Medición de los coeficientes de difusión a través de dos fotones de fluorescencia de recuperación después de photobleaching

La fluorescencia multifotónica. La recuperación después del procedimiento de fotoblanqueo se demuestra fácilmente con una muestra de moléculas de colorante fluorescente que se difunde libremente. En primer lugar, se envía un rayo láser de baja intensidad a la muestra para generar un nivel de referencia de fluorescencia a partir de las moléculas D dentro del volumen focal del láser.

A continuación, se envía un breve destello láser de alta intensidad para fotoblanquear una parte de las moléculas de tinte dentro del volumen focal. Finalmente, el rayo láser se atenúa al nivel de baja intensidad anterior y la fluorescencia se monitorea a medida que las moléculas fotoblanqueadas se difunden hacia afuera y son reemplazadas por moléculas aún fluorescentes desde fuera del volumen focal. La fluorescencia resultante en función de la curva de tiempo se analiza para obtener el coeficiente de difusión.

Hola, soy Kelly Sullivan del Laboratorio de Edward Brown en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Rochester. Hoy le mostraremos cómo realizar la recuperación de fluorescencia de fotones múltiples después del fotoblanqueo. Utilizamos esta técnica en nuestro laboratorio para estudiar la difusión en sistemas biológicos tanto in vitro como in vivo.

Así que comencemos. Para comenzar, configure la longitud de onda láser deseada e inserte el filtro apropiado frente al tubo fotomultiplicador o PMT. A continuación, para evitar daños en la celda pcal, ajuste la potencia del láser a 200 milivatios o menos.

Hay dos espejos orientados en una figura cuatro aguas arriba de la célula pcal. Estos espejos son necesarios y suficientes para alinear el rayo láser a través de la célula pcal. Establezca el desplazamiento de voltaje en el controlador de polarización de la celda pcal a cero, ajuste la trayectoria del láser a través de la celda pcal de modo que el láser esté centrado en las ventanas delantera y trasera.

Use el espejo aguas arriba en la figura cuatro para centrar el haz en la ventana delantera y el espejo aguas abajo en la figura cuatro para centrar el haz en la ventana trasera. Ahora ajuste el voltaje a través del cristal de la celda pcal al valor máximo. El valor apropiado depende de las longitudes de onda y se puede encontrar en el manual de instrucciones de la celda pcal.

Ajuste los espejos en la figura cuatro aguas arriba de la celda pcal hasta que se maximice la potencia de salida de la celda pcal. Ahora cambie el voltaje a través del cristal a cero y ajuste el desplazamiento de voltaje en el controlador de polarización para minimizar la potencia de salida de la celda pcal. Devuelve la potencia del láser incidente en la célula pcal al valor requerido para el experimento.

Ahora, pasando al microscopio, obtenga un buen enfoque visual en una muestra fluorescente estandarizada. Aquí estamos usando granos de polen fluorescentes fijos. Una vez enfocado, selle el microscopio, ajuste la potencia del láser a un nivel apropiado para obtener imágenes de la muestra cambiando el voltaje a través del cristal de la célula PCAL.

Finalmente, apague las luces y encienda el PMT. Inicie un escaneo de imagen repetido de la muestra estandarizada y ajuste los espejos aguas abajo de la celda pcal hasta que se obtenga una imagen nítida de la muestra. Ahora veamos cómo determinar las potencias seguras del monitor en las que se centran las personas dentro de la muestra.

Para el propósito de este video, usaremos una muestra de tinte acuoso sostenido dentro de una depresión en un portaobjetos de vidrio y tapado con un cubreobjetos. Atenúe el láser a una potencia baja pero razonable para generar fluorescencia dentro de la muestra. Selle el microscopio, desvíe la salida del PMT al contador de fotones.

Apague las luces, encienda el PMT y comience un escaneo puntual en el software del microscopio. Configure el contador de fotones para que se integre en una escala de tiempo mucho más larga que el tiempo de recuperación de fluorescencia esperado y registre un número razonable de puntos de datos. Aumente la potencia y tome otra serie de datos de recuento de fotones.

Continúe aumentando la potencia hasta que el aumento en el recuento de fotones parezca disminuir significativamente. Con respecto a la gráfica de aumento de potencia, el logaritmo de fotones cuenta en función del logaritmo de potencia. Cualquier desviación de una pendiente de dos indica blanqueamiento.

Durante el monitor, seleccione una potencia de monitor razonable que esté por debajo de este límite. Ahora vamos a determinar los parámetros de entrada para el escalador multicanal y el generador de pulsos. En el generador de pulsos.

Establezca el tiempo de pre-enseñanza para que sea de una a dos veces mayor que el tiempo de recuperación media esperado y el tiempo de blanqueo para que sea una décima parte del tiempo de recuperación medio esperado en el escalador. Establezca el ancho de la ubicación en aproximadamente la mitad de la duración de la blanqueación y establezca el número de ubicaciones por registro, de modo que el producto del ancho de la ubicación seleccionado y las ubicaciones por registro sea mayor que el tiempo de recuperación total esperado. Además, los tiempos de preble y bleach regresan al generador de pulsos y establecen la frecuencia de la secuencia de preble y bleach igual a un valor ligeramente menor que el inverso del producto del ancho del bin por el número de bins por registro.

Por último, establezca el número de registros por escaneo en el escalador en función de la intensidad de la señal a la potencia del monitor elegida. Ahora configure la potencia del monitor a un nivel seguro y configure la potencia de blanqueo a alrededor de 200 milivatios por encima del límite de blanqueo determinado durante la prueba de blanqueo del monitor. Estas potencias se establecen como voltajes diferentes a través del sello de cristal de la celda al, el microscopio apaga las luces.

Encienda el PMT. Comience un escaneo de puntos en el software de imágenes. A continuación, encienda el generador de pulsos y el escalador.

Para analizar la curva de recuperación resultante, marque tres puntos importantes. La fluorescencia preble, la fluorescencia inmediatamente después de la lejía y la fluorescencia al final del conjunto de datos. Utilice los valores de fluorescencia antes e inmediatamente después del blanqueo para estimar mejor el tiempo de recuperación a medias.

Ahora, use las reglas descritas en los pasos anteriores para actualizar los valores de la decoloración previa y comenzar las duraciones de ancho. Tome una nueva curva y continúe ajustando los parámetros hasta que la curva resultante exhiba un fuerte blanqueo y una recuperación suave. Verifique la saturación de excitación trazando el registro del parámetro de profundidad de blanqueo en función del registro de potencia.

Cualquier desviación de una pendiente de dos indica saturación de excitación. Elija un poder blanqueador que produzca un blanqueador fuerte pero que no cause saturación. Finalmente, con los parámetros apropiados determinados, continúe tomando la recuperación de fluorescencia multifotónica después del fotoblanqueo o las curvas MP FP de su muestra de interés.

Ahora mostraremos los resultados representativos de los datos brutos de MP frap en una curva de envoltura de MP F normalizada a la que se le ha ajustado el coeficiente de difusión, los datos brutos de MP F frap presentados, un blanqueo fuerte y una recuperación suave. Con la recuperación completa que se informa de la segunda mitad de los datos para que se ajusten a los datos. Primero normalizamos la recuperación a la fluorescencia preble promedio y luego realizamos un ajuste de cuadrados arrendados no lineales.

Con respecto al modelo adecuado. Ambos conjuntos de datos se tomaron en fluoresceína acuosa y coeficientes de difusión de rendimiento. De acuerdo con la literatura, acabamos de mostrarle cómo realizar una recuperación de fluorescencia multifotónica después de un experimento de fotoblanqueo.

Al realizar este procedimiento, es importante tener cuidado y ajustar los parámetros experimentales, en particular, la duración del blanqueo y los poderes de blanqueo y monitoreo a los límites seguros definidos en el protocolo. Así que gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.