núcleo de la célula o se pierde por completo), o la punta de la pipeta de inyección se aproxima a la parte inferior de la placa (la compresión de la célula o incluso chocar la punta de la pipeta en el fondo del plato). La clonación de vidrio cilindros (. OD 10 mm, Cat. N º 2090-01010, Bellco Glass, Vineland, NJ) se puede utilizar durante el forro de las neuronas para restringir en una más pequeña, la zona más limitada, por lo que minimiza la distancia necesaria para mover la pipeta de inyección entre las inyecciones. Estos cilindros de clonación se retiran antes de realizar microinyecciones. Inconvenientes de la técnica: Microinyecciones intranucleares son técnicamente exigentes, que requieren paciencia y un alto grado de destreza manual por el operador. Capacidad con esta técnica, al igual que con cualquier otra habilidad, viene con la práctica. Por lo tanto, se aconseja la práctica de inyecciones nuclear del gen reportero solo antes de intentar experimentos reales. Para ayudar aún más el proceso de inyección, puede ser posible para consolidar los pasos del micromanipulador y la presión de inyección en un programa de ordenador. Programas como Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, Oregón) puede ser utilizada para almacenar la configuración de microinyección y programar los controladores multifuncionales (SHUTTLEPRO, Contour Design, Windham, Nueva Hampshire) para semi-automatizar el proceso de inyección (ver 6,7,8 para más detalles). Otro de los inconvenientes de la técnica de microinyección intranucleares es la baja tasa de éxito. Aproximadamente el 10-20% de los intentos de inyecciones nuclear conducen a la expresión de proteínas. Mientras que la eficacia puede ser suficiente para las aplicaciones que no requieren un gran número de células que expresan, la electrofisiología, por ejemplo, para varios ensayos bioquímicos esto puede no ser suficiente. Aplicaciones de la técnica: A pesar de sus inconvenientes, la microinyección de ADN intranuclear es una técnica extremadamente útil para heteróloga la expresión de proteínas en las neuronas. Los altos niveles de expresión de la proteína se logra con microinyecciones nuclear debido a la gran cantidad de plásmidos liberado en el núcleo durante las inyecciones, un promotor de CMV de gran actividad que regula la transcripción de genes, y la estabilidad a largo de los plásmidos en el núcleo. La sobre-expresión de proteínas es especialmente útil en el dominante negativo de los experimentos en los altos niveles de proteínas heterólogas están obligados a abrumar a la proteína endógena. Otra de las ventajas de las inyecciones intranucleares es la capacidad de entregar una parte consistente de las construcciones de cDNA para el núcleo que construye múltiples son inyectados. Con los métodos de transfección otra parte, es difícil introducir reproducible en la misma proporción de cada constructo de ADN en las células diferentes en el mismo plato y entre las transfecciones. Inyección directa de la solución de cDNA en el núcleo elimina esta fuente de variabilidad y permite que la proporción de proteínas que se expresan a titularse con eficacia. Los métodos tradicionales tienen una eficacia limitada de la transfección en células post-mitóticas por baja incorporación de ADN en el núcleo 9 y la toxicidad química asociada con Reag transfecciónlos padres 10. Microinyecciones nuclear superar estos problemas mediante la introducción de material genético mecánica en el núcleo. Aunque esta técnica es más compleja, la capacidad de estudiar el efecto de una proteína en un sistema biológico funcional, con las vías de señalización endógena, más que compensa el carácter laborioso de esta técnica. Todos los procedimientos experimentales en animales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de las Directrices para el Cuidado de Animales y el empleo.

<table><tbody><tr><td>Unidad de filtro Ultrafree-MC</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td>Filtro Durapore PVDF; tamaño de poro de 0,1 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>Tampón TE</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>351-010-131</td><td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0</td></tr><tr><td>Tubos capilares de microhematocrito</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td>Preparación sin heparinizar:&lt;br/&gt;Remojar en etanol al 100 % durante toda la noche. Lavar cuidadosamente con agua desionizada tres veces y secar horneando el vidrio en un horno (95&amp;#x00B0;C). Cortar los tubos de hematocrito limpios en trozos de 3-4 cm de longitud utilizando un punzón con punta de diamante, y sellar un extremo con una llama y pinzas para sujetar el vidrio. Almacenar en un vaso de vidrio limpio y cubrir para evitar la acumulación de polvo.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>Con rotor de ángulo fijo o de cubeta oscilante</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta Microloader de 20 &amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio capilar para microinyección</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW120F-4</td><td>De pared delgada con filamento, diámetro exterior de 1,2 mm, diámetro interior de 0,9 mm, longitud de 100 mm</td></tr><tr><td>Tractor de micropipetas Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Con filamento de caja de platino-iridio (pieza n.º FB330B)</td></tr><tr><td>Microscopio invertido Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Lentes objetivas de contraste de fases de 20x y 40x, montadas sobre una mesa de aislamiento de vibraciones</td></tr><tr><td>Cámara de dispositivo con acoplamiento de carga (CCD)</td><td>Cohu Inc.</td><td>6410</td><td></td></tr><tr><td>Monitor de video</td><td>Sony Corporation</td><td>PVM-122</td><td>En blanco y negro, pantalla de 9&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Sistema de micromanipulador</td><td>Eppendorf</td><td>5171</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de microinyección</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de microinyección</td><td>Contour Design</td><td>S-PROV2</td><td>Controlador multimedia programable</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Version 4.05A</td><td>Programa de comandos para controlar el controlador de microinyección escrito por S. Ikeda</td></tr></tbody></table>

la microinyección de adn en intranucleares disociada neuronas de mamíferos adultos

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Cultivos primarios de células neuronales son herramientas valiosas para estudiar la función de la proteína, ya que representan un sistema biológicamente más relevantes, en comparación a las líneas de células inmortalizadas. Sin embargo, la naturaleza post-mitótica de las neuronas primarias impide la expresión efectiva de proteínas heterólogas utilizando procedimientos comunes como la electroporación o la transfección mediada químicamente. Así, otras técnicas se deben emplear para expresarse con eficacia las proteínas en estas células no se dividen. En este artículo se describen los pasos necesarios para realizar las inyecciones intranucleares de las construcciones de cDNA en disociar las neuronas simpáticas de adultos. Esta técnica, que se ha aplicado a diferentes tipos de neuronas, con éxito puede inducir la expresión de proteínas heterólogas. El equipo esencial para el procedimiento de microinyección incluye un microscopio invertido para visualizar las células, una pipeta de inyección de vidrio llena con una solución de cDNA que está conectado a un N 2 (g) sistema de suministro de presión, y un micromanipulador. El micromanipulador coordina el movimiento de la inyección de una pipeta de microinyección con un breve pulso de presión de N 2 para expulsar solución de cDNA a partir de la punta de la pipeta. Esta técnica no tiene la toxicidad asociada con muchos otros métodos de transfección y permite múltiples constructos de ADN que se expresa en una proporción constante. El bajo número de células inyectadas hace que el procedimiento de microinyección muy adecuado para estudios de células individuales, tales como registros electrofisiológicos y de imagen óptica, pero puede no ser ideal para los ensayos bioquímicos que requieren un mayor número de células y una mayor eficiencia de transfección. A pesar de microinyecciones intranucleares requerirá una inversión de equipo y el tiempo, la capacidad de alcanzar altos niveles de expresión de proteínas heterólogas en un ambiente fisiológicamente relevantes hace que esta técnica una herramienta muy útil para investigar la función de proteínas.

Inyección directa intranucleares de cDNA es una técnica eficaz para la transfección las células post-mitóticas. Este método proporciona altos niveles de expresión de proteínas heterólogas de construcciones de ADNc únicos o múltiples y permite la función de proteínas a estudiar en un ambiente fisiológicamente relevantes con una variedad de ensayos de células individuales.

La microinyección de ADN en intranucleares disociada neuronas de mamíferos adultos

Los cultivos celulares primarios de neuronas son herramientas valiosas para estudiar la función proteica, ya que representan un sistema biológicamente más relevante en comparación con...

En el primer paso de este procedimiento de inyección, se centrifuga una concentración de trabajo de la solución de ADN para sedimentarla. Luego, se llenan pipetas de inyección para material particulado fabricadas con tubo capilar de vidrio de borosilicato con la solución de ADN. Las células se colocan sobre la platina del microscopio y se optimiza la visualización del núcleo celular.La pipeta se alinea con el núcleo y se inyecta la célula. Al día siguiente, se inyectan múltiples células en cada placa. Las células inyectadas con éxito se identifican mediante la expresión de un gen reportero.Hola, soy Van Mu del laboratorio del Dr. Stephen Akeda en el Instituto Nacional sobre el Abuso de Alcohol y Alcoholismo de los Institutos Nacionales de la Salud. Soy Damien Williams, también del Laboratorio Akeda. Y soy Eugene Run del laboratorio AKEDA.Hoy les mostraremos el procedimiento para la microinyección INTERCLEAR de constructos de ADNc en neuronas disociadas. Este es un método eficaz para expresar heterológicamente proteínas de interés en células posmitóticas, que tradicionalmente son difíciles de transfectar. Utilizamos esta técnica en nuestro laboratorio para estudiar los mecanismos subyacentes a la modulación de canales N por proteínas G.Entonces, obtengamos dientes oscuros. Comience sembrando neuronas disociadas de mamíferos adultos en placas de cultivo celular recubiertas con poli-L-lisina de alto peso molecular a 0,1 miligramos por mililitro. Esto facilita la adhesión de las neuronas a la superficie inferior de las placas.Los cilindros de vidrio para clonación pueden utilizarse para concentrar neuronas sembradas en un área más pequeña y confinada. Para minimizar la distancia entre las neuronas que se van a inyectar, coloque las placas en un incubador a 37 grados Celsius durante tres a seis horas antes de realizar microinyecciones intranucleares, con el fin de permitir tiempo suficiente para que las células se adhieran al fondo de las placas.Mientras las neuronas se incuban, se preparan las pipetas para microinyección utilizando un extractor de llama Sutter P 97 y tubos capilares de vidrio borosilicatado de pared delgada. Utilizamos un programa de dos etapas de tracción con los siguientes parámetros para la primera tracción y para la segunda tracción. Dado que los parámetros necesarios varían según el lote de vidrio y según el estado del filamento calefactor del extractor, deben ajustarse según sea necesario.Se deben preparar al menos cinco pipetas de inyección por cada placa de neuronas, por si las pipetas se dañan o surgen problemas durante la sesión de inyección. Las pipetas de inyección preparadas deben almacenarse en un recipiente cubierto para evitar que entre polvo en la punta de la pipeta de microinyección inmediatamente antes de la inyección. Los ADNc plasmídicos se diluyen hasta la concentración de trabajo. Coloque un pequeño trozo de paraformo sobre la superficie de trabajo y retire el respaldo de papel.Añada la solución stock de ADNc y tampón TE al param. Para diluir el ADNc, recomendamos utilizar una concentración final de ADNc inferior a 200 nanogramos por microlitro y un volumen total entre dos y 10 microlitros. Si la proteína codificada por el ADNc no tiene etiqueta, un plásmido reportero que codifique, por ejemplo, EGFP, puede coinyectarse junto con el ADNc experimental. Para confirmar una inyección y expresión exitosas, mezcle las soluciones de ADNc pipeteando arriba y abajo varias veces en perfil.Teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas de aire, sedimente cualquier partícula presente en la solución de ADNc que podría obstruir posteriormente la pipeta de microinyección. Utilice una punta de pipeta microloader para transferirla a un tubo de hematocrito preparado, que haya sido limpiado, cortado y sellado con llama en un extremo. Luego, coloque el tubo de hematocrito dentro de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifugue durante 15 a 30 minutos.10.000 GS a temperatura ambiente. Una vez finalizada la centrifugación, coloque el tubo que contiene la solución de inyección de ADNc aparte. La solución puede mantenerse a temperatura ambiente durante la sesión de inyección de una a dos horas.Después de sembrar las células, retire los cilindros de clonación de vidrio. Luego, devuelva las células sembradas al incubador durante el resto del período de incubación previo a la sesión de inyección. Para comenzar a inyectar, primero tome un plato con neuronas sembradas del incubador y colóquelo sobre la platina del microscopio de un sistema de inyección.El montaje consta de un microscopio invertido de contraste de fases, un inyector de presión conectado a un micromanipulador y un sistema de monitoreo de video. En contraste de fases, las neuronas aparecen como células esféricas con un núcleo claramente visible como un orgánulo central redondeado con una membrana oscura y pueden contener uno o varios nucléolos. Utilizando una punta de pipeta microloader, aspire dos microlitros del ADN preparado del tubo de hematocrito.Teniendo cuidado de evitar la solución cerca del fondo del tubo donde pueden haberse depositado partículas. Transfiera la solución a una pipeta de microinyección. El filamento dentro de la pipeta de microinyección debe facilitar la aspiración de la solución hacia la punta.Pero si persisten pequeñas burbujas de aire, golpee suavemente el costado del vaso para desprenderlas y asegúrese de que el soporte del capilar del inyector de presión esté fijado en un ángulo de 45 grados. Luego, inserte la pipeta de microinyección en el soporte del capilar y asegure el soporte al micromanipulador. A continuación, baje la pipeta de microinyección en el recipiente utilizando el micromanipulador; cuando la pipeta entre en el medio de cultivo, se forma un menisco que altera la trayectoria de la luz a través de la muestra y, por lo tanto, reduce la calidad de imagen de las neuronas.Para aliviar este problema, ajuste la torreta de fase hasta que los núcleos de las neuronas sean claramente visibles. Antes de comenzar las inyecciones, utilice la función de limpieza del sistema de inyección por presión para despejar la pipeta de residuos y verificar la calidad de las pipetas de microinyección.La solución expulsada debe ser visible en la pantalla. Al usar esta función, el líquido de una punta de pipeta de tamaño óptimo se expulsa en forma de un hilo delgado. Si la pipeta de microinyección está obstruida o es demasiado estrecha, no expulsará líquido al utilizar la función de limpieza.Si la punta es demasiado ancha o se ha roto, el fluido será expulsado desde la punta en forma de un chorro amplio. Si la punta parece subóptima durante las inyecciones, reemplace ahora la pipeta de inyección y centre la pipeta de microinyección en la pantalla de visualización. Manteniendo el núcleo enfocado, baje la punta de la pipeta hasta que esté enfocada junto a una neurona.Establezca esta posición como el límite inferior del eje Z en el micromanipulador. Esta posición es la profundidad a la que avanzará la pipeta de microinyección durante las inyecciones. A continuación, coloque la punta aproximadamente a 30 micrómetros por encima de este punto.Por lo tanto, la pipeta de microinyección libera la parte superior de las neuronas. Ahora programe la configuración del micromanipulador para microinyecciones. Establezca el modo de inyección de un micromanipulador einor en encendido y la función de penetración en apagado para minimizar el daño celular.Durante la microinyección, designe una trayectoria de inyección diagonal seleccionando el modo axial. Establezca la velocidad de inyección en 300 micrómetros por segundo y sincronice el aumento de presión hasta el límite. Siguiente programa.La configuración del inyector de presión establece la presión de inyección o PI entre 100 y 200 hectopascales o HPA, la duración de la inyección o ti en 0,3 segundos y la presión de compensación o PC en 30 HPA. Una vez ajustados los parámetros del manipulador, se pueden realizar inyecciones intranucleares. Utilizando el control de posición del eje XY de la platina del microscopio, coloque el neutrón bajo la punta de la pipeta de microinyección.Alinee la punta de la pipeta sobre el centro del núcleo enfocando hacia arriba y hacia abajo entre la punta y el núcleo. Inyecte el núcleo presionando el botón de inyección del micromanipulador. La inyección de la viscosidad relativamente baja.La solución de ADNc suele aparecer como una nube blanca en el núcleo. Cuando se observa con óptica de contraste de fase. Continúe inyectando neuronas reajustando la platina del microscopio para alinear la siguiente neurona bajo la pipeta de microinyección.Navegue sistemáticamente a través de la placa. Continúe inyectando núcleos. Utilice la función de limpieza descrita anteriormente cada 10 a 15 inyecciones para verificar la calidad de la pipeta de microinyección.Si la pipeta está obstruida o dañada, reemplácela con una nueva inyección. La irregularidad de la superficie inferior de las placas de cultivo celular puede hacer que la pipeta de inyección no alcance la célula o que la nube blanca no sea visible en el núcleo. En estos casos, simplemente ajuste la punta de la pipeta de microinyección al mismo plano de enfoque que el núcleo, y establezca este como el nuevo límite del eje x.Luego, continúe inyectando neuronas. A veces, la pipeta de microinyección no penetra la membrana nuclear y simplemente empuja el núcleo. Si esto ocurre, un segundo intento de inyección en la misma posición puede conducir a una inyección exitosa de ADN en el núcleo.La hinchazón de la célula generalmente indica una inyección citoplasmática involuntaria. Una vez que se hayan inyectado de 50 a cien núcleos, devuelva el recipiente con neuronas al incubador para una incubación nocturna. Después de 16 horas, las neuronas inyectadas con éxito pueden identificarse mediante la expresión de un gen reportero.En este campo, se ha inyectado una neurona del ganglio cervical superior o SCG, que puede identificarse por la expresión de EGFP. Las neuronas del SCG no inyectadas, que no poseen canales de potasio rectificadores entrantes acoplados a proteínas G endógenas, o canales grk, no generan corrientes medibles durante una rampa de voltaje. Sin embargo, cuando se exponen al agonista del receptor acoplado a proteína G, noradrenalina, la inyección exitosa del plásmido CD NA que codifica un canal grk funcional da lugar a corrientes grandes durante una rampa de voltaje al exponerse a noradrenalina.Las corrientes medidas aquí son típicas de los canales Kirk y se caracterizan por la activación por norepinefrina, rectificación entrante y la inhibición por el putativo bloqueador del canal grk. Bario, acaban de mostrarle cómo inyectar CD NA en el núcleo de las neuronas. Al realizar esta técnica, es importante recordar cuatro aspectos.Uno, hacer girar el ADN antes de la inyección. Dos, asegurarse de que el núcleo sea claramente visible. Tres, volver a ajustar el límite del eje Z al desplazarse por la placa.Y cuatro, verificar regularmente la calidad del extremo de la pepineta entre inyecciones. Eso es todo; gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.

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Investigación

JoVE Journal

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