Name: Una sola célula grabaciones de succión de los conos del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-05T20:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 35 s
Description: Aprende a registrar respuestas de fotoreceptores cónicos individuales en ratón mediante electrodo de succión. Este método de electrofisiología permite estudiar la fisiología celular y las propiedades de adaptación de los conos en neurociencia visual.

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Apoyado por el Premio de Desarrollo Profesional de Investigación para Prevención de la Ceguera, NIH EY 019312, y subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera y EY 02687 (Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales en la Universidad de Washington).

Hacer electrodos <ol><li> Hacer los electrodos de registro utilizando un extractor de micropipeta y pulir los electrodos con filamento de calefacción bajo el microscopio. Para la grabación del ratón cono de succión de una sola célula, el diámetro interior en la punta del electrodo es de unos 6.7 micras. </li><li> Preparar electrodos de referencia. Pesar 1% de agar en agua destilada. Derretir la solución de agar en un baño de agua caliente. Llenar las pipetas de vidrio (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) con 1% de agar con una jeringa. Solidificar el agar a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Cortar las pipetas en dos mitades con un cuchillo de diamante. </li><li> Sumerja los electrodos de referencia en la solución de referencia por lo menos 24 horas a 4 ° C. </li></ol> Configuración del experimento <ol start="5"><li> Dark adaptar un ratón en una jaula de negro durante la noche. </li><li> Prepare una solución de 100 ml de referencia y una solución de perfusión L (ver abajo) y el filtro de la solución. </li><li> Disolver 0,1% de BSA y 10 mM de glucosa en 20 ml de solución de referencia. </li><li> Calibrar la intensidad de la luz del estimulador óptico con fotómetro. </li><li> Monte la cámara de grabación en la platina del microscopio invertido. </li><li> La burbuja de la solución de perfusión con 95% O 2 / 5% CO 2, que se incuba a 40 ° C baño de agua para aumentar la solubilidad de CO 2. La solución de los flujos de la botella a la cámara de grabación que pasa a través de una resistencia de cerámica de calentamiento a 36-38 ° C. El calentador debe colocarse lo más cerca a la cámara de grabación como sea posible, idealmente en la platina del microscopio. </li><li> Ajuste el regulador de flujo para un caudal de alrededor de 1-1,5 ml / min. </li><li> Llenar el electrodo de registro con la solución de referencia. Insertar el electrodo en un porta-electrodos. Asegúrese de que no haya burbujas en el electrodo. Monte el soporte en el headstage del amplificador. Conecte el soporte a un dispositivo de succión, que se construye mediante la conexión de la tubería parcialmente llena con aceite mineral para el puerto lateral del porta-electrodos. El otro extremo del tubo está conectado a un pequeño depósito de aceite mineral, a la que la presión se puede aplicar por vía oral. </li><li> Conecte el electrodo de referencia al otro polo de la headstage. Obligar a la par térmico (TC) para el electrodo de referencia. Asegúrese de que las puntas de los electrodos y TC están muy juntos para que la lectura de la temperatura se toma como cerca de la célula como sea posible. </li><li> Encienda la iluminación infrarroja para visualizar el electrodo. El electrodo es visto por la cámara de infrarrojos conectada a un monitor. Centro del electrodo de la imagen en el campo visual y del monitor mediante un micromanipulador. </li><li> Ajustar la posición de la punta del electrodo de referencia cerca (2-4 mm) a la punta del electrodo de registro. </li><li> Ajustar el voltaje de CC para el calentador de modo que la temperatura de la solución es de 36-38 º C. </li><li> Realizar una prueba de sello para comprobar la resistencia de electrodo de registro, por lo general alrededor de 900 kW. </li></ol> Aislamiento de la retina del ratón <ol start="18"><li> Bajo tenue luz roja, la eutanasia el ratón adaptado a la oscuridad con el CO 2 y la dislocación cervical. Marcar los globos oculares con la punta de una antorcha de metal caliente de la cauterización de los punto más dorsal de la esclerótica un poco. Enucleación del globo ocular con unas tijeras. Todos los procedimientos posteriores se realizan bajo la luz infrarroja. </li><li> Hemisect los ojos bajo el microscopio con iluminación infrarroja y los convertidores de la imagen. </li><li> Retire la córnea y el cristalino. Eliminar la mayor cantidad de vítreo como sea posible. </li><li> Para grabar cono M-respuestas, eliminar la parte ventral de la ojera 4 con una cuchilla de afeitar a juzgar por la marca de la cauterización. </li><li> Pelar la retina de la capa de epitelio pigmentario. </li><li> Aplanar la retina y lo coloca en la parte inferior de la placa de Petri llenas de 1.2 ml solución de referencia. </li><li> Cortar la retina en pequeños trozos delgados con una cuchilla de afeitar y se incuba la preparación en una caja a prueba de luz saturada con oxígeno puro. </li></ol> Grabaciones <ol start="25"><li> Apague el calentador de forma temporal. Cambiar el flujo de perfusión a una tubería de derivación para evitar que la cámara de secado. </li><li> Drenan la mayor parte de la solución en la cámara usando un pedazo de tejido Kimwipe. Transferir la suspensión de la retina a la cámara de grabación con una pipeta de vidrio. </li><li> Espere unos 2 minutos hasta que las rodajas de retina se establecen. Interruptor de la perfusión de nuevo. Encender el calefactor. </li><li> Activar la iluminación infrarroja para visualizar la preparación. Búsqueda de un pedazo de retina tendido en la cámara con segmentos fotorreceptor exterior sobresaliendo (ver figura ejemplo). Dibuja los segmentos internos suavemente en el electrodo por la succión. En esta configuración, varios núcleos y segmentos internos debe ser elaborado en el electrodo. Registrar la photoresponse un destello brillante para probar si un segmento de cono interno está en el electrodo de la célula y si es curartu, a juzgar por la cinética de la respuesta y la amplitud. </li><li> Inferior del depósito mineral para aplicar una ligera presión negativa a la punta del electrodo para ayudar a sostener el segmento de interior en el electrodo. </li><li> Registro de flash de prueba, las respuestas de atenuar la intensidad luminosa vez que una célula se encuentra bien. Destellos de prueba son siempre de un estimulador de calibrado óptico de 5. La intensidad del flash y la longitud de onda son controlados por un conjunto de filtros de densidad neutra y filtros de interferencia de banda estrecha, respectivamente. Prueba de Flash duración (20 ms) es controlado por ordenador basada persianas. </li></ol> Soluciones <ol><li> Ratón solución de perfusión: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na succinato, 0,5 mM Na glutamato, 0,02 mM EDTA, y 10 mM de glucosa. </li><li> Grabación del ratón electrodo solución: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 3 mM HEPES (pH 7,4), 0,02 mM EDTA. </li></ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

Una sola célula de grabación de aspiración de las células fotorreceptoras se desarrolló hace 3 décadas. Que nos permite grabar través de la membrana cambio de corriente inducida por la estimulación de la luz, sin penetrar la membrana celular. Debido a la alta adhesión célula-célula, es difícil aislar la barra saludable único y el cono de la retina del ratón, como la retina de anfibios y es difícil de encontrar conos individuales debido al bajo porcentaje (3%) y pequeño tamaño. El segmento de interior-en-(IS-in) método d...

una sola célula grabaciones de succión de los conos del ratón

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Fotorreceptores de los bastones y conos en la retina es responsable de la detección de la luz. En la oscuridad, los nucleótidos cíclicos-cerrada (CNG) de canales en el segmento externo están abiertos y permiten el flujo de cationes a ritmo constante hacia el interior a través de la membrana, despolarización de la célula. Exposición a la luz desencadena el cierre de los canales de GNC, bloquea el flujo de cationes corriente de entrada, por lo que resulta en la hiperpolarización de la célula. Con base en la polaridad de los fotorreceptores, un método de grabación de succión se desarrolló en 1970 que, a diferencia de la clásica técnica de patch-clamp, no requiere penetrar en la membrana plasmática<sup&gt; 1</sup&gt;. Dibujar el segmento externo en una pipeta de vidrio bien instalados llena con solución extracelular permite registrar los cambios actuales en las células individuales a la exposición de pruebas flash. Sin embargo, esta bien establecido &quot;exterior del segmento en el (OS-in)&quot; de grabación de succión no es adecuado para las grabaciones de cono del ratón, por el bajo porcentaje de conos en la retina del ratón (3%) y las dificultades para identificar el cono segmentos exteriores. Recientemente, un segmento interno-en (IS-in) de registro de configuración ha sido desarrollado para dibujar el segmento de interior / región nuclear de los fotorreceptores en la pipeta de grabación<sup&gt; 2,3</sup&gt;. En este video, vamos a mostrar cómo grabar desde cada photoresponses ratón cono con una sola célula de electrodos de succión.

Le mostraremos cómo registrar las respuestas de flash de conos ratón utilizando un electrodo de succión.

Una sola célula grabaciones de succión de los conos del ratón

Los fotorreceptores de bastones y conos en la retina son responsables de la detección de la luz. En la oscuridad, los canales regulados por nucleótidos cíclicos (CNG) en el segmento externo...

Este video demuestra la disección de la retina de ratón y la posterior obtención de grabaciones de succión a nivel de célula individual en los conos. Los ojos de un ratón sacrificado y adaptado a la oscuridad se cauterizan en la parte dorsal y se nuclean bajo luz roja tenue. A continuación, los ojos se seccionan en hemicírculos.A lo largo del ecuador, se extraen la córnea y las partes ventrales de los globos oculares. Se aísla la retina dorsal de la capa de epitelio pigmentario y se corta en pequeños trozos delgados utilizando una hoja de afeitar. Los fragmentos de retina se colocan luego en la cámara de registro que encaja en la platina de un microscopio.Varios cuerpos celulares de fotorreceptores se introducen en el electrodo de registro. Cuando un fotorreceptor de cono se introduce en el electrodo, un destello de prueba brillante inducirá una respuesta fotóica con una amplitud superior a cuatro picoamperios. Hola. Hola. Soy Jin del Laboratorio del Dr. Mir Kops en el Departamento de Oftalmología y el censo visual de la Universidad de Washington en St. Louis.Hoy les mostraremos un procedimiento para registrar respuestas fotónicas de fotorreceptores individuales de Moscon. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las propiedades de adaptación de los conos mamíferos, los fotorreceptores que median nuestra visión diurna. Así que comencemos.Un día antes de la grabación, mantenga el experimento en la oscuridad. Adapte un ratón colocándolo durante la noche en una jaula hermética a la luz. Utilice un micropipeteador para fabricar electrodos de grabación a partir de tubos de vidrio borosilicatado bajo un microscopio compuesto.Utilice un filamento de calentamiento para fabricar el electrodo. Pule la punta de cada electrodo para alisarla y reduzca su abertura al diámetro deseado. Para el registro por succión de una sola célula cónica de ratón, el diámetro interno en la punta del electrodo debe ser de aproximadamente seis a siete micrómetros.Prepare una solución al 1 % de agar en agua destilada. Coloque la solución en agua hirviendo para fundir el agar. Una vez que el agar se haya fundido, transfiérala a una jeringa y llene las pipetas de vidrio con la solución.Para preparar los electrodos de referencia, déjelos solidificar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Una vez que el agar se haya solidificado, utilice una cuchilla de diamante para cortar cada pipeta por la mitad y obtener dos electrodos de referencia. Coloque los electrodos de referencia en un vial de centelleo lleno con solución de referencia y déjelos en remojo durante al menos 24 horas a cuatro grados Celsius para permitir que la solución penetre en el gel de agar.Los electrodos de referencia se pueden utilizar hasta tres meses a partir de la fecha de preparación. Los electrodos usados se descartan tras el experimento. El sistema de grabación está compuesto por un microscopio invertido montado sobre una mesa con suspensión neumática para minimizar el ruido por vibraciones, y protegido por una jaula de Faraday para reducir el ruido electromagnético.Se utiliza un micromanipulador motorizado para posicionar el electrodo de registro. El estimulador óptico consta de un filamento de tungsteno, obturadores controlados por computadora y filtros ópticos para regular la longitud de onda y la intensidad de la luz. Se emplea un amplificador de parche de voltaje para detectar las corrientes de membrana procedentes de células fotorreceptoras individuales.Durante las grabaciones, se realizará la perfusión del tejido. Coloque un litro del tampón de perfusión preparado en un baño de agua a 40 grados Celsius cerca del sistema de grabación. Luego, mediante tubos, conecte el tampón de perfusión a una mezcla de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono para que burbujee continuamente.Utilizando un fotómetro, mida la potencia de luz no atenuada de la luz no atenuada procedente del estimulador óptico; el detector del fotómetro se coloca sobre la platina del microscopio en el plano donde se ubicará la preparación. Posteriormente, convierta la lectura dada en microvatios a fotones por micrómetro cuadrado por segundo para estimar la cantidad de fotones por prueba. Tenga en cuenta el pulso de luz considerando la atenuación de la luz por filtros de densidad neutra.Una vez que se haya medido la potencia de luz no atenuada, retire el fotómetro del escenario y coloque la cámara de grabación que se utilizará para los experimentos sobre el escenario del microscopio invertido. Mediante tubos, conecte la botella de solución de perfusión, a través de una válvula reguladora, a la cámara de grabación. Pase los tubos a través de una resistencia calefactora.Asegúrese de que la resistencia de calentamiento esté colocada inmediatamente antes de la cámara de registro. Luego conecte el tubo de derivación desde la válvula reguladora hasta la cámara de registro. Inicie la perfusión abriendo y ajustando la válvula reguladora de flujo a una velocidad de flujo de uno a 1.5 mililitros por minuto.La solución de perfusión drena fuera de la cámara de registro y entra en un matraz colector por gravedad. Utilice una jeringa con una aguja roma para llenar los porta-electrodos con solución de referencia. Con una aguja de jeringa micropipeta, llene y enjuague el electrodo de registro con la solución de referencia, asegurándose de que no haya burbujas en el electrodo.Inserte el electrodo de referencia en un porta-electrodos y conéctelo al polo de referencia de la etapa inicial del amplificador. Utilice un anillo de goma para sujetar el termopar al electrodo de referencia. Asegúrese de colocar las puntas del electrodo y del termopar lo más cerca posible para garantizar que la lectura de temperatura se realice lo más cerca posible de la célula.Luego, inserte el electrodo de registro en un porta-electrodos y monte el porta-electrodos en la etapa de cabezal del amplificador. Mediante un tubo, conecte un pequeño depósito de aceite mineral al puerto lateral del porta-electrodos. Una succión suave mediante la boca a través del tubo conectado al depósito introducirá la célula en el electrodo.Utilizando el software del ordenador, abra una de las obturaciones del estimulador óptico. Para visualizar el área del haz del destello de prueba sobre la platina del microscopio, enfoque el microscopio hacia el fondo de la cámara de registro. Utilizando el micromanipulador, mueva el electrodo al centro del área del haz del destello de prueba.Coloque el electrodo de referencia cerca de la punta del electrodo de registro. Ajuste el voltaje del calentador de modo que la temperatura de la solución en la cámara de registro sea de aproximadamente 36 a 38 grados Celsius. Cuando se realice una prueba de sellado, que mide el voltaje a una amplitud de corriente preestablecida, para calcular la resistencia y verificar la resistencia del electrodo de registro, normalmente alrededor de 900 kiloohmios.La prueba de sellado permite detectar burbujas en los electrodos de registro o de referencia, o un tamaño inadecuado de la punta del electrodo de registro. La prueba de sellado está controlada por software mediante el programa de adquisición Clamp X. La lectura de resistencia se muestra en la pantalla del ordenador. Si la resistencia es demasiado baja, menos de 500 kiloohmios, es probable que la punta del electrodo sea demasiado grande y será necesario instalar un electrodo nuevo.Si la resistencia es superior a un miliohmio, podría haber una burbuja presente en el electrodo o su punta es demasiado estrecha, y será necesario lavar o reemplazar el electrodo. Una vez que el aparato de registro esté listo, prepare las secciones de retina para el experimento bajo una luz roja tenue; utilice la punta de la aguja de disección caliente para cauterizar la esclerótica en el punto más dorsal de cada globo ocular de un ratón adaptado a la oscuridad y sacrificado. A continuación, nuclee los globos oculares utilizando tijeras.Utilice pinzas romas para transferir los ojos a un microscopio de disección equipado con iluminación infrarroja y convertidores de imagen infrarroja. Todas las manipulaciones adicionales de disección se realizan bajo luz infrarroja. Luego, utilizando tijeras microquirúrgicas, corte el ojo abierto a lo largo del ecuador, excepto en el punto de cauterización.Utilice pinzas finas para retirar el cristalino. A continuación, retire la mayor cantidad posible del vítreo utilizando la punta del bisturí eléctrico como referencia. Use una cuchilla de afeitar para eliminar la parte ventral de la copa ocular.Luego, retire la córnea. A continuación, use pinzas para desprender la retina dorsal de la capa del epitelio pigmentario. Después, coloque la retina con el lado de los receptores hacia arriba en el fondo de una nueva placa de Petri que contenga uno o dos mililitros de una solución de referencia de glucosa 10 milimolar con BSA al 0,1 %, presionándola suavemente con una hoja de bisturí para aplanarla.Corte la retina en pequeños trozos delgados. Luego, incube la preparación en una caja de tipo luminoso saturada continuamente con oxígeno puro antes de agregar los trozos de retina a la cámara de registro. Apague temporalmente el calentador.Cambie el flujo de perfusión al tubo de derivación. Luego, utilizando una toallita kim, drene la mayor parte de la solución de la cámara. Encienda la iluminación infrarroja.Retire la suspensión de retina del incubador y transfiera los cortes a la cámara de registro. Utilizando una pipeta de transferencia de abertura ancha, permita que los cortes se asienten durante dos minutos. Una vez que los cortes de retina se hayan asentado, reactive la perfusión directa y el calentador.Identifique un fragmento de retina con sus segmentos externos de los fotorreceptores sobresaliendo. Coloque la punta del electrodo de registro por encima de la capa nuclear externa de la retina utilizando succión bucal. Introduzca suavemente varios cuerpos celulares de fotorreceptores en el electrodo, atrayendo las células hacia el interior del electrodo.Dé un destello de prueba de 20 milisegundos a 500 nanómetros. El cambio inducido por la luz en la corriente que fluye a través del fotorreceptor representa la respuesta al destello de prueba. Un cono sano producirá una amplitud de respuesta máxima de cuatro a siete picoamperios o pA.Cuando se estimula con un destello de prueba no atenuado. Una vez que se encuentra una buena célula, baje suavemente a mano el depósito de aceite mineral para aplicar una ligera presión negativa en la punta del electrodo, lo que ayudará a mantener el segmento interno de la célula dentro del electrodo. Si la célula es sensible, registre una serie de respuestas a destellos de prueba con intensidades que van desde el umbral hasta la saturación.Mediante esta técnica, podemos obtener respuestas fotoeléctricas de los conos a partir de cortes retinianos de ratón con la ayuda de un electrodo de succión. Aquí se muestra una superposición de varias grabaciones provenientes de la misma célula. Las respuestas fotoeléctricas de un único cono fueron inducidas mediante destellos de prueba de intensidad creciente, desde una intensidad débil, que genera una respuesta umbral de aproximadamente un picoamperio, hasta una intensidad brillante, que produce una respuesta saturada de alrededor de 5,5 picoamperios.A medida que aumenta la intensidad del destello, la amplitud de la respuesta fotoeléctrica aumenta hasta alcanzar la saturación. Los destellos se aplican cuando el tiempo es igual a cero. Simplemente le mostraremos cómo registrar respuestas fotoeléctricas de fotorreceptores individuales de mosca del vinagre utilizando un electrodo de succión.Al realizar este procedimiento, es importante recordar obtener la parte do do de la retina, cortar la retina en rebanadas delgadas, mantener el electrodo limpio de burbujas y minimizar tanto el ruido mecánico como el electromagnético. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe un procedimiento para la generación adaptada a la oscuridad rebanadas de la retina del ratón de los registros electrofisiológicos.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Se describe un método relativamente simple de transretinal electrorretinograma (ERG) para la obtención de grabaciones photoresponses conos y bastones de la retina del ratón intacto. Este enfoque se aprovecha del bloque de la transmisión sináptica de fotorreceptores para aislar sus respuestas de luz y grabar usando electrodos colocados sobre el terreno a través de la aislada plana montada en la retina.

Transretinal Grabaciones ERG de retina del ratón: Rod y el Cono Photoresponses

Fuente: Laboissonniere, et. al. Secuenciación de ARN unicelular de subconjuntos definidos de células ganglionares de la retina. J. Vis. Exp. (2017).  Este video muestra una técnica de trazado fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares de la retina (RGC) en la retina de un ratón transgénico. El proceso consiste en asegurar la retina aislada en una cámara de registro, mantener la viabilidad celular con perfusión oxigenada y dirigirse a las RGC marcadas con fluorescencia...

Identificación de subtipos de células ganglionares de la retina de ratón mediante trazado fluorescente

Fuente: Kulkarni, M. et al. Imágenes de la dinámica de Ca2+ en los terminales de los axones fotorreceptores de cono de la retina del ratón. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el uso de la microscopía de dos fotones para monitorear la dinámica del calcio en los fotorreceptores de cono de la retina de un ratón transgénico. Describe los pasos para preparar cortes de retina, obtener imágenes de biosensores de calcio basados en FRET y analizar los cambios de fluorescencia para cuantificar los...

Microscopía de dos fotones para monitorizar la dinámica del calcio en los fotorreceptores de los conos de la retina de los ratones

Se describe la preparación de rodajas finas de la retina acuáticos salamandras tigre...

Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

Retina neural de un ratón envejecido 8 días es en la parte superior de un bloque de gelatina 4%. Después del aislamiento de la capa de fotorreceptores (200 m) por vibratome, los fotorreceptores se siembran después de la disociación mecánica y enzimática para la cultura. La capa de fotorreceptores se puede utilizar para, análisis o trasplante bioquímicos moleculares.

Vibratome Seccionamiento retina del ratón para preparar cultivos de fotorreceptores

Demostraremos cómo preparar cortes de retina a partir del ojo del ratón y registrar las respuestas a la luz en las neuronas de la retina. Todo el procedimiento se lleva a cabo en condiciones adaptadas a la oscuridad.

Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

Se describe un protocolo para supervisar Ca 2+ dinámica en los terminales de los axones de los conos utilizando una preparación rebanada ex-vivo de la retina del ratón. Este protocolo permite estudios completos sobre los conos de señalización de Ca2 + en un importante sistema modelo de mamífero, el ratón.

Imagen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinámica de Terminales cono fotorreceptor axón de la retina del ratón

Hemos desarrollado una preparación rebanada horizontal de la retina de mamíferos adultos con el plano de seccionamiento en paralelo a la superficie de la retina. campos dendríticas de las neuronas de la retina orientadas nonradially no fueron truncados, lo que permite el estudio de las técnicas de procesamiento de señales con patch-clamp y de imagen.

Preparación de cortes horizontales de ratón adulto Retina de Estudios electrofisiológicos

Aquí, presentamos un enfoque combinatorio para clasificar los tipos de células neuronales antes del aislamiento y para la posterior caracterización de los transcriptomas de una sola célula. Este protocolo optimiza la preparación de muestras para el éxito de secuenciación de ARN (RNA-Seq) y describe una metodología diseñada específicamente para la mejora de la comprensión de la diversidad celular.

RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

Describimos un método para obtener cultivos primarios de fotorreceptores de cono de la retina de embriones de pollo y su uso para la detección de alto contenido.

Cultivos Enriquecidos con Conos De La Retina De Embriones De Pollo Para Estudiar Las Interacciones Celulares De Varilla A Cono

Aprende a registrar respuestas de fotoreceptores cónicos individuales en ratón mediante electrodo de succión. Este método de electrofisiología permite estudiar la fisiología celular y las propiedades de adaptación de los conos en neurociencia visual.

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