Automatizada de sangre de microfluidos Protocolo de lisis para el Enriquecimiento de la circulación las células nucleadas

Para enriquecer células nucleadas circulantes a partir de sangre. Primero se ceba el dispositivo microfluídico con un XPBS para eliminar burbujas, luego se hace pasar agua desionizada y 2% de paraldehído en dos XPBS a través del dispositivo mediante bombas de jeringa antes de cargar la muestra de sangre. A continuación, se procesa la sangre a través del dispositivo microfluídico y, tras el procesamiento de la muestra, se incluye la centrifugación y la eliminación del sobrenadante.

Finalmente, la muestra se analiza mediante citometría de flujo para producir gráficos de fax. Hola, soy William White del laboratorio de Biotecnología a Microescala del Departamento de Bioingeniería de la Universidad de Wool. Hoy les mostraremos un procedimiento para el enriquecimiento de células nucleadas circulantes mediante la lisis de sangre completa a través de microfluídica.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la inflamación en diversos procesos patológicos, asegurando así el enriquecimiento de leucocitos y otras células nucleadas circulantes sin pérdida ni activación. Comencemos. Para iniciar este procedimiento, inserte firmemente el tubo de acceso con un diámetro ligeramente mayor que los orificios de acceso del canal en las entradas y salidas.

Luego, para proporcionar la interfaz de macro a micro, conecte una aguja de jeringa de calibre 30 al tubo en cada uno de los inyectores. A continuación, llene una jeringa de un mililitro con un XPBS asegurándose de eliminar las burbujas. Conecte la jeringa al inyector uno y empuje suavemente la jeringa manualmente hasta que el XPBS fluya por el inyector dos.

Luego, sujete inmediatamente la entrada dos con una pinza de oficina. Continúe empujando la jeringa hasta que una solución XPBS alcance el puerto de salida del dispositivo microfluídico. Una vez que la solución salga por la salida, sujete el tubo de salida con otra pinza de oficina.

Continúe empujando aún más la jeringa de un mililitro hasta que un XPBS salga por la entrada tres y sujete el puerto de la entrada tres con una tercera pinza de oficina. El dispositivo microfluídico ya está completamente cebado. Comience a calibrar las bombas de jeringa con la bomba de jeringa Harvard grande, configurando el diámetro en 22,5 milímetros y la velocidad de flujo en 600 microlitros por minuto.

Para la pequeña bomba de jeringa Harvard, configure el diámetro en 4,61 milímetros y la velocidad de flujo en 20 microlitros por minuto. A continuación, llene una jeringa de 30 mililitros con agua desionizada extrayendo una solución directamente del tubo cónico de 50 mililitros.

Recuerde etiquetar la jeringa, llene otra jeringa de 30 mililitros con dos XPBS solución de paraformaldehído al 2%. Nuevamente, retire directamente de un tubo cónico y etiquete la jeringa. Ahora conecte la jeringa que contiene agua a la entrada dos y la jeringa de paraformaldehído al 2% en dos XPBS a la entrada tres, asegurándose de que no queden burbujas atrapadas en el tubo ni en el dispositivo microfluídico.

Luego retire las pinzas de la entrada dos, la entrada tres y el tubo de salida con las tres jeringas conectadas. Proceda a colocar las dos jeringas grandes juntas en la bomba de jeringa Harvard grande y coloque la jeringa de un mililitro en la bomba de jeringa Harvard pequeña. Coloque el tubo de salida en un tubo cónico de 50 mililitros para la recolección de desechos.

Ahora encienda la bomba de jeringa Harvard grande que sostiene las jeringas de 30 mililitros y déjela funcionar durante un minuto. Verifique que no haya burbujas ni fugas en el dispositivo ni en los tubos. Luego encienda la bomba de jeringa Harvard pequeña y déjela funcionar durante un minuto adicional también.

Verificación de burbujas y fugas. Detenga las bombas después de dos minutos. Dado que el dispositivo microfluídico ya está listo para usarse con muestras de sangre, las muestras de sangre que se analizarán se recogieron según se describe en el protocolo escrito adjunto y se utilizan dentro de una hora después de su recolección.

Se descarta el primer tubo de sangre recogida para eliminar resultados falsos positivos. Retire la jeringa de un mililitro de la bomba de jeringa pequeña de Harvard, luego inyecte un XPBS desde la jeringa de un mililitro llenando la aguja de la jeringa. Para evitar la introducción de burbujas, llene una jeringa de un mililitro con 50 microlitros de un XPBS sin atrapar burbujas.

Luego, llene la jeringa con 0,5 mililitros de sangre. Mantenga la jeringa en posición vertical durante el llenado para evitar la mezcla del PBS con la sangre. A continuación, conecte la jeringa que contiene la sangre nuevamente a la entrada uno.

Elimine cualquier exceso de líquido y monte la jeringa verticalmente en la pequeña bomba de jeringa Harvard. Tenga cuidado de no empujar la sangre a través del tubo hacia el dispositivo. Retire el tubo de salida del tubo de desecho y colóquelo en un tubo cónico limpio de 50 mililitros colocado en un recipiente con hielo.

Ahora encienda primero el interruptor de funcionamiento en la bomba de jeringa Harvard grande y déjela funcionar durante un minuto. Luego encienda la bomba de jeringa Harvard pequeña. La muestra comenzará a recolectarse desde el tubo de salida hacia el tubo centrífugo de 50 mililitros.

Deje que la muestra de sangre en la jeringa de un mililitro recorra completamente el dispositivo, lo que tarda aproximadamente 20 minutos. Luego detenga ambas bombas. Ahora que la corrida ha finalizado, centrifugue la muestra recolectada durante cinco minutos a 350 veces G a temperatura ambiente con el freno desactivado.

Elimine el sobrenadante colocando la punta de la pipeta en el lado opuesto al pellet blanco. Retire tanto sobrenadante como sea posible, especialmente los restos de células rojas, sin perturbar el pellet blanco. Reuspenda la muestra en un mililitro de tampón de flujo que contenga 1% de BSA y 2% de paraformaldehído en un XPBS mediante pipeteo.

Arriba y abajo, transfiera la muestra a un tubo microcentrífugo tipo eppendorf de 1,5 mililitros y centrifugue la muestra recolectada durante cinco minutos a cuatro veces g. A temperatura ambiente, retire el sobrenadante con la mayor precaución posible, tal como en el paso anterior de centrifugación. Finalmente, agregue un mililitro de tampón de flujo y vortexee para resuspender la muestra, y proceda a analizarla mediante citometría de flujo.

Ahora mostraremos algunos resultados representativos en forma de gráficos de fax de una muestra de sangre enriquecida mediante el dispositivo microfluídico, con análisis utilizando citometría de flujo. La importancia del enriquecimiento mediante lisis se puede observar en un gráfico de fax donde las células rojas de la sangre aparecen como una nube. El diagrama de dispersión producido por el protocolo de enriquecimiento microfluídico es un gráfico limpio con poblaciones definidas de células nucleadas presentes en circulación.

La región roja representa linfocitos, la verde representa monocitos, la azul representa granulocitos, y la región púrpura aún no ha sido caracterizada. La falta de eliminación de los restos de glóbulos rojos en el protocolo produce un grupo de eventos en el gráfico de fax que se observa en la región cian. Las poblaciones de células pueden visualizarse en gráficos de fax separados.

Los linfocitos se mantienen con CD tres y CD cuatro. Los monocitos se mantienen con CD 14 y los granulocitos se mantienen con CD 66 P. Acabamos de mostrarle cómo preparar y ejecutar una muestra de sangre con el dispositivo microfluídico de lisis sanguínea. Al realizar este procedimiento, es importante recordar ejecutar la muestra de sangre inmediatamente para evitar que la PBS se mezcle con la sangre antes de entrar en el dispositivo y para evitar la introducción de burbujas en los canales del dispositivo.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.