Sin cristalino en el chip de imagen de las células proporciona una nueva herramienta de alto rendimiento Biología celular y el diagnóstico médico

En este video, se muestra la prueba de concepto de una plataforma de imagen con lista de lentes en un chip denominada Lucas. Lucas es un acrónimo de plataforma de matriz de monitoreo de células con lista de lentes y campo de visión ultra ancho basada en imagen de sombra. A diferencia de los sistemas de imagen convencionales, la plataforma Lucas no requiere objetivos de microscopio ni otros componentes ópticos voluminosos.

Para Lucas, el espécimen de interés se coloca sobre un portaobjetos y se enclava suavemente con un cubreobjetos idéntico. Mediante un lápiz de vacío, la muestra se carga en la región activa del arreglo de sensores optoelectrónicos. Luego, la plataforma de imagen registra las sombras o los hologramas digitales tipo lente de cada célula de interés dentro de su campo de visión.

El procesamiento digital automatizado de estas sombras celulares puede determinar el tipo, el recuento y las posiciones relativas de las células dentro de la solución. El campo de visión puede abarcar hasta 18 centímetros cuadrados con una profundidad de campo de aproximadamente cinco milímetros. Las imágenes de difracción adquiridas luego se procesan digitalmente mediante un algoritmo de decisión desarrollado personalizado para permitir tanto la caracterización como la identificación de células o partículas diana.

Lucas ofrece una plataforma miniaturizada que reduce el costo y aumenta significativamente el rendimiento para experimentos basados en imágenes, haciéndola compatible con tecnologías avanzadas de última generación en microfluídica e investigación biológica. Hola, soy del Laboratorio de Bio y Nanotecnología ROM en el Departamento de Ingeniería Eléctrica de la Universidad de California, Los Ángeles, y yo soy Anthony Erlinger, también del laboratorio de Nanofotónica y Biotecnología. Hoy les mostraremos un procedimiento para imágenes de alto rendimiento y sin lentes de una solución de SA heterogénea, como una muestra de sangre completa.

Este procedimiento en nuestro laboratorio utiliza una técnica de imagen novedosa, que denominamos plataforma de monitoreo de matriz celular de campo ultra ancho basada en imágenes de sombra, a la que llamamos Lucas abreviadamente. Comencemos. Para iniciar el proceso, obtenga tres mililitros de sangre completa y microesferas de poliestireno de diversos diámetros, como cinco, 10 y 20 micrómetros, y déjelas alcanzar la temperatura ambiente durante 30 minutos.

Utilizando una pipeta serológica, agregue dos mililitros de medio líquido RPMI 1640 clásico como diluyente en un tubo estéril de polipropileno de cinco mililitros. Después de un período de sedimentación de 30 minutos, retire 10 microlitros de la muestra de eritrocitos desde el fondo del tubo de recolección de sangre completa y transfiéralos a la solución de RPMI. Agregue un volumen total de 20 microlitros de microesferas de poliestireno a la dilución de eritrocitos en RPMI y agite la solución celular pipeteando suavemente. Transfiera de cinco a 15 microlitros de la solución heterogénea sobre un cubreobjetos utilizando pinzas.

Coloque un segundo cubreobjetos idéntico sobre la solución. La muestra debe quedar uniformemente intercalada entre los dos cubreobjetos. Luego, utilizando un lápiz de vacío, cargue la muestra sobre la región activa del arreglo de sensores para su imagenología.

Luego, prepare el reactivo de tinción acuoso combinando al 0,1 % tampón como SNY y solución diluida de azul de metileno nuevo o NMB en una proporción volumétrica de dos a uno; consulte el protocolo escrito adjunto para obtener detalles sobre la preparación de las soluciones de SNY y azul de metileno puro. A continuación, en un vaso de politetrafluoroetileno, combine el reactivo de tinción ACOA con la muestra de sangre completa en una proporción volumétrica de uno a uno, utilizando una mezcla magnética durante dos minutos. Luego, incube adicionalmente durante 10 minutos a temperatura ambiente después de que la solución se haya incubado con 1,99 mililitros de solución líquida clásica RPMI 1640 en un tubo de politetrafluoroetileno de cinco mililitros.

A continuación, transfiera 10 microlitros de la solución sanguínea teñida al RPMI para obtener una relación de volumen de uno a 200. Luego, vortexee la solución durante 30 segundos y pipetee de 10 a 100 microlitros de la solución celular teñida entre láminas cubreobjetos o dentro de un depósito microfluídico. A continuación, utilizando un lápiz de vacío, coloque la muestra sobre la región activa del arreglo de sensores.

La plataforma Lucas utiliza una matriz de sensores optoelectrónicos para registrar digitalmente hologramas de células sin lente. Con este fin, se emplean dispositivos acoplados cargados, o CCD, a fin de permitir la iluminación con longitud de onda ajustable, un monocromador con una lámpara de xenón junto con una fibra de sílice fundida de grado estándar, que consiste en un haz de fibras y un orificio de aproximadamente 100 micrómetros de diámetro situado a unos cinco a 10 centímetros por encima de la superficie del sensor, lo cual puede utilizarse para la longitud de onda ajustable. La iluminación proporciona una plataforma flexible en la que las firmas holográficas de las células pueden ajustarse finamente y se pueden sintetizar firmas digitales híbridas mediante la combinación de más de una longitud de onda para mejorar la relación señal-ruido y el contraste de la imagen Lucas.

Para una mejor caracterización, se cargan muestras de precisión colocadas entre dos laminillas sobre la región activa del arreglo de sensores, iluminadas uniformemente por la fuente de luz. Los hologramas de difracción de cada célula u objeto microscópico dentro de una solución heterogénea inciden sobre el arreglo de sensores, formando una imagen Lucas. Las imágenes de difracción Lucas adquiridas se procesan mediante un algoritmo de decisión desarrollado personalizado, que utiliza una biblioteca estadística de imágenes de difracción para la caracterización y la identificación automatizadas de células diana u objetos microscópicos.

Esta figura muestra una imagen con objetivo convencional de 40x de una solución heterogénea de microesferas de poliestireno y glóbulos rojos de cinco, 10 y 20 micrómetros. La morfología 3D, el índice de refracción y la complejidad intercomp. de estas partículas son todas diferentes entre sí.

Algunas de estas características pueden distinguirse mediante un microscopio convencional, pero en un campo de visión muy limitado de menos de 0,5 milímetros cuadrados en la plataforma Lucas. Todas estas micropartículas presentan patrones holográficos únicamente diferentes, como una huella dactilar. Por lo tanto, pueden caracterizarse sin ambigüedad alguna en función de sus texturas 2D.

Lucas puede monitorear un campo de visión ultralargo que puede alcanzar un tamaño de 10 a 20 centímetros cuadrados. Órdenes de magnitud mayores que los microscopios estándar basados en lentes. Esta es una imagen con objetivo de 40x de una muestra de sangre completa teñida utilizando la plataforma Lucas.

Las características internas de los glóbulos blancos teñidos varían eficientemente mediante la modificación del índice de refracción y las propiedades de dispersión de los núcleos celulares. El arreglo de sensores registra patrones de difracción distintivos de cada célula individual. Esto muestra otra ventaja de la plataforma Lucas como herramienta potente para citometría y diagnóstico en el punto de atención.

Como plataforma completamente automatizada para la caracterización rápida de células de interés, las imágenes de difracción de Lucas se procesan digitalmente mediante un software de decisión desarrollado a medida. En esta figura, una mezcla heterogénea de glóbulos rojos y microesferas es procesada por la interfaz. El algoritmo es robusto al detectar regiones de alta densidad, así como partículas con baja relación señal-ruido, como las microesferas de tres micrómetros.

Se muestra aquí una imagen procesada en la interfaz personalizada de Lucas. El software permite la entrada de diversas especificaciones, como el tamaño del píxel del sensor o la longitud de onda de la iluminación. Además, se pueden realizar selecciones en la imagen y definir patrones celulares.

La muestra se cuenta en función de estos datos y se muestra al usuario la imagen marcada. Acabamos de mostrarle cómo obtener imágenes y caracterizar células utilizando la plataforma de alto rendimiento de Lucas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que los experimentos demostrados pueden aplicarse a una amplia variedad de células y micropartículas.

También permite la caracterización de células en campo ultra ancho y alto rendimiento de una solución heterogénea. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.