La disección en vivo de Drosophila Los embriones: métodos simplificados para la detección colecciones mutantes tinción con anticuerpos

Aquí vemos el procedimiento para recolectar embriones. Transfiera las moscas de los viales a los tubos de una cámara de recolección de cinco barriles. A continuación, coloque una placa de agrio de uva en la parte superior de la cámara y deje que las moscas pongan huevos durante unas horas.

Cuando los embriones estén en la etapa correcta, transfiéralos del ato de uva a la cinta adhesiva doble con un pincel. Ahora enrolle los embriones fuera de sus kons y alinéelos en un bloque de agar con sus lados ventrales. Arriba, en el centro, vemos un portaobjetos con un rectángulo de cera y un trozo de cinta adhesiva doble En un extremo, invierte la cinta adhesiva doble sobre el bloque con los embriones alineados y tócala con los embriones para transferirlos al portaobjetos.

Ahora estarán con el lado dorsal hacia arriba inmediatamente. Agregue PBS al área del portaobjetos encerrada por el rectángulo de cera para cubrir los embriones. La parte superior muestra una vista lateral de la diapositiva y la parte inferior muestra una vista superior.

Corta una hendidura a lo largo de la membrana del viel con una aguja de disección de vidrio. Pincha los embriones en la región del cerebro, levántalos y muévelos en filas sobre el vidrio. Luego disecciona cada embrión para hacer un filete.

Al final del procedimiento, tendrá un portaobjetos con filas de embriones de filete. Ahora está listo para arreglar. Hola, soy Peter Lee, un póster en el laboratorio Kaizens en la división de biología de Caltech.

Hola, soy Ashley Wright, estudiante de posgrado de Caltech en Kaizens Lab. Soy Kaizen, profesor en Caltech, y mi grupo de investigación trabaja en el desarrollo del sistema nervioso en moscas de la fruta. Hoy te mostraremos un procedimiento para diseccionar embriones de ópalo vivos.

Hemos utilizado estos métodos para buscar ligandos de receptores huérfanos. Hacemos esto mediante el cribado de colecciones de líneas que sobreexpresan proteínas de la superficie celular mediante tinción viva de embriones con proteínas de fusión de receptores. También utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar fenotipos embrionarios y realizar cribados genéticos.

He realizado un cribado de carencias de actos motores en fenotipos de orientación. Así que comencemos. Pedro te va a mostrar cómo se hace.

Para empezar, utiliza una espátula para colocar una mancha de pasta de levadura en una placa de recogida de huevos de uva agrícola correspondiente a cada una de las barricas de una cámara de recogida de embriones. A continuación, inyecte gas de dióxido de carbono en los viales para moscas para dormirlas. Transfiera unos pocos cientos de moscas directamente a la cámara de recolección.

Luego, cubra la cámara con la placa de recolección de huevos y presione hacia abajo con una tira de cinta de etiquetado de 20 pulgadas de largo, ate la cámara y la placa juntas comenzando desde el centro de la placa de agar. La cinta se superpondrá en la placa de recolección de huevos. Después de que las moscas se despierten, incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante dos o tres horas en posición horizontal después de la incubación, golpee las moscas hacia abajo y vuelva a colocar la placa de recolección.

Si hay menos de 100 embriones en cada sector de la placa extraída. Continúe realizando recolecciones de dos horas hasta que se hayan recolectado suficientes embriones. Los embriones recolectados se pueden agrupar de acuerdo con las especificaciones del protocolo escrito adjunto.

Para envejecer los embriones, coloque un trozo húmedo de papel de filtro circular de 90 milímetros en la tapa de una placa de Petri y coloque la placa de recolección con los embriones boca abajo sobre ella. Intercine la placa durante el tiempo deseado y a la temperatura deseada, prepare un portaobjetos para la estadificación y clasificación de los embriones colocando cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos. A continuación, coloque una losa rectangular de agar uva en el portaobjetos S.

El huevo debe ser lo suficientemente grande como para contener de cinco a 10 filas de 10 a 15 embriones. Una vez que los embriones hayan alcanzado la etapa deseada, retírelos de la incubadora. Transfiera los embriones envejecidos de la placa de recolección a la cinta adhesiva de doble cara.

Con un pincel húmedo, esparce los embriones de manera uniforme por la cinta. Bajo un microscopio de disección de GFP, los embriones SOAR para la expresión adecuada de GFP, lo que indica el genotipo. En este experimento, el genotipado se realiza seleccionando embriones que carecen de expresión del brazo rizado equilibrador, GFP.

Dado que el genotipado de embriones variará según el equilibrador utilizado, consulte el protocolo escrito adjunto para obtener más información sobre cómo realizarlo. Paso. A continuación, con una aguja de disección desafilada, cubra los embriones enrollándolos suavemente sobre la cinta adhesiva de doble cara. En la etapa 16, el intestino se ha dividido en tres bandas.

Después de esto, el intestino comienza a desarrollar bandas diagonales cerca de la cola y luego se enrolla y el embrión se vuelve más claro. A continuación, utilice la aguja de disección para hacer rodar cada embrión sobre el corion u otros embriones. Evitando el contacto con la cinta, levante el embrión y transfiéralo a la losa de agar uva.

Alinee los embriones recubiertos en esta losa con sus lados dorsales contra la losa de agar y los extremos posteriores hacia abajo. A continuación, coloque el portaobjetos en una placa de Petri con papel de filtro húmedo e incube los embriones a temperatura ambiente hasta que alcancen la edad deseada Para la disección, prepare un portaobjetos para la disección en vivo cortando un pequeño trozo rectangular de cinta adhesiva de doble cara. Coloque la cinta cerca de un extremo de un deslizamiento super frost plus con un bolígrafo de cera.

Dibuja un rectángulo del ancho de la diapositiva y de 30 a 40 milímetros de largo alrededor de la cinta. Debe haber aproximadamente tres milímetros de espacio entre la cera y la cinta. A continuación, transfiera los embriones de la gran losa de placa a la cinta invirtiendo el portaobjetos y bajándolo suavemente sobre los embriones alineados para que la cinta entre en contacto con ellos.

Los embriones deben estar orientados con los extremos posteriores hacia abajo. Después de la transferencia, los embriones se colocarán con el lado dorsal hacia arriba en el portaobjetos, inmediatamente agregue un XPBS sobre los embriones para llenar el rectángulo de cera con una aguja de disección de vidrio, que se hace en un tirador de agujas como una aguja de inyección. Corte a lo largo de la línea media dorsal comenzando desde el extremo posterior del embrión.

Ahora pincha el extremo anterior del embrión y levántalo. Empezando por la parte inferior, transfiere el embrión a la derecha de la tira de cinta, manteniéndolo en el tampón. Continúe diseccionando y transfiriendo embriones, haciendo una fila ordenada de embriones en el portaobjetos que coincida con cada fila en la losa agrícola.

Con la aguja de disección, empuje suavemente hacia abajo las solapas de la pared del cuerpo sobre el portaobjetos. Evitando estirar o remover material de su superficie. La aguja solo debe entrar en contacto con las esquinas anterior y posterior en los bordes dorsales de la pared del cuerpo.

Ya que los axones motores no se extienden tan lejos. Dorsalmente, evite tocar las agujas del portaobjetos, ya que se romperá después de que todos los embriones hayan sido transferidos y adheridos al portaobjetos. Extrae el intestino de cada embrión separando los cuatro intestinos del área del cerebro y separando todo el intestino del embrión.

Desplaza la tripa trasera hacia el tobogán. Una vez que se hayan completado todas las disecciones, use dos pipetas pasadas para administrar simultáneamente formaldehído a temperatura ambiente, 5% a una esquina de la cera, rectángulo y retire la solución de la esquina opuesta. Cambie la solución fijadora tres veces utilizando un volumen total de unos seis mililitros.

Incubar los embriones en la solución fijadora durante 45 minutos. Es muy importante no permitir que el menisco entre en contacto con los embriones, ya que esto los destruirá. Utilice un paso de la pipeta para eliminar la mayor parte de la solución fijadora.

Lavar con PB S3 veces utilizando el método de pipetas de dos pastos. A continuación, lavar con PBT tres veces para permear los embriones. Este paso también hace que los embriones sean menos sensibles al menisco.

Después del lavado final, retire con cuidado el PBT inclinando el portaobjetos y toque brevemente una toallita Kim en la esquina del área encerrada por la cera para eliminar el exceso de solución. Con un pipete precargado, agregue inmediatamente 200 microlitros de bloque de solución de bloqueo durante 10 a 30 minutos. A temperatura ambiente, retire la solución de bloqueo con una toallita Kim Wipe.

A continuación, añada inmediatamente 200 microlitros del anticuerpo primario deseado diluido en una solución bloqueante. Coloque el portaobjetos en una placa humidificada e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. En este experimento, el anticuerpo monoclonal 1D 4 se utiliza para marcar los axones motores.

Al día siguiente, retire los platos a cuatro grados centígrados y lave los embriones tres veces en una plataforma mecedora con PBT durante al menos 15 minutos por lavado. Para todos los pasos de lavado, asegúrese de que haya suficiente PBT para sumergir completamente la corredera durante el balanceo. Después de lavar los embriones, bloquee el portaobjetos como antes.

Después de bloquear, agregue inmediatamente 200 microlitros de anticuerpo secundario y solución de bloqueo e incube dos horas a temperatura ambiente, aquí un Alexa 4 88 se vuelve anti-US. Secondary se utiliza junto con Rodine Phin para etiquetar las fibras musculares. Nuevamente, lave tres veces con PBT en la plataforma mecedora durante al menos 15 minutos por lavado.

Transfiera los portaobjetos a una bandeja diferente para eliminar el detergente residual. Luego lave dos veces con PBS durante cinco minutos. Retire el portaobjetos de la parcela de PBS la mayor parte del PBS restante del pozo con una toallita química e inmediatamente agregue 500 microlitros de glicerol al 70%.

Dado que el glicerol tiene el mismo índice de refracción que el embrión, realizar este paso hará que la tinción sea más visible, aclare los embriones durante dos horas a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, retira el glicerol con una toallita kim. La eliminación de casi todo el glicerol aplanará los embriones, mientras que la eliminación de menos glicerol dará como resultado una estructura más tridimensional.

Una vez que se haya eliminado el glicerol, colóquelo en una funda número uno. Los embriones están listos para la obtención de imágenes, los embriones disecados y teñidos se pueden visualizar mediante microscopía de inmunofluorescencia. Aquí, un embrión disecado se ha teñido con el anticuerpo 1D 4 que marca el axón motor.

Esta imagen es similar en apariencia a las imágenes más comúnmente vistas en las que se ha utilizado la inmunohistoquímica HRP para la visualización mediante inmunofluorescencia. Es posible obtener imágenes de mayor calidad en las que se ven más claramente los detalles de las ramas de los axones motores. La tinción de Cos con phin marcada con rho domine, que se une a la actina, permite la visualización simultánea de los músculos.

Esto da una imagen más clara de la estratificación y organización del músculo que se puede obtener con la tinción HRP Aquí, los axones 1D cuatro o motores se muestran en verde Fein o el músculo se muestra en rojo. Acabamos de demostrar cómo diseccionar embriones vivos de drosophila a partir de colecciones de líneas mutantes. Al realizar estos procedimientos, es importante comenzar con líneas fáciles como lio, armadillo, GFP, cepas equilibradas y solo hacer unas pocas líneas a la vez.

A medida que te vuelves más experto y rápido con las disecciones, puedes hacer hasta 10 líneas por día y esto te permitirá examinar una colección de 200 o más líneas mutantes en un período de 20 días más o menos. Por lo tanto, este es realmente un procedimiento muy eficiente una vez que se vuelve experto en la ejecución de todos los pasos. Así que eso es todo, y gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.