Name: Sin cristalino en el chip de imagen de las células proporciona una nueva herramienta de alto rendimiento Biología celular y el diagnóstico médico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprende la plataforma Lucas para imagen sin lentes de células mediante holografía digital de sombras. Este sistema compacto permite diagnósticos médicos de alto rendimiento en entornos con recursos limitados.

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Aquí hablamos de los procedimientos experimentales que están involucrados en LUCAS [1-3]. Para ilustrar la prueba de concepto de LUCAS vamos a describir el proceso de imágenes para una muestra de sangre entera. A. Imagen Set-up La plataforma LUCAS imágenes muestra ventajas significativas para proporcionar una alternativa rentable y compacto a los actuales puntos de atención médica y la citometría de herramientas de diagnóstico, especialmente para entornos de recursos limitados. En lugar de detectar la imagen de las células, en lugar LUCAS capta hologramas digitales de las células que son creados por la interferencia de la luz dispersada por cada celda con la luz de fondo. El control cuidadoso de la coherencia parcial espacial de la iluminación es fundamental para activar la grabación holográfica. 1. Matriz de sensores digitales La plataforma LUCAS utiliza una serie de sensores optoelectrónicos para grabar digitalmente los hologramas de celdas individuales. Para ello, los dispositivos de carga par (CCD, Modelos de la muestra: KAI-11002, KAF-39000, de Kodak) o complementary metal-oxide-semiconductor chips (CMOS, modelo de la muestra: MT9P031, Micron) se puede utilizar. Tamaño de píxel de la Kodak cargada dispositivos pareja, KAI-11002, KAF-39000, y sensores de imagen CMOS de Micron son de 9 m, m 6,8 y 2,2 micras, con un activo campo de visión de 10 cm2, 18 cm2, mm2 y 24,4, respectivamente. [1-2]. 2. Fuente de luz A diferencia de la mayoría de otras modalidades de imágenes microscópicas, LUCAS no requiere de un láser, por lo que incluso un simple diodo emisor de luz (LED) se puede utilizar para la iluminación. A fin de que la iluminación longitud de onda sintonizable, también podemos utilizar un monocromador con una lámpara de xenón (Cornerstone T260, Newport Corp.), junto con una fibra de sílice fundido de calidad estándar, que consiste en un haz de fibras (77.564, Newport) y orificio de ~ 100 m de diámetro situado en ~ 5-10 cm por encima de la superficie del sensor. Esta configuración de longitud de onda sintonizable iluminación ofrece una plataforma flexible, donde las firmas holográficas de las células puede ser ajustado, híbridos y firmas digitales pueden ser sintetizados para mejorar la relación señal-ruido para una precisión mejor caracterización y la especificidad. [3] B. Preparación de muestras y de imagen Una prueba de concepto de LUCAS basada en el chip de imagen se demostrará mediante una solución heterogénea como se describe a continuación. Un protocolo similar se podría aplicar a diferentes tipos de células [1-3]. 1. Dilución de la sangre total y la preparación de la solución heterogénea <ol><li> Para comenzar el proceso, obtener una muestra de sangre entera y microesferas de poliestireno de distintos diámetros (m 5, 10 y 20. Duque Científica), y llevar a todos a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 2 ml de RPMI 1640 los medios líquidos clásicos (Fisher Scientific) como diluyente en un tubo de polipropileno estériles de 5 ml. </li><li> Después de incubar la muestra de sangre entera durante 30 minutos, pipetas hasta 10 l de la muestra de eritrocitos sedimentados y la transferencia en la solución de RPMI. </li><li> Añadir un volumen total de 20 microesferas de poliestireno l en los eritrocitos de dilución RPMI, y agitar la solución de células pipeteando con suavidad o mediante el uso de un agitador magnético con una barra agitadora. </li><li> Colocar un volumen total de 15.5 l solución heterogénea en una hoja de cubierta y colocar una hoja de segundo, la cobertura idéntica a la solución mediante el uso de fórceps. La muestra debe ser colocada entre los dos cubreobjetos de manera uniforme. </li><li> Luego, utilizando un lápiz de vacío (NT57-636, Edmund Optics) carga la muestra en la región activa de la matriz de sensores de imagen. </li></ol> 2. Manchas de sangre entera <ol><li> Empezando con la preparación de una mezcla de 0,1% tamponado eosina y solución diluida de metileno nuevo mediante el uso de energía tipo puro Eosina Y (MW = 691,85, Acros Organics), libre de zinc puro Nuevo azul de metileno colorante (MW = 347,90, Acros Organics), y monohidrato de oxalato de potasio (99,0% de ACS reactivo, Acros Organics), cada solución se purifica con un tamaño de 0,45 micras de poro Syringless filtro (Whatman) para soluciones acuosas de tinción de células blancas en la sangre. </li><li> Luego, revuelva suavemente un reactivo disuelto manchas acuosas con la muestra de sangre entera en una proporción de volumen de 1:1 en un vaso de polipropileno mediante el uso de un agitador magnético durante 2 minutos y se incuba durante 10 minutos. </li><li> Transferencia de una solución manchadas de sangre de 50 L en un tubo de polipropileno de 5 ml y diluir con solución de RPMI 1640 classic líquido (Fisher Scientific) de 1,95 ml para adquirir una proporción de volumen de 1:200. Entonces, el vórtice de dilución durante 30 segundos. Una tasa de dilución diferentes también pueden ser introducidos en esta etapa. </li><li> Pipeta una solución células teñidas de 10-100 l entre cubreobjetos o dentro de un yacimiento de microfluidos. Luego, utilizando un lápiz de vacío (NT57-636, Edmund Optics), colocar la muestra en la región activa de la matriz de sensores. </li></ol> Los resultados representativos ve_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: LUCAS permite un recuento preciso y la diferenciación de las células digitales y objetos de micro-basados ​​en sus firmas holográficas 2D sin necesidad de utilizar las lentes, láseres y otros componentes ópticos voluminosos. Características de las diversas firmas LUCAS micro-objetos se muestran en esta figura y se comparan con una imagen de microscopio convencional obtenida con una lente objetivo de 40X. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1650/1650Fig1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: (izquierda) la imagen en bruto, de una mezcla heterogénea que contiene glóbulos rojos, 10um, 5 um y 3 partículas um. (Derecho) totalmente automatizado resultados de la caracterización LUCAS para el mismo campo de visión se muestran. Tenga en cuenta que el algoritmo de decisión es sólido en la caracterización de las regiones de alta densidad, así como partículas con baja señal a ruido, tales como las cuentas de 3 um. <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: La interfaz personalizada LUCAS se ilustra. Java permite el software basado en LUCAS insumos para diversas condiciones experimentales, tales como el tamaño en píxeles del sensor o la longitud de onda de la luz. La selección de un campo específico de vista sobre la imagen también se pueden hacer y los patrones de la célula diana puede ser definido por el usuario para crear una biblioteca de células sombra estadística. La adquisición de imágenes LUCAS puede ser caracterizado sobre la base de datos de este entrenamiento (es decir, la biblioteca de la sombra de células) y el marcado (contado) la imagen se muestra al usuario. Estadísticas de los resultados del conteo también se almacenan como un archivo XML para su posterior análisis.

<ol><li>Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Lensfree+Holographic+Imaging+for+On-Chip+Cytometry+and+Diagnostics%22%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">"Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics".</a> Lab Chip. , (2009).</li>
<li>Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22High-throughput+Imaging+and+Characterization+of+a+Heterogeneous+Cell+Solution+on+a+Chip%22+%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">"High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" .</a> Biotechnology and Bioengineering. , (2008).</li>
<li>Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Multi-color+LUCAS%3A+Lensfree+on-chip+cytometry+using+tunable+monochromatic+illumination+and+digital+noise+reduction%22%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">"Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction".</a> Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).</li>
</ol>

Hemos ilustrado que la plataforma LUCAS precisión puede contar e identificar los diversos micro-objects/cells en un chip basado en su firma holográfica, y proporciona una herramienta prometedora para el diagnóstico de los puntos de atención médica y de alto rendimiento de la biología celular. Con el fin de procesar con precisión los patrones holográficos registrados, hemos implementado un software desarrollado a medida LUCAS decisión. Este algoritmo, que utiliza una base de datos de difracción de la imagen estadística c...

<table><tbody><tr><td>Dispositivo de carga acoplada (CCD)</td><td>KODAK</td><td>KAI-11002</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de carga acoplada (CCD)</td><td>KODAK</td><td>KAF-39000</td><td></td></tr><tr><td>Semiconductor complementario de óxido metálico (CMOS)</td><td>Micron</td><td>MT9P031</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de xenón</td><td>Newport Corp.</td><td>Cornerstone T260</td><td></td></tr><tr><td>Pluma de vacío</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT57-636</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas de 5, 10 y 20 &amp;mu;m</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4000 Series</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>1640</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y pura</td><td>Acros Organics</td><td>MW=691.85</td><td></td></tr><tr><td>Tinte Azul de Metileno Nuevo (NMB)</td><td>Acros Organics</td><td>MW=347.90</td><td></td></tr><tr><td>Oxalato de potasio monohidratado</td><td>Acros Organics</td><td>99,0 % Reagente ACS</td><td></td></tr></tbody></table>

sin cristalino en el chip de imagen de las células proporciona una nueva herramienta de alto rendimiento biología celular y el diagnóstico médico

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Los microscopios ópticos convencionales celdas de imagen mediante el uso de lentes del objetivo que trabajan en conjunto con otros objetivos y componentes ópticos. Aunque muy eficaz, este enfoque clásico tiene ciertas limitaciones de la miniaturización de la plataforma de imágenes para que sea compatible con el avanzado estado de la técnica de microfluidos. En este informe, presentamos los detalles del experimento de un concepto de imagen sin cristalino en un chip llamado LUCAS (<strong<em&gt; L</em</strong&gt; Ensless<strong<em&gt; U</em</strong&gt; ARLT en todo el campo de visión<strong<em&gt; C</em</strong&gt; Ell control<strong<em&gt; A</em</strong&gt; Rray plataforma basada en<strong<em&gt; S</em</strong&gt; Hadow imagen) que no requiere de objetivos de microscopio o de otros componentes ópticos voluminosos a la imagen de una solución de células heterogéneas sobre un campo ultra amplio de visión que puede abarcar tan grande como 18 cm ~<sup&gt; 2</sup&gt;. Además, a diferencia de los microscopios convencionales, LUCAS puede imaginar una solución de células heterogéneas de interés en una profundidad de campo de ~ 5 mm sin la necesidad de reorientar lo que corresponde a un máximo de ~ 9 ml volumen de la muestra. Esta plataforma de imágenes registros de las sombras (es decir, sin lentes hologramas digitales) de cada célula de interés dentro de su campo de visión, y el procesamiento digital automatizada de estas sombras de células puede determinar el tipo, el número y las posiciones relativas de las células dentro de la solución. Ya que no requiere ningún componente voluminoso ópticas o mecánicas etapas de exploración que ofrece una plataforma significativa en miniatura que al mismo tiempo reduce el costo, lo cual es muy importante para todo punto de atención herramientas de diagnóstico. Por otra parte, el rendimiento de imagen de esta plataforma es varios órdenes de magnitud mejor que los microscopios ópticos convencionales, lo que podría ser muy valiosa de alto rendimiento para la biología celular de experimentos.

Lensfree en el chip de imagen y caracterización de las células se ilustra. Este enfoque de células en el chip de imagen proporciona una herramienta compacta y rentable para el diagnóstico médico y de alto rendimiento de aplicaciones de la biología celular, por lo que es especialmente adecuado para entornos de escasos recursos.

Sin cristalino en el chip de imagen de las células proporciona una nueva herramienta de alto rendimiento Biología celular y el diagnóstico médico

Los microscopios ópticos convencionales obtienen imágenes de las células mediante el uso de objetivos que funcionan conjuntamente con otras lentes y componentes ópticos. Si bien son bastante...

En este video, se muestra la prueba de concepto de una plataforma de imagen con lista de lentes en un chip denominada Lucas. Lucas es un acrónimo de plataforma de matriz de monitoreo de células con lista de lentes y campo de visión ultra ancho basada en imagen de sombra. A diferencia de los sistemas de imagen convencionales, la plataforma Lucas no requiere objetivos de microscopio ni otros componentes ópticos voluminosos.Para Lucas, el espécimen de interés se coloca sobre un portaobjetos y se enclava suavemente con un cubreobjetos idéntico. Mediante un lápiz de vacío, la muestra se carga en la región activa del arreglo de sensores optoelectrónicos. Luego, la plataforma de imagen registra las sombras o los hologramas digitales tipo lente de cada célula de interés dentro de su campo de visión.El procesamiento digital automatizado de estas sombras celulares puede determinar el tipo, el recuento y las posiciones relativas de las células dentro de la solución. El campo de visión puede abarcar hasta 18 centímetros cuadrados con una profundidad de campo de aproximadamente cinco milímetros. Las imágenes de difracción adquiridas luego se procesan digitalmente mediante un algoritmo de decisión desarrollado personalizado para permitir tanto la caracterización como la identificación de células o partículas diana.Lucas ofrece una plataforma miniaturizada que reduce el costo y aumenta significativamente el rendimiento para experimentos basados en imágenes, haciéndola compatible con tecnologías avanzadas de última generación en microfluídica e investigación biológica. Hola, soy del Laboratorio de Bio y Nanotecnología ROM en el Departamento de Ingeniería Eléctrica de la Universidad de California, Los Ángeles, y yo soy Anthony Erlinger, también del laboratorio de Nanofotónica y Biotecnología. Hoy les mostraremos un procedimiento para imágenes de alto rendimiento y sin lentes de una solución de SA heterogénea, como una muestra de sangre completa.Este procedimiento en nuestro laboratorio utiliza una técnica de imagen novedosa, que denominamos plataforma de monitoreo de matriz celular de campo ultra ancho basada en imágenes de sombra, a la que llamamos Lucas abreviadamente. Comencemos. Para iniciar el proceso, obtenga tres mililitros de sangre completa y microesferas de poliestireno de diversos diámetros, como cinco, 10 y 20 micrómetros, y déjelas alcanzar la temperatura ambiente durante 30 minutos.Utilizando una pipeta serológica, agregue dos mililitros de medio líquido RPMI 1640 clásico como diluyente en un tubo estéril de polipropileno de cinco mililitros. Después de un período de sedimentación de 30 minutos, retire 10 microlitros de la muestra de eritrocitos desde el fondo del tubo de recolección de sangre completa y transfiéralos a la solución de RPMI. Agregue un volumen total de 20 microlitros de microesferas de poliestireno a la dilución de eritrocitos en RPMI y agite la solución celular pipeteando suavemente. Transfiera de cinco a 15 microlitros de la solución heterogénea sobre un cubreobjetos utilizando pinzas.Coloque un segundo cubreobjetos idéntico sobre la solución. La muestra debe quedar uniformemente intercalada entre los dos cubreobjetos. Luego, utilizando un lápiz de vacío, cargue la muestra sobre la región activa del arreglo de sensores para su imagenología.Luego, prepare el reactivo de tinción acuoso combinando al 0,1 % tampón como SNY y solución diluida de azul de metileno nuevo o NMB en una proporción volumétrica de dos a uno; consulte el protocolo escrito adjunto para obtener detalles sobre la preparación de las soluciones de SNY y azul de metileno puro. A continuación, en un vaso de politetrafluoroetileno, combine el reactivo de tinción ACOA con la muestra de sangre completa en una proporción volumétrica de uno a uno, utilizando una mezcla magnética durante dos minutos. Luego, incube adicionalmente durante 10 minutos a temperatura ambiente después de que la solución se haya incubado con 1,99 mililitros de solución líquida clásica RPMI 1640 en un tubo de politetrafluoroetileno de cinco mililitros.A continuación, transfiera 10 microlitros de la solución sanguínea teñida al RPMI para obtener una relación de volumen de uno a 200. Luego, vortexee la solución durante 30 segundos y pipetee de 10 a 100 microlitros de la solución celular teñida entre láminas cubreobjetos o dentro de un depósito microfluídico. A continuación, utilizando un lápiz de vacío, coloque la muestra sobre la región activa del arreglo de sensores.La plataforma Lucas utiliza una matriz de sensores optoelectrónicos para registrar digitalmente hologramas de células sin lente. Con este fin, se emplean dispositivos acoplados cargados, o CCD, a fin de permitir la iluminación con longitud de onda ajustable, un monocromador con una lámpara de xenón junto con una fibra de sílice fundida de grado estándar, que consiste en un haz de fibras y un orificio de aproximadamente 100 micrómetros de diámetro situado a unos cinco a 10 centímetros por encima de la superficie del sensor, lo cual puede utilizarse para la longitud de onda ajustable. La iluminación proporciona una plataforma flexible en la que las firmas holográficas de las células pueden ajustarse finamente y se pueden sintetizar firmas digitales híbridas mediante la combinación de más de una longitud de onda para mejorar la relación señal-ruido y el contraste de la imagen Lucas.Para una mejor caracterización, se cargan muestras de precisión colocadas entre dos laminillas sobre la región activa del arreglo de sensores, iluminadas uniformemente por la fuente de luz. Los hologramas de difracción de cada célula u objeto microscópico dentro de una solución heterogénea inciden sobre el arreglo de sensores, formando una imagen Lucas. Las imágenes de difracción Lucas adquiridas se procesan mediante un algoritmo de decisión desarrollado personalizado, que utiliza una biblioteca estadística de imágenes de difracción para la caracterización y la identificación automatizadas de células diana u objetos microscópicos.Esta figura muestra una imagen con objetivo convencional de 40x de una solución heterogénea de microesferas de poliestireno y glóbulos rojos de cinco, 10 y 20 micrómetros. La morfología 3D, el índice de refracción y la complejidad intercomp. de estas partículas son todas diferentes entre sí.Algunas de estas características pueden distinguirse mediante un microscopio convencional, pero en un campo de visión muy limitado de menos de 0,5 milímetros cuadrados en la plataforma Lucas. Todas estas micropartículas presentan patrones holográficos únicamente diferentes, como una huella dactilar. Por lo tanto, pueden caracterizarse sin ambigüedad alguna en función de sus texturas 2D.Lucas puede monitorear un campo de visión ultralargo que puede alcanzar un tamaño de 10 a 20 centímetros cuadrados. Órdenes de magnitud mayores que los microscopios estándar basados en lentes. Esta es una imagen con objetivo de 40x de una muestra de sangre completa teñida utilizando la plataforma Lucas.Las características internas de los glóbulos blancos teñidos varían eficientemente mediante la modificación del índice de refracción y las propiedades de dispersión de los núcleos celulares. El arreglo de sensores registra patrones de difracción distintivos de cada célula individual. Esto muestra otra ventaja de la plataforma Lucas como herramienta potente para citometría y diagnóstico en el punto de atención.Como plataforma completamente automatizada para la caracterización rápida de células de interés, las imágenes de difracción de Lucas se procesan digitalmente mediante un software de decisión desarrollado a medida. En esta figura, una mezcla heterogénea de glóbulos rojos y microesferas es procesada por la interfaz. El algoritmo es robusto al detectar regiones de alta densidad, así como partículas con baja relación señal-ruido, como las microesferas de tres micrómetros.Se muestra aquí una imagen procesada en la interfaz personalizada de Lucas. El software permite la entrada de diversas especificaciones, como el tamaño del píxel del sensor o la longitud de onda de la iluminación. Además, se pueden realizar selecciones en la imagen y definir patrones celulares.La muestra se cuenta en función de estos datos y se muestra al usuario la imagen marcada. Acabamos de mostrarle cómo obtener imágenes y caracterizar células utilizando la plataforma de alto rendimiento de Lucas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que los experimentos demostrados pueden aplicarse a una amplia variedad de células y micropartículas.También permite la caracterización de células en campo ultra ancho y alto rendimiento de una solución heterogénea. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

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