Una novela RFP reportero para ayudar en la visualización del disco imaginal del ojo en Drosophila

La nueva línea transgénica de Drosophila con reportero IRFP expresa la proteína fluorescente roja o RFP en células específicas del disco imaginario I. Esta línea transgénica puede ayudar en la identificación, disección y marcado de tipos celulares específicos en el ojo en desarrollo. Para disecar el disco imaginario del ojo, se extraen larvas de tercer estadio errantes del costado de un frasco mediante una espátula.

Las larvas se colocan luego en una gota de PBS sobre un recipiente de cultivo. Las partes bucales con los discos oculares adheridos se separan del resto de la larva utilizando pinzas; a continuación, los discos oculares se transfieren a un portaobjetos, donde se disecan separándolos de las partes bucales y del cerebro. Hola, soy Amna Cole del laboratorio de Joseph Bateman en el Centro Wolfson para Enfermedades Relacionadas con la Edad del King's College de Londres.

Hoy vamos a mostrarles un procedimiento para diseccionar discos oculares imaginales de Drosophila. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los genes involucrados en la neurogénesis. Así que comencemos.

Para comenzar la disección de discos imaginales del ojo, coloque una gota de PBS sobre una placa de Petri recubierta con Syl Guard. Bajo un microscopio estereoscópico, el recubrimiento de Syl Guard ayudará a proteger las pinzas contra daños durante la disección. A continuación, utilizando una espátula, tome una larva de tercer estadio en estado errante y colóquela en la gota de PBS. Sosteniendo una pinza en cada mano, agarre la larva a dos tercios del camino hacia el extremo posterior con un par de pinzas. Ahora use el otro par de pinzas para sujetar las piezas bucales de color oscuro en el extremo anterior de la larva.

Separar suavemente la larva moviendo las pinzas en direcciones opuestas. Las piezas bucales deben separarse del resto del cuerpo con el complejo ojo-cerebro adherido. A continuación, colocar una gota de PBS sobre un portaobjetos y transferir los discos a la gota de PBS sujetando las piezas bucales.

Ahora cambie al modo de fluorescencia en el microscopio estereoscópico, ya que solo los discos imaginarios oculares expresan RFP; pueden identificarse fácilmente como tejido fluorescente rojo que recubre los lóbulos ópticos esféricos para aumentar el contraste de los discos. Dirija la fuente de luz fría de fibra óptica en un ángulo oblicuo hacia la preparación. Los discos imaginarios oculares están unidos a los lóbulos ópticos mediante el pedúnculo óptico en la región posterior y a las partes bucales mediante un pedúnculo procedente del disco antennal en la región anterior.

Para diseccionar los discos imaginales del ojo, sostenga las partes con un par de pinzas y use el otro par para separar los discos imaginales del cerebro larval. A continuación, separe los discos imaginales del ojo de las piezas bucales. Una vez que las piezas bucales se hayan separado de los discos imaginales del ojo, retírelas del portaobjetos.

Los discos imaginarios del ojo ahora deben estar planos sobre su portaobjetos y deben estar libres de cualquier tejido extraño, incluido el tejido cerebral. Continúe diseccionando los discos imaginarios restantes. Una vez que se hayan disecado todos los discos imaginarios del ojo, incline suavemente el portaobjetos y use un pequeño trozo de papel absorbente para eliminar el exceso de PBS.

Ahora agregue una gota de medio de montaje vector shield y coloque suavemente una lámina de cobertura encima. Los discos ya están listos para ser observados mediante microscopía de fluorescencia epiescopia o confocal. Si la observación se realizará más tarde, guarde la preparación a cuatro grados Celsius.

El RFP permanecerá visible durante al menos un año cuando se obtengan imágenes de series Z, las cuales deben adquirirse en un microscopio confocal o Zeiss aome con un espaciado de un micrómetro utilizando una lente de proyección de 20 x o 40 x; luego se pueden generar imágenes de proyección mediante el software del microscopio. Se disecaron discos imaginales de moscas que expresan IRFP y se tiñeron con Phin. Posteriormente, se realizó la imagenología en un microscopio zes aome con un espaciado de un micrómetro utilizando una lente de 20 x. Las células del disco ocular, que expresan RFP, se muestran en rojo.

La surco morfogenético se visualiza mediante foid y tinción y aparece en color verde. Los polos dorsal y ventral del disco ocular están curvados y tienden a plegarse. Estas secciones pueden omitirse de la imagen final de proyección.

Aunque el disco es un epitelio de monocapa, las posiciones variables de los núcleos requieren una proyección de serie Z para obtener una imagen general del disco. Dado que el reportero IRFP está localizado en el núcleo, el patrón que se observa aquí representa la expresión nuclear de RFP. Acabamos de mostrarle cómo realizar el procedimiento para diseccionar discos oculares vaginales de drosófila.

Al utilizar este procedimiento, es mejor que use un par de pinzas finas y probablemente sea conveniente evitar también el café. Gracias por ver este video y mucha suerte con todos sus experimentos.