La disección en vivo de Drosophila Los embriones: métodos simplificados para la detección colecciones mutantes tinción con anticuerpos

Aquí observamos el procedimiento para recolectar embriones. Transfiera las moscas desde los viales a los tubos de una cámara de recolección de cinco barras. Luego coloque una placa de agar de uva encima de la cámara y permita que las moscas depositen huevos durante algunas horas.

Cuando los embriones estén en la etapa adecuada, transfiéralos desde la placa de agar con un pincel al adhesivo de doble cara. Ahora enrolle los embriones fuera de sus quistes y alíneelos sobre un bloque de agar con sus lados ventrales hacia arriba. En el centro, vemos un portaobjetos con un rectángulo de cera y un trozo de cinta adhesiva de doble cara en un extremo. Invierta la cinta de doble cara sobre el bloque con los embriones alineados y colóquela en contacto con los embriones para transferirlos al portaobjetos.

Ahora estarán inmediatamente con el lado dorsal hacia arriba. Añada PBS al área del portaobjetos delimitada por el rectángulo de cera para cubrir los embriones. La imagen superior muestra una vista lateral del portaobjetos y la inferior muestra una vista superior.

Corte una hendidura a lo largo de la membrana vel con una aguja de disección de vidrio. Perfore los embriones en la región cerebral, levántelos y colóquelos en filas sobre el vidrio. A continuación, diseccione cada embrión para obtener un filete.

Al final del procedimiento, tendrá un portaobjetos con filas de embriones de filete. Ahora está listo para fijarlos. Hola, soy Peter Lee, investigador en el laboratorio Kaizens en la división de biología del Caltech.

Hola, soy Ashley Wright, estudiante de posgrado del Caltech en el laboratorio de Kaizen. Soy Kaizen, profesor en el Caltech, y mi grupo de investigación trabaja en el desarrollo del sistema nervioso de las moscas de la fruta. Hoy les mostraremos un procedimiento para diseccionar embriones de ópalo vivos.

Hemos utilizado estos métodos para buscar ligandos de receptores huérfanos. Hacemos esto mediante el cribado de colecciones de líneas que sobreexpresan proteínas de superficie celular mediante tinción en vivo de embriones con proteínas de fusión de receptores. También utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar fenotipos embrionarios y realizar cribados genéticos.

He realizado una pantalla de deficiencia para actos motores en fenotipos de guía. Así que comencemos. Peter te mostrará cómo se hace.

Para comenzar, use una espátula para colocar una gota de pasta de levadura en una placa de recolección de huevos en agar de uva correspondiente a cada uno de los frascos de una cámara de recolección de embriones. A continuación, inyecte gas de dióxido de carbono en los viales de moscas para dormirlas. Transfiera algunas cientos de moscas directamente a la cámara de recolección.

Luego, cubra la cámara con la placa de recolección de huevos y presione hacia abajo. Utilizando una tira de cinta adhesiva para etiquetas de 20 pulgadas de largo, sujete la cámara y la placa juntas comenzando desde el centro de la placa de agar. La cinta se superpondrá sobre la placa de recolección de huevos. Después de que las moscas despierten, incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante dos o tres horas en posición horizontal. Tras la incubación, golpee suavemente para hacer bajar a las moscas y reemplace la placa de recolección.

Si hay menos de 100 embriones en cada sector de la placa retirada, continúe realizando colecciones de dos horas hasta haber recolectado suficientes embriones. Los embriones recolectados pueden agruparse según las especificaciones del protocolo escrito adjunto.

Para envejecer los embriones, coloque un trozo húmedo de papel filtro circular de 90 milímetros en la tapa de una placa de Petri y coloque la placa de recolección con los embriones boca abajo sobre ella. Incube la placa durante la duración deseada y a la temperatura deseada, y prepare un portaobjetos para la clasificación y etapa de los embriones colocando cinta adhesiva de doble cara sobre un portaobjetos. Luego, coloque un bloque rectangular de agar de uva sobre el portaobjetos S.

El portaobjetos debe ser lo suficientemente grande como para contener de cinco a diez filas de 10 a 15 embriones. Una vez que los embriones hayan alcanzado la etapa deseada, retire los embriones del incubador. Transfiera los embriones envejecidos desde la placa de recolección hasta la cinta adhesiva de doble cara.

Con un pincel húmedo, distribuya uniformemente los embriones sobre la cinta. Bajo un microscopio estereoscópico GFP, busque embriones con expresión adecuada de GFP, lo que indica el genotipo. En este experimento, la determinación del genotipo se realiza seleccionando embriones que carecen de expresión del marcador GFP del brazo curvo equilibrador.

Dado que la genotipificación de embriones variará según el equilibrador utilizado, consulte el protocolo escrito adjunto para obtener más información sobre cómo realizar este paso. A continuación, utilizando una aguja de disección romada, cubra los embriones rodándolos suavemente sobre la cinta adhesiva de doble cara. En la etapa 16, el intestino se ha dividido en tres bandas.

Después de esto, el intestino comienza a desarrollar bandas diagonales cerca de la cola, luego se enrolla y el embrión se vuelve más definido. A continuación, use la aguja de disección para girar cada embrión sobre la corion o sobre otros embriones. Evitando el contacto con la cinta, levante el embrión y transfiéralo al bloque de agar de uva.

Alinee los embriones recubiertos sobre esta placa con sus lados dorsales contra la placa de agar y los extremos posteriores orientados hacia abajo. Luego coloque la portaobjetos en una placa de Petri con papel de filtro húmedo e incube los embriones a temperatura ambiente hasta que alcancen la edad deseada. Para la disección, prepare una portaobjetos para disección en vivo cortando un pequeño trozo rectangular de cinta adhesiva de doble cara. Coloque la cinta cerca de uno de los extremos de una portaobjetos super frost plus utilizando un lápiz de cera.

Dibuje un rectángulo del ancho del portaobjetos y de 30 a 40 milímetros de largo alrededor de la cinta. Debe haber aproximadamente tres milímetros de espacio entre la cera y la cinta. Luego, transfiera los embriones desde la placa grande al trozo de cinta invirtiendo el portaobjetos y bajándolo suavemente sobre los embriones alineados, de modo que la cinta entre en contacto con ellos.

Los embriones deben orientarse con los extremos posteriores hacia abajo. Después de la transferencia, coloque los embriones con el lado dorsal hacia arriba sobre el portaobjetos e inmediatamente agregue un XPBS sobre los embriones para llenar el rectángulo de cera utilizando una aguja de disección de vidrio, que se fabrica en un estirador de agujas como una aguja de inyección. Corte a lo largo de la línea media dorsal comenzando desde el extremo posterior del embrión.

Ahora punce el extremo anterior del embrión y levántelo. Comenzando desde la parte inferior, transfiera el embrión hacia la derecha de la tira de cinta, manteniéndolo en el tampón. Continúe diseccionando y transfiriendo embriones, formando una fila ordenada de embriones sobre el portaobjetos que coincida con cada fila en la placa de agar.

Con la aguja de disección, empuje suavemente las solapas de la pared corporal hacia abajo sobre el portaobjetos. Evite estirar o retirar material de su superficie. La aguja solo debe tocar las esquinas anterior y posterior en los bordes dorsales de la pared corporal.

Dado que los axones motores no se extienden hasta aquí dorsalmente, evite tocar las agujas del portaobjetos, ya que se romperán después de que todos los embriones hayan sido transferidos y fijados sobre el portaobjetos. Retire el intestino de cada embrión seccionando los cuatro intestinos desde la región cerebral y tirando de todo el intestino lejos del embrión.

Coloque el intestino posterior sobre el portaobjetos. Una vez finalizadas todas las disecciones, utilice dos pipetas Pasteur para agregar simultáneamente formaldehído al 5 % a temperatura ambiente en una esquina del rectángulo de cera y retirar la solución desde la esquina opuesta. Cambie la solución fijadora tres veces utilizando un volumen total de aproximadamente seis mililitros.

Incube los embriones en la solución fijadora durante 45 minutos. Es muy importante no permitir que el menisco entre en contacto con los embriones, ya que esto los destruiría. Utilice una pipeta Pasteur para eliminar la mayor parte de la solución fijadora.

Lave con PBS 3 veces utilizando el método de las dos pipetas Pasteur. A continuación, lave con PBT tres veces para permeabilizar los embriones. Este paso también hace que los embriones sean menos sensibles al menisco.

Después del último lavado, retire cuidadosamente el PBT inclinando el portaobjetos y tocando brevemente con una toallita Kim en la esquina del área encerrada por la cera para eliminar la solución excesiva. Usando un pipetaman precargado, agregue inmediatamente 200 microlitros de solución bloqueante y bloquee durante 10 a 30 minutos. A temperatura ambiente, retire la solución bloqueante utilizando una toallita Kim.

Luego, agregue inmediatamente 200 microlitros del anticuerpo primario deseado diluido en la solución de bloqueo. Coloque el portaobjetos en una placa humedecida e incube durante la noche a cuatro grados Celsius. En este experimento, se utiliza el anticuerpo monoclonal 1D cuatro para marcar axones motores.

Al día siguiente, retire las placas de cuatro grados Celsius y lave los embriones tres veces en una plataforma oscilante con PBT durante al menos 15 minutos por lavado. En todos los pasos de lavado, asegúrese de que haya suficiente PBT para sumergir completamente la preparación durante la agitación. Después de lavar los embriones, bloquee la preparación como antes.

Después del bloqueo, agregue inmediatamente 200 microlitros de anticuerpo secundario y solución de bloqueo e incube durante dos horas a temperatura ambiente; aquí se utiliza un secundario de Alexa 488 contra US. El secundario se usa junto con Rodine Phin para etiquetar las fibras musculares. Nuevamente, lave tres veces con PBT en la plataforma agitadora durante al menos 15 minutos por lavado.

Transfiera los portaobjetos a una bandeja diferente para eliminar el detergente residual. Luego, lave dos veces con PBS durante cinco minutos. Retire el portaobjeto del PBS y elimine la mayor parte del PBS restante del pocillo con una toallita química, y agregue inmediatamente 500 microlitros de glicerol al 70%.

Dado que el glicerol tiene el mismo índice de refracción que el embrión, realizar este paso hará que la tinción sea más visible; aclare los embriones durante dos horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius. Luego, retire el glicerol con una toallita kim. La eliminación de casi todo el glicerol aplanará los embriones, mientras que retirar menos glicerol dará como resultado una estructura más tridimensional.

Una vez que se haya eliminado el glicerol, coloque un cubreobjetos número uno. Los embriones están listos para la obtención de imágenes; los embriones diseccionados y teñidos pueden visualizarse mediante microscopía de inmunofluorescencia. Aquí, un embrión diseccionado ha sido teñido con el anticuerpo marcador de axones motores 1D cuatro.

Esta imagen es similar en apariencia a las imágenes más comúnmente observadas en las que se ha utilizado inmunohistoquímica con HRP para la visualización mediante inmunofluorescencia. Es posible obtener imágenes de mayor calidad en las que los detalles de las ramas de los axones motores se observan más claramente. La tinción doble con rho dominio marcado con phin, que se une a la actina, permite la visualización simultánea de los músculos.

Esto proporciona una imagen más clara del estratificado y la organización muscular de lo que puede obtenerse con la tinción de HRP. Aquí, los axones motores 1D four se muestran en verde y el músculo Fein se muestra en rojo. Acabamos de demostrar cómo diseccionar embriones vivos de Drosophila a partir de colecciones de líneas mutantes. Cuando realice estos procedimientos, es importante comenzar con líneas sencillas como lio, armadillo, GFP, líneas equilibradas, y realizar solo unas pocas líneas a la vez.

A medida que gane más experiencia y realice las disecciones con mayor rapidez, podrá realizar hasta 10 líneas por día, lo que le permitirá analizar una colección de unas 200 líneas mutantes en un período de unos 20 días. Por lo tanto, este es realmente un procedimiento muy eficiente una vez que domine todos los pasos. Eso es todo; gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.