Name: Una novela RFP reportero para ayudar en la visualización del disco imaginal del ojo en Drosophila /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Aprende a diseccionar discos imaginales del ojo en Drosophila usando un reportero RFP nuclear. Esta técnica permite identificar tipos celulares específicos durante el desarrollo ocular con fluorescencia roja.

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Este trabajo fue financiado por el Kings College de Londres y la Royal Society.

<ol&gt;<li&gt; En primer lugar una gota de PBS en un plato Sylgard bajo un microscopio de disección.</li&gt;<li&gt; A continuación, retire varias larvas errantes estadio tercero de un frasco o una botella con una espátula y colocarlos en la PBS.</li&gt;<li&gt; Para comenzar la disección usar pinzas mano izquierda (si eres diestro) para captar una larva de dos tercios del camino hacia la parte posterior y luego usar el otro par para mantener los ganchos de la boca de color oscuro en el extremo anterior.</li&gt;<li&gt; Ahora, tire suavemente de la larva, aparte de mover los dos pares de pinzas de distancia el uno del otro. El aparato bucal debe venir del resto del cuerpo con el complejo ojo / cerebro adjunto.</li&gt;<li&gt; Para la tinción de los discos del ojo para corregir la inmunofluorescencia de los discos en este momento por su inclusión en el 4% de paraformaldehído / PBS solución durante 30-45 minutos en hielo. A continuación, lavar los discos de cuatro veces con PBST y luego con tinción de anticuerpos adecuados.</li&gt;<li&gt; Es más fácil analizar los discos de los ojos directamente en una diapositiva. Coloque una gota de PBS en un portaobjetos y se mueven los discos a la caída de PBS mediante la celebración de las piezas bucales.</li&gt;<li&gt; Los tejidos imaginal son translúcidas y así que al principio los discos de los ojos son difíciles de identificar. Para que sea más fácil identificar a utilizar un microscopio de disección con capacidad de fluorescencia. Con el ojo-RFP línea reportero de los discos del ojo se puede ver claramente como el tejido de color rojo fluorescente que cubre los lóbulos ópticos esféricos (Figura 1).</li&gt;<li&gt; Si está utilizando una fibra óptica la fuente de luz fría dirigir la luz en un ángulo oblicuo a la diapositiva, ya que esto dará a los discos de mayor contraste. Los discos para los ojos / las antenas se unen a los lóbulos ópticos a través del tallo óptico en la parte posterior y las piezas bucales a través de un tallo esté desde el disco de las antenas en la parte anterior.</li&gt;<li&gt; Para diseccionar los discos de los ojos tienen el aparato bucal con un par de pinzas y utilizar el otro par de separar los discos de los ojos del cerebro de larvas. A continuación separar los discos de los ojos de las piezas bucales. Por último, eliminar las piezas bucales de la diapositiva, ya que pueden evitar que el cubreobjetos por haber estado acostado.</li&gt;<li&gt; Una vez disecada todos los discos de los ojos suavemente la inclinación de la diapositiva y secar el exceso de PBS. A continuación, agregue una gota de Vectashield y suavemente coloque un cubreobjetos en la parte superior.</li&gt;<li&gt; Los discos ya están listos para ser captado por cualquiera de microscopía de epifluorescencia o confocal (Figura 2).</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; Resultados de la Representante</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Cuando disecados correctamente el disco para los ojos / las antenas deben estar planos sobre el portaobjetos clara de los tejidos extraños, como el cerebro. Los polos dorsal y ventral del disco de los ojos son curvas y por lo tanto tienden a veces, pero esto puede ser evitado mediante la adopción de una serie Z en un microscopio confocal y la omisión de estas secciones de la proyección. Aunque el disco es un epitelio monocapa de las posiciones variables de los núcleos requieren una proyección de la serie Z para obtener una visión global del disco. Una proyección de un típico ojo-RFP para los ojos / disco antenal tomadas con un microscopio confocal se muestra en la Figura 2. Por lo general toman una micras secciones a través del disco usando una lente de 20x o 40x. El reportero del ojo-RFP se localiza nuclear y por lo que el patrón que se observa en la Figura 2 representa los núcleos de las células que expresan RFP.</p&gt;<p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig1.jpg" alt="figure 1" /<br /<strong&gt; Figura 1. Disección inicial del ojo / cerebro complejo de un ojo-RFP larva tercer estadio Drosophila.</strong&gt; El ojo / antenal disco imaginal (descritos) pueden ser vistas adjunta a las piezas bucales (MP) y la superposición del lóbulo óptico (OC) del cerebro. La imagen fue tomada utilizando un microscopio de fluorescencia de disección para mostrar la expresión de RFP en el disco de los ojos. Anterior está a la izquierda. Barra de escala: 300 micras.</p&gt;<p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig2.jpg" alt="figure 2" /<br /<strong&gt; Figura 2. Expresión de los ojos del periodista-RFP en el disco imaginal del ojo.</strong&gt; Un tercer ojo estadio (ED) / disco antenal (EA) disecado de una larva de ojos RFP RFP muestra la expresión (rojo). El disco estaba manchada con phalloidin (verde), que se tiñe la superficie apical de células y muestra el surco morfogenéticos (cabeza de flecha). RFP se expresa en las células precursoras de todo el MF, en fotorreceptores 1,6,7 y en las células del cono. Anterior está a la izquierda. Barra de escala: 25 micras.</p

<ol><li>Doroquez, D. B., Rebay, I. Crit Rev Biochem Mol Biol. 41 (6), 339-339 (2006).</li>
<li>Kaul, A. K., Craig, G. M., McNeill, H., Bateman, J. M. , Forthcoming.</li>
<li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. Biotechniques. 36 (3), 436-436 (2004).</li>
</ol>

La disección del ojo disco imaginal de Drosophila es sencillo, pero puede tomar tiempo para dominar. Los pasos fundamentales son la identificación de los discos del ojo y su disección fuera del cerebro de larvas. Identificación de los discos del ojo se hace más fácil el uso de la línea de los ojos-RFP se describe aquí. Modificaciones posibles son para extraer el disco antenas o la membrana peripodial, o dejar el lóbulo óptico conectado a visualizar los axones de relaciones públicas en el cerebro. <p class="...

una novela rfp reportero para ayudar en la visualización del disco imaginal del ojo en drosophila</em

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

La<em&gt; Drosophila</emLos ojos&gt; es un sistema poderoso modelo para el estudio de áreas como la transducción de señales neurogénesis y neurodegeneración. Muchos de los descubrimientos realizados mediante este sistema se han aprovechado de la naturaleza espacio-temporal de la diferenciación de los fotorreceptores en el disco imaginal del ojo de desarrollo. Para utilizar este sistema, primero es necesario para el investigador que aprender a identificar y analizar el disco de los ojos. Se describe un periodista de la novela RFP para ayudar en la identificación de los discos del ojo y la visualización de determinados tipos de células en el ojo en desarrollo. Se detalla una metodología para la disección del disco imaginal del ojo de larvas de tercer estadio y describir cómo el periodista de ojos RFP puede ayudar en esta disección. Este reportero ojo-RFP sólo se expresa en el ojo y puede ser visualizada mediante microscopía de fluorescencia, ya sea en tejido vivo o después de la fijación, sin necesidad de amplificación de la señal. También mostramos cómo este reportero se puede utilizar para identificar los tipos de células específicas dentro del disco del ojo. Este protocolo y el uso de la reportera del ojo-RFP ayudará a los investigadores con el<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ojos para hacer frente a cuestiones biológicas de importancia fundamental.

Se describe una nueva proteína fluorescente roja (RFP) periodista que se expresa específicamente en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Ojo. Se detalla una metodología para la disección del disco imaginal del ojo y cómo este indicador puede ser utilizado para ayudar en la disección y la identificación de tipos específicos de células en el ojo en desarrollo.

Una novela RFP reportero para ayudar en la visualización del disco imaginal del ojo en Drosophila</em

El ojo de la Drosophila es un potente sistema modelo para estudiar áreas como la neurogénesis, la transducción de señales y la neurodegeneración. Muchos de los descubrimientos ...

La nueva línea transgénica de Drosophila con reportero IRFP expresa la proteína fluorescente roja o RFP en células específicas del disco imaginario I. Esta línea transgénica puede ayudar en la identificación, disección y marcado de tipos celulares específicos en el ojo en desarrollo. Para disecar el disco imaginario del ojo, se extraen larvas de tercer estadio errantes del costado de un frasco mediante una espátula.Las larvas se colocan luego en una gota de PBS sobre un recipiente de cultivo. Las partes bucales con los discos oculares adheridos se separan del resto de la larva utilizando pinzas; a continuación, los discos oculares se transfieren a un portaobjetos, donde se disecan separándolos de las partes bucales y del cerebro. Hola, soy Amna Cole del laboratorio de Joseph Bateman en el Centro Wolfson para Enfermedades Relacionadas con la Edad del King's College de Londres.Hoy vamos a mostrarles un procedimiento para diseccionar discos oculares imaginales de Drosophila. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los genes involucrados en la neurogénesis. Así que comencemos.Para comenzar la disección de discos imaginales del ojo, coloque una gota de PBS sobre una placa de Petri recubierta con Syl Guard. Bajo un microscopio estereoscópico, el recubrimiento de Syl Guard ayudará a proteger las pinzas contra daños durante la disección. A continuación, utilizando una espátula, tome una larva de tercer estadio en estado errante y colóquela en la gota de PBS. Sosteniendo una pinza en cada mano, agarre la larva a dos tercios del camino hacia el extremo posterior con un par de pinzas. Ahora use el otro par de pinzas para sujetar las piezas bucales de color oscuro en el extremo anterior de la larva.Separar suavemente la larva moviendo las pinzas en direcciones opuestas. Las piezas bucales deben separarse del resto del cuerpo con el complejo ojo-cerebro adherido. A continuación, colocar una gota de PBS sobre un portaobjetos y transferir los discos a la gota de PBS sujetando las piezas bucales.Ahora cambie al modo de fluorescencia en el microscopio estereoscópico, ya que solo los discos imaginarios oculares expresan RFP; pueden identificarse fácilmente como tejido fluorescente rojo que recubre los lóbulos ópticos esféricos para aumentar el contraste de los discos. Dirija la fuente de luz fría de fibra óptica en un ángulo oblicuo hacia la preparación. Los discos imaginarios oculares están unidos a los lóbulos ópticos mediante el pedúnculo óptico en la región posterior y a las partes bucales mediante un pedúnculo procedente del disco antennal en la región anterior.Para diseccionar los discos imaginales del ojo, sostenga las partes con un par de pinzas y use el otro par para separar los discos imaginales del cerebro larval. A continuación, separe los discos imaginales del ojo de las piezas bucales. Una vez que las piezas bucales se hayan separado de los discos imaginales del ojo, retírelas del portaobjetos.Los discos imaginarios del ojo ahora deben estar planos sobre su portaobjetos y deben estar libres de cualquier tejido extraño, incluido el tejido cerebral. Continúe diseccionando los discos imaginarios restantes. Una vez que se hayan disecado todos los discos imaginarios del ojo, incline suavemente el portaobjetos y use un pequeño trozo de papel absorbente para eliminar el exceso de PBS.Ahora agregue una gota de medio de montaje vector shield y coloque suavemente una lámina de cobertura encima. Los discos ya están listos para ser observados mediante microscopía de fluorescencia epiescopia o confocal. Si la observación se realizará más tarde, guarde la preparación a cuatro grados Celsius.El RFP permanecerá visible durante al menos un año cuando se obtengan imágenes de series Z, las cuales deben adquirirse en un microscopio confocal o Zeiss aome con un espaciado de un micrómetro utilizando una lente de proyección de 20 x o 40 x; luego se pueden generar imágenes de proyección mediante el software del microscopio. Se disecaron discos imaginales de moscas que expresan IRFP y se tiñeron con Phin. Posteriormente, se realizó la imagenología en un microscopio zes aome con un espaciado de un micrómetro utilizando una lente de 20 x. Las células del disco ocular, que expresan RFP, se muestran en rojo.La surco morfogenético se visualiza mediante foid y tinción y aparece en color verde. Los polos dorsal y ventral del disco ocular están curvados y tienden a plegarse. Estas secciones pueden omitirse de la imagen final de proyección.Aunque el disco es un epitelio de monocapa, las posiciones variables de los núcleos requieren una proyección de serie Z para obtener una imagen general del disco. Dado que el reportero IRFP está localizado en el núcleo, el patrón que se observa aquí representa la expresión nuclear de RFP. Acabamos de mostrarle cómo realizar el procedimiento para diseccionar discos oculares vaginales de drosófila.Al utilizar este procedimiento, es mejor que use un par de pinzas finas y probablemente sea conveniente evitar también el café. Gracias por ver este video y mucha suerte con todos sus experimentos.

a-novel-rfp-reporter-to-aid-visualization-eye-imaginal-disc

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

A continuación se describe un protocolo para examinar la migración de las células gliales en el desarrollo del ojo de Drosophila mediante el análisis microscópico directo emparejado con GFP etiquetados células gliales.

Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila

Un enfoque estándar para preparar a los...

Preparación de los adultos Drosophila Ojos de seccionamiento fino y análisis microscópico

Source: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)El video muestra una técnica de imagen en vivo para estudiar el patrón de ojos en una pupa de Drosophila melanogaster. Los marcadores marcados con proteína fluorescente verde (GFP) permiten la visualización de la organización y diferenciación celular durante la formación de la estructura ocular en desarrollo.

Imágenes en vivo del ojo de la pupa de Drosophila mediante microscopía de fluorescencia

El método de tomate / GFP-FLP / FRT implica la visualización de las células fotorreceptoras de mosaico en Drosophila que viven. Se puede utilizar para seguir destinos celulares de los fotorreceptores individuales en la retina durante días o semanas. Este método es ideal para los estudios de degeneración de la retina y enfermedades neurodegenerativas o el desarrollo de las células fotorreceptoras.

El tomate / GFP-FLP / FRT Método para imágenes en vivo del mosaico adultos<em&gt; Drosophila</em&gt; Las células fotorreceptoras

Las estructuras adultas de Drosophila se derivan de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. El análisis de estos discos proporciona información sobre muchos procesos de desarrollo, incluida la determinación de tejidos, el establecimiento de límites de compartimentos, la proliferación celular, la especificación del destino celular y la polaridad celular plana. Este protocolo se utiliza para preparar discos imaginales para microscopía óptica/fluorescente.

La disección y la inmunotinción de imaginal discos de Drosophila melanogaster

Este protocolo presenta un método eficiente para obtener imágenes del neuroepitelio vivo del ojo de la pupa de Drosophila. Este método compensa el movimiento del tejido y la topología irregular, mejora la visualización de los límites celulares mediante el uso de múltiples proteínas de unión marcadas con GFP y utiliza un equipo de imágenes fácil de ensamblar.

Live-proyección de imagen de la Drosophila Pupal Ojo

El objetivo de esta técnica es permitir a los investigadores realizar la disección, inmunotinción y montaje de discos oculares de pupa de Drosophila melanogaster de cualquier edad.

Disección y montaje de<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal discos Eye

Este protocolo se muestra cómo generar tumores clonales fluorescente marcada, genéticamente definidos en el ojo de Drosophila / discos imaginales de las antenas (EAD). En él se describe cómo diseccionar el EAD y el cerebro de la tercera fase larvaria y la forma de procesarlos para visualizar y cuantificar cambios de expresión génica y la invasividad tumoral.

los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Este protocolo describe un método detallado para el cultivo a largo plazo ex vivo y de formación de imágenes en vivo de un disco imaginal Drosophila. Esto demuestra la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial dentro del período de 10 horas de imágenes en vivo del ojo de disco. El protocolo es simple y no requiere instalación costosa.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

El momento de la exposición a los ligandos puede afectar sus consecuencias en el desarrollo. Aquí mostramos cómo tomar imágenes de una proteína morfogenética ósea Drosophila (BMP) llamada Dpp de las células del disco del ala.

Imaging Dpp Liberación de un disco de ala Drosophila

Este artículo describe un protocolo eficiente de disección imaginaria de discos y tinción de anticuerpos que es económico con los reactivos y facilita el manejo de discos imaginarios en pequeñas cantidades.

Disección a pequeña escala y tinción por anticuerpos de discos imaginales de antenas oculares y de alas de Drosophila melanogaster

Aprende a diseccionar discos imaginales del ojo en Drosophila usando un reportero RFP nuclear. Esta técnica permite identificar tipos celulares específicos durante el desarrollo ocular con fluorescencia roja.

Una novela RFP reportero para ayudar en la visualización del disco imaginal del ojo en Drosophila

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