Name: Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-21T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprende a preparar embriones de Drosophila para microscopía electrónica de transmisión y visualizar la ultraestructura del tubo cardíaco embrionario. Este protocolo permite estudiar la morfogénesis cardíaca con alta resolución.

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Nuestro trabajo en la formación del corazón del tubo fue apoyada por la National Science Foundation Grant (ID Premio 0.744.165) para SGK

<ol><li> Recién preparar 2 ml de una solución fijadora contiene 12,5% de glutaraldehído en tampón cacodilato 50 mM (pH 7,4) en un vial de centelleo de 20 ml de vidrio. Añadir 8 ml de n-heptano y agitar vigorosamente. Permitir a las dos fases se separen. Retire la fase superior que contiene n-heptano saturado con glutaraldehído, el lugar en un vial de centelleo limpio y dejar de lado. Esta será la solución fijadora. </li><li> Recoger embriones 00-20 horas usando una cámara de recogida de embriones, que es una pequeña cesta con una inserción de malla extraíble. Quitar la membrana externa del corion por inmersión de embriones en una solución de lejía al 50% durante 2-3 minutos, o hasta que los embriones flotan en la superficie de la lejía. Enjuague bien con embriones ddH20 y mancha en una toalla de papel. </li><li> Con unas pinzas, recoja el tamiz que se cubre con embriones dechorionated y lugar en la solución de fijación, lo que permite embriones a caer de la malla. Permita que los embriones para fijar durante 1,5 horas a 4 ° C mientras se mezcla en un Nutator. </li><li> Prepare una placa de Petri llena de cinta de doble cara. Eliminar embriones del fijador con una pipeta Pasteur y colocarlos sobre una superficie grabada de Petri dish.Transfer los embriones en una cantidad mínima de solución fijadora para evitar que el heptano en el fijador de disolver el pegamento de la cinta. Agitar la placa de Petri para hacer una sola capa de embriones. Coloque una placa de Petri en la campana hasta que se evapore heptano. Añade suficiente Tween20 PBS + 0,1% para cubrir los embriones. Devitellinize mano etapa tardía de 16 embriones en un microscopio con una aguja de tungsteno contundente. Recuperar los embriones con una pipeta Pasteur a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Los pasos 5-7 se llevan a cabo en este tubo de microcentrífuga. </li><li> Enjuague los embriones en 0,1 M cacodilato, pH 7,4 y después de fijar en una solución que contiene 1% de tetróxido de osmio en 0,1 M cacodilato tampón, pH 7,4 durante 1 hora a temperatura ambiente. Enjuague los embriones con 0,1 M cacodilato, pH 7,4. </li><li> Deshidratar los embriones en una serie gradual de etanol y acetona. Deshidratar embriones con un 50% de etanol durante 10 minutos, seguido por el 70% de etanol durante 10 minutos. Luego se deshidratan en un 90% de acetona durante 10 minutos, y dos pasos de 100% de acetona de 10 minutos cada uno. </li><li> Eliminar la acetona y luego comenzar el proceso de infiltración mediante la adición de una relación 1:1 Epon-resina Spurr: mezcla de acetona a los embriones. Microondas durante tres minutos con un Pelco Biowave microondas Pro, manteniendo la muestra bajo la presión de vacío. Aplicar presión de vacío para la muestra por otros cinco minutos después de la microonda ha terminado. Intercambio de las 1:01 de resina, la mezcla de acetona con Epon-Spurr resina 100% y de microondas de nuevo bajo la presión de vacío. Cambio del 100% Epon-resina Spurr por última vez, y microondas bajo la presión de vacío. </li><li> Con una pipeta Pasteur, los embriones se transfieren desde el tubo de microcentrífuga a un molde de silicona incrustación. Alinear los embriones en una fila de tal manera que el extremo posterior del embrión se alinea con el borde afilado del molde. Hornear en un horno de 70 º C durante la noche. </li><li> Quitar la muestra y prepararse para el corte. </li><li> Comenzar a recortar las secciones con un diamante de 1μm Histo cuchillo y Richert Ultracut E microtomo. Tome nota de que la sección de primer embrión es alcanzado. Desde este punto, corte 100μm en la muestra. Remover una sección con un bucle, y el lugar en un portaobjetos de vidrio. En pocas palabras el calor de la sección en un plato caliente. Tinción de la sección con una gota de azul de metileno. Bajo un microscopio de luz identificar la luz del corazón. </li><li> Los cortes de secciones de 90nm con un ultra Diamante 45 ° Cuchillo y Richert Ultracut E microtomo. Recoger varias secciones en una rejilla de cobre. </li><li> Las rejillas son teñidas con acetato de uranilo al 3% saturada en etanol al 50% durante diez minutos y luego enjuagar tres veces con agua destilada. Entonces, las redes están manchadas con citrato de plomo (0.04gms disuelto en 10 ml de agua destilada doble y 100 ml de NaOH 10M) durante 2,5 minutos en una cámara que contiene gránulos de NaOH para crear un CO 2 libre de medio ambiente. Las rejillas se lavaron tres veces con agua destilada. </li><li> Las secciones se examinaron con un microscopio electrónico JEOL 1200EX a 80kV, y se fotografiaron con una cámara digital de AMT. </li></ol>

<ol><li>Tepass, U., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+Cellular+Junctions+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo.</a> Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , (2000).</li>
<li>Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsion+by+Slit+and+Roundabout+prevents+Shotgun%2FE-cadherin-mediated+cell+adhesion+during+Drosophila+heart+tube+lumen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation.</a> J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).</li>
</ol>

La morfogénesis del tubo cardíaco embrionario de Drosophila se ha convertido en un sistema modelo valioso para el estudio de la adhesión celular y cambios en las células forma durante el desarrollo embrionario. Uno de los desafíos que enfrentan en el estudio de esta estructura es que la luz del tubo cardíaco es difícil de visualizar en los embriones de montaje en su conjunto. La técnica se demuestra en este vídeo, que es una adaptación de los procedimientos anteriormente descritos 1-2, ha demostrado ser exitoso en forma eficiente y fiable el análisis de un gran número de genotipos para el tubo de corazón y la formación del lumen 3.

preparación de embriones para microscopía electrónica de la drosophila tubo cardíaco embrionario

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

La morfogénesis de la<em&gt; Drosophila</emTubo&gt; corazón embrionario se ha convertido en un sistema modelo valioso para estudiar la migración celular, la adhesión célula-célula y cambios en las células forma durante el desarrollo embrionario. Uno de los desafíos que enfrentan en el estudio de esta estructura es que la luz del tubo cardíaco, así como las características de la membrana que son cruciales para la formación del corazón del tubo, son difíciles de visualizar en los embriones de montaje en su conjunto, debido al pequeño tamaño del tubo cardíaco e intra-luminal del espacio en relación con el embrión. El uso de la microscopía electrónica de transmisión permite una mayor ampliación de estas estructuras y da la ventaja de examinar los embriones en la sección transversal, que revela fácilmente el tamaño y la forma de la luz. En este video, se detalla el proceso para la fijación fiable, inclusión, y la sección de la etapa terminal<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones con el fin de visualizar la luz del tubo del corazón, así como importantes estructuras celulares, incluyendo las uniones célula-célula y la membrana basal.

Se describe un proceso para la fijación, inclusión, corte, y las imágenes de la etapa terminal<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones de Microscopía Electrónica Trasmission del tubo cardíaco embrionario. Esta técnica permite la visualización de la luz del tubo del corazón, así como de la membrana basal, que recubre la luz del corazón.

Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

La morfogénesis del tubo cardíaco embrionario de Drosophila ha surgido como un sistema modelo valioso para estudiar la migración celular, la adhesión célula-célula y la célula...

Este video explica cómo realizar microscopía electrónica de transmisión, también conocida como MET, en el cartílago embrionario de Drosophila. El corazón ha surgido como un sistema modelo valioso para estudiar la migración celular, la adhesión célula-célula y los cambios en la forma celular. Esta técnica permite la visualización de la forma del lumen cardíaco, así como de componentes ultraestructurales como las membranas celulares, las uniones célula-célula y la membrana basal.Para comenzar este procedimiento, se prepara una solución de fijación adecuada para la microscopía electrónica de transmisión de embriones de Drosophila. A continuación, se coloca una colección de embriones recubiertos de cero a 20 horas en la solución de fijación. Una vez finalizado, los embriones se retiran de la solución de fijación y se manipulan mientras permanecen adheridos a cinta adhesiva de doble cara.En una placa de Petri que contiene tampón, los embriones desionizados flotan en el tampón y se recuperan con una pipeta. Luego, los embriones se fijan posteriormente y pasan por un gradiente de deshidratación. Una vez infiltrados con resina, se transfieren a un molde de inclusión donde se alinean.El bloque resultante se corta con un cuchillo de diamante. Las secciones se recogen sobre rejillas de cobre, se tiñen y se examinan. Hola, soy Nadine Lop del laboratorio de Sunita Kramer en el Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey en la Escuela de Medicina Robert Wood Johnson.Soy Raj Patel. Soy microscopista electrónico, también del departamento de patología PON. Hoy les mostraré un procedimiento para preparar e imaginar embriones de oph para microscopía electrónica de transmisión.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la morfogénesis del corazón de Drosophila. Así que comencemos. Comencemos.Antes de manipular los embriones de drosófila, prepare frescamente la solución fijadora para el método de fijación de embriones por permeabilización con heptano. En una campana extractora, pipetee dos mililitros de una solución recién preparada que contenga glutaraldehído al 12,5% en tampón Cate hacia un vial de vidrio para centelleo. Añada ocho mililitros de heptano ADA y agite vigorosamente.Luego espere un minuto. Permita que las dos fases se separen; la fase superior contiene la ADA en heptano, saturada con glutaraldehído, que es la solución fijadora. Pase la fase superior a un vial limpio y déjela aparte. Para recolectar embriones de cero a 20 horas, utilice una cámara de recolección de embriones, que es un pequeño recipiente con una inserción desmontable de malla.Comience por retirar la placa de jugo de uva que contiene los embriones y elimine cualquier mosca muerta. Luego, utilizando agua y un pincel, suelte los embriones de la placa de jugo de uva y transfiera los embriones a la cámara de recolección de embriones usando una botella cuadrada que contenga agua.Lave los embriones para eliminar cualquier exceso de levadura del plato de jugo de uva. Retire la membrana coriónica externa sumergiendo los embriones en una solución de lejía al 50 % durante dos o tres minutos, o hasta que los embriones floten en la superficie. Enjuague bien con agua destilada y coloque los embriones sobre una toalla de papel.Con unas pinzas, tome el inserto de malla, que ahora debería estar cubierto con embriones recubiertos. Coloque el inserto en el fijador, permitiendo que los embriones caigan de la malla. Deje que los embriones se fijen durante una hora y media a cuatro grados Celsius mientras se mezclan en un agitador orbital. Una vez finalizada la incubación, coloque los embriones en una placa de Petri forrada con cinta adhesiva de doble cara, tomando la menor cantidad posible del fijador. Agite la placa para distribuir los embriones en una sola capa y luego colóquela en la campana extractora para permitir que el heptano se evapore. Una vez que los embriones estén secos, cúbralos con tampón que contenga 0,1 % de tween hand de vize.Embriones de etapa 16 tardía bajo un microscopio estereoscópico con una aguja de tungsteno roma. Los embriones que han sido fijados flotan y pueden recuperarse con una pipeta Pasteur; transferir los embriones a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Lavar los embriones en tampón de catecolamina 0,1 molar y luego postfijar en tetróxido de osmio al 1 % durante una hora a temperatura ambiente.Después de la incubación, enjuague los embriones con tampón Cate. Nuevamente, deshidrate los embriones en una serie graduada de etanol y acetona. Comience con etanol al 50 % durante 10 minutos, seguido de etanol al 70 % durante 10 minutos, luego deshidrate en acetona al 90 % durante 10 minutos, y finalmente en acetona al 100 % en pasos de 10 minutos cada uno.Retire la acetona. Comience el proceso de infiltración añadiendo una mezcla uno a uno de resina ein spray y acetona. Asegúrese de que la muestra esté bajo presión de vacío y aplique microondas durante tres minutos.Mantenga la presión de vacío durante cinco minutos adicionales. Cambie la mezcla de resina y acetona por resina al 100 % y aplique microondas nuevamente bajo presión de vacío. Cambie la resina y aplique microondas bajo presión.Un tiempo final, para un total de tres pasos de infiltración. Transfiera los embriones desde el tubo microfuga a un molde de inclusión de silicona. Alinee los embriones en una fila de manera que el extremo posterior del embrión coincida con el borde estrechado del molde.Coloque el tocino en un horno a 70 grados Celsius durante la noche. Luego, retire el bloque resultante para su seccionado. Utilice un microtomo para cortar secciones de un micrómetro en los embriones.Una vez que se haya seccionado el bloque y se haya alcanzado el embrión, utilice un asa para transferir una sección individual a una portaobjetos para determinar si se ha alcanzado la profundidad adecuada para visualizar el corazón antes de la observación. Caliente brevemente la sección sobre una placa calefactora y tiña la sección con azul de metileno añadiendo primero una gota sobre el portaobjetos y luego calentando brevemente.Una vez más, enjuague con agua desionizada y examine la sección bajo el microscopio a la profundidad deseada de corte. La luz del corazón debe ser reconocible con un microscopio óptico para cumplir con las limitaciones de espacio. Vuelva a recortar el bloque para incluir un máximo de cinco embriones en corte transversal que muestren el corazón embrionario.Corte secciones de 90 nanómetros utilizando el micrótomo. Recoga múltiples secciones sobre una rejilla de cobre. Tiña la rejilla con acetato al 3% durante 10 minutos, luego enjuague tres veces con agua destilada.Ahora tiña la rejilla con citrato de plomo durante dos minutos y medio en una cámara que contenga gránulos de hidróxido de sodio para crear un ambiente libre de dióxido de carbono. Después de la incubación, enjuague tres veces con agua destilada. Examine las secciones con un microscopio electrónico a 80 kilovoltios y fotografíe con una cámara CCD.Con el fin de determinar si la profundidad del corte y el estadio se realizaron correctamente, debe observarse claramente que se ha formado una luz cardíaca madura entre los dos cardioblastos de la línea media dorsal; para determinar si las membranas celulares están intactas, examine la luz cardíaca en busca de la presencia de matriz extracelular y busque la presencia de corpúsculos de Christie y mitocondrias. Así que acaban de mostrarse cómo determinar la ultraestructura del corazón embrionario de Drosophila. Al realizar este procedimiento.Es importante recordar colocar adecuadamente los embriones de drosófila y medir con precisión los componentes de la resina, mezclándolos bien. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.

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Investigación

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Biología

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