Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

En este vídeo se explica cómo realizar la microscopía electrónica de transmisión, también conocida como TEM, en el carro embrionario de Drosophila. El corazón se ha convertido en un valioso sistema modelo para estudiar la migración celular, la adhesión celular y los cambios en la forma celular. Esta técnica permite la visualización de la forma del lumen del corazón, así como de los componentes ultraestructurales como las membranas celulares, las uniones celulares y la membrana basal.

Para iniciar este procedimiento, se prepara una solución de fijación apropiada para la microscopía electrónica de transmisión de embriones de Drosophila. A continuación, se coloca una colección de cero a 20 horas de embriones recubiertos en la solución de fijación. Una vez terminados, los embriones se retiran de la solución de fijación y se colocan a mano mientras se unen a una cinta adhesiva de doble cara.

En una placa de Petri que contiene tampón, los embriones desionizados flotan en el tampón y se recuperan con una pipeta. Luego, los embriones son postfijos y se someten a un gradiente de deshidratación. Una vez infiltrados con resina, se transfieren a un molde de incrustación donde se alinean.

El bloque resultante se corta con un cuchillo de diamante. Las secciones se recogen en rejillas de cobre, se tiñen y se examinan. Hola, soy Nadine Lop del laboratorio de Sunita Kramer en el Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey en la Escuela de Medicina Robert Wood Johnson.

Soy Raj Patel. Soy el microscopista electrónico también de la patología PON. Hoy os mostraremos un procedimiento para la preparación y obtención de imágenes de embriones oph para microscopía electrónica de transmisión.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la morfogénesis del corazón de Drosophila. Así que comencemos. Comenzar.

Antes de manipular los embriones de Drosophila, prepare una solución fijadora fresca para el método de permeación de heptano de fijación de embriones. En una pipeta de campana extractora, dos mililitros de una solución recién hecha que contiene un 12,5% de glutaraldehído en tampón Cate en un vial de centelleo de vidrio. Agregue ocho mililitros de heptano ADA y agite vigorosamente.

Luego espere un minuto. Permitiendo que las dos fases se separen, la fase superior contiene el heptano ADA, saturado con glutaraldehído, que es la solución fijadora. Pipetear la fase superior en un vial limpio y dejarlo a un lado Para recolectar embriones de cero a 20 horas, use una cámara de recolección de embriones, que es una pequeña canasta con un inserto de malla extraíble.

Comience por quitar el plato de jugo de uva que contiene los embriones y retire las moscas muertas. Luego usando agua y un pincel. Afloje los embriones del plato de jugo de uva, transfiera los embriones a la cámara de recolección de embriones usando una botella cuadrada que contenga agua.

Enjuague los embriones de cualquier exceso de levadura del plato de jugo de uva. Retire la membrana externa del corion sumergiendo los embriones en una solución de lejía al 50% durante dos o tres minutos o hasta que los embriones floten hacia la superficie. Enjuague bien con agua destilada y coloque los embriones en una toalla de papel.

Con pinzas, recoja el inserto de malla, que ahora debe estar cubierto con embriones recubiertos. Coloque el inserto en el fijador, permitiendo que los embriones caigan de la malla. Deje que los embriones se fijen durante una hora y media a cuatro grados centígrados mientras se mezclan en un balancín orbital.

Una vez finalizada la incubación, coloque los embriones en una placa de Petri forrada con cinta adhesiva de doble cara tomando la menor cantidad posible de fijador. Agite el plato para esparcir los embriones en una sola capa y luego colóquelo en la campana química para permitir que el heptano se evapore. Una vez que los embriones se hayan secado, cubra los embriones con un tampón que contenga 0,1% de tampón.

Etapa tardía 16 embriones bajo un microscopio de disección con una aguja de tungsteno roma. Los embriones que han sido ized, flotan y se pueden recuperar con una pipeta de pastoreo transfieren los embriones a un tubo de micro fuga de 1,5 mililitros. Enjuague los embriones en tampón de cate molar 0.1 y luego coloque el sufijo en tetróxido de osmio al 1% durante una hora a temperatura ambiente.

Después de la incubación, enjuague los embriones con tampón Cate. Una vez más, deshidrata los embriones en una serie de grados de etanol y acetona. Comience con 50% de etanol durante 10 minutos, seguido de 70% de etanol durante 10 minutos, luego deshidrate en 90% de acetona durante 10 minutos y finalmente en pasos de 100% de acetona de 10 minutos cada uno.

Retira la acetona. Comience el proceso de infiltración agregando una mezcla uno a uno de resina ein spray y acetona. Asegúrese de que la muestra esté bajo presión de vacío y cocine en el microondas durante tres minutos.

Mantenga la presión de vacío durante cinco minutos adicionales. Cambia la mezcla de resina acetona por 100% resina y vuelve a calentar en el microondas a presión de vacío. Cambia la resina y calienta en el microondas a presión.

Una última vez para un total de tres pasos de infiltración. Transfiera los embriones del tubo de micro fuga a un molde de inclusión de silicona. Alinee los embriones en una fila de manera que el extremo posterior del embrión se alinee con el borde cónico del molde.

El tocino se hornea a 70 grados centígrados durante la noche. A continuación, retire el bloque resultante para seccionarlo. Use un micrótomo para cortar secciones de un micrómetro en los embriones.

Una vez que se ha seccionado el bloque y se ha alcanzado el embrión, use un bucle para mover una sola sección a un portaobjetos de vidrio para determinar si se ha logrado la profundidad adecuada para visualizar el corazón antes de la visualización. Caliente brevemente la sección en una placa caliente y tiña la sección con azul de metileno agregando primero una gota al portaobjetos. Y luego brevemente calentando.

Nuevamente, enjuague con agua desionizada y examine la sección bajo un microscopio a la profundidad deseada de sección. El lumen del corazón debe ser reconocible con un microscopio óptico para satisfacer las limitaciones de espacio. Vuelva a recortar el bloque para incluir un máximo de cinco embriones en sección transversal que muestren el corazón embrionario.

Corta secciones de 90 nanómetros con el micrótomo. Recoge varias secciones en una rejilla de cobre. Tiñe la rejilla con acetato al 3% durante 10 minutos, luego enjuague tres veces con agua destilada.

Ahora tiñe la rejilla con citrato de plomo durante dos minutos y medio en una cámara que contenga gránulos de hidróxido de sodio para crear un ambiente libre de dióxido de carbono. Después de la incubación, enjuague tres veces con agua destilada. Examine las secciones con un microscopio electrónico a 80 kilovoltios y fotografíe con una cámara CCD.

Con el fin de determinar si la profundidad de corte y la estadificación se realizaron correctamente, debe ser evidente que se ha formado un lumen cardíaco maduro entre los dos blastos cardiovasculares de la línea media dorsal para determinar si las membranas celulares están intactas, examinar el lumen cardíaco para detectar la presencia de matriz extracelular y buscar la presencia de Christie y mitocondrias. Así que te acabamos de mostrar cómo determinar la ultra estructura del corazón embrionario de Drosophila. Al realizar este procedimiento.

Es importante recordar que hay que organizar correctamente los embriones de drosophila y medir con precisión los componentes de la resina y mezclarlos bien. Así que gracias por mirar y buena suerte con tu experimento.