Fabricación y operación de una inserción de oxígeno para Adherente cultivos celulares

El dispositivo de inserción hipóxica tiene seis pilares que anidan en los pozos de un seis. El gas de la placa del pozo fluye a través de la red microfluídica en la base del pilar y puede difundirse a través de la membrana PDMS permeable al gas, separando la red de gas y los medios de cultivo. Este dispositivo minimiza la longitud de la ruta de difusión entre la fuente de oxígeno, la red microfluídica en la base del pilar y las células, lo que permite una concentración de oxígeno más rápida. Equilibrado.

El dispositivo también permite un control mucho mayor sobre el patrón espacial del oxígeno expuesto a las células, que está determinado por el diseño de la red de gas microfluídico realizado por fotolitografía estándar utilizando fotomáscaras. Hola, soy Sean Ard, del laboratorio del Dr. David Edington en el Departamento de Bioingeniería de la Universidad de Illinois en Chicago. Hola, también soy Ellie del Laboratorio Edington.

Hoy le mostraremos cómo fabricar, validar y utilizar un dispositivo personalizado para exponer cultivos celulares in vitro en una placa de seis pliegues a diferentes concentraciones de oxígeno. Hemos utilizado este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el efecto del oxígeno en la cicatrización de heridas, la generación de especies reactivas de oxígeno y la migración. Así que comencemos.

Para comenzar la fabricación del inserto oxigenante, prepare Polymethyl Sloane o PDMS en una proporción de 10 a uno entre el prepolímero y el agente de curado. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, la mezcla de PDMS se agrega a un molde Dell previamente mecanizado con un patrón para imitar la forma de una placa de cultivo estándar de seis pocillos. Una vez curado a 75 grados centígrados durante la noche, la matriz de pilares moldeados de réplica resultante formará el primero de los tres componentes que componen el inserto oxigenante para fabricar el segundo componente clave del inserto oxigenante.

Un maestro SU ocho se prepara girando primero SU 8 21 50. En una oblea de silicona, se aplica una fotomáscara a la oblea y la SU eight se expone a los rayos UV a través de la fotomáscara para crear un molde maestro con un grosor de microcanal de 300 micrómetros. Vierta PDMS sobre el SU eight Master y cure durante dos horas a 75 grados centígrados para producir un molde positivo que finalmente formará los microcanales en la parte inferior de cada pilar.

El tercer componente del dispositivo se fabrica haciendo girar PDMS en una oblea de silicio a 500 RPM durante 10 segundos, seguido de 900 RPM durante 30 segundos para lograr un cerebro de membrana de 100 micrómetros de grosor. Como el PDM es permeable al gas, el oxígeno puede llegar a los microcanales directamente a través de esta membrana. Una vez que todos los componentes están preparados, cada superficie de unión se somete a un tratamiento de plasma de oxígeno durante un minuto.

Usando un dispositivo de plasma portátil, primero una los seis componentes de microcanales a la matriz de pilares, luego perfore dos orificios en cada pilar para que sirvan como entradas y salidas de gas. Por último, adhiera la membrana a la parte inferior del microcanal para facilitar la unión y expulsar las burbujas. Las superficies tratadas con plasma se presionan juntas durante aproximadamente un minuto con la mezcla, el extremo de un par de pinzas, espere una hora entre cada unión para asegurarse de que el dispositivo esté completamente unido y se pueda calibrar.

Una vez que se ha fabricado un dispositivo completo, es necesario calibrar el nivel de oxígeno que reciben las células cuando utilizan el inserto oxigenante en experimentos reales. Para la calibración, utilice un sensor de oxígeno fluorescente o un portaobjetos astuto, que contiene un recubrimiento de tinte de rutenio fluorescente que se apaga con oxígeno. Los portaobjetos Foxy están precortados para encajar en el fondo de una placa de seis pocillos.

El portaobjetos astuto debe cortarse para cubrir la mayor parte posible de la superficie del pozo. Dado que el tobogán foxy tiene un grosor de aproximadamente un milímetro, modifique el dispositivo para mantener la distancia deseada para una membrana adecuada. Difusión de diapositivas.

Esta distancia depende del experimento, pero para la mayoría de los casos debe ser inferior a un milímetro utilizando el microscopio de vidrio de un milímetro de espesor. Deslice los postes de aproximadamente seis milímetros de largo y cuatro milímetros de ancho hasta la parte inferior del dispositivo. El dispositivo descansará sobre postes encima del corte de la corredera.

Los cubreobjetos de vidrio también se pueden usar para un espacio de difusión de 0,17 milímetros para validar el uso de oxígeno. A tres mililitros de agua desionizada a temperatura ambiente en los pozos de la placa de seis pocillos donde se medirá el oxígeno. Coloque el dispositivo en la placa y, utilizando el software metamorph, seleccione el número y la ubicación de las posiciones deseadas en el sensor foxy.

Diapositiva para analizar las concentraciones de oxígeno. Conecte el tubo de la pistola tai entre el tanque de gas oxígeno y el dispositivo de inserción hipóxica. Se utiliza un regulador de flujo de precisión ajustado a un caudal de 50 a 100 mililitros por minuto para el control fino del gas suministrado.

Asegurándose de que el regulador de flujo de precisión esté cerrado. Abra primero el regulador de la parte superior del tanque, seguido del regulador de precisión. Reduzca el caudal a entre 10 y 20 por minuto después de 15 minutos.

Para evitar la creación de burbujas en el agua, observe de cerca el valor del caudal durante la próxima hora y haga los ajustes necesarios, ya que la caída de presión cambiará mientras el sistema se equilibra alterando el caudal para capturar imágenes de la placa y los sensores Foxy. Se utiliza un microscopio Olympus IX 71 equipado con fluorescencia, una cámara de dispositivo de acoplamiento de carga de Q Imaging, software de adquisición de imágenes Tiga, SRV y Metamorpho. El microscopio está equipado con un Olympus 3 1 0 2 0, un filtro fluorescente compatible con Foxy con una longitud de onda de excitación de 475 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 600 nanómetros.

Para probar el tiempo de equilibrio y el grado de oxigenación del dispositivo, elija tres puntos en el portaobjetos en los que medir la concentración de oxígeno. Capture una imagen del portaobjetos inmediatamente antes de iniciar el flujo de gas. Capture imágenes e intervalos de 10 segundos durante 30 minutos a medida que el gas fluye a través del dispositivo para probar la heterogeneidad y el suministro de oxígeno.

Establezca múltiples puntos a intervalos de un milímetro que abarquen el ancho del canal y mida la concentración de oxígeno en la superficie del pozo utilizando metamorph. Exporte la intensidad media de la imagen para cada posición y represente la concentración de oxigenación en función de la intensidad de la fluorescencia. Genere una curva de calibración ajustando curvas lineales a la línea de cero a 10% y de 10 a 21% relacionando la intensidad de fluorescencia con la concentración de oxígeno Para cada posición medida, los datos de intensidad bruta se pueden exportar desde metamorph y analizar más a fondo con Microsoft Excel u otro software estadístico.

Una vez que se ha calibrado el dispositivo, los experimentos, como los ensayos de cicatrización de heridas, pueden comenzar a esterilizar en autoclave el inserto calibrado a 121 grados Celsius durante 15 minutos dentro de las 24 horas anteriores al experimento y trabajar con él en una campana de cultivo de flujo laminar para evitar la contaminación posterior. Remoje el inserto de PDMS esterilizado en medio libre de suero durante 24 horas para inhibir las burbujas de gas al insertarlo en el cultivo de pocillos de placa, células MDCK u otras células adherentes al 100% de fluidez en una placa de seis pocillos y cree arañazos rectos en las capas mono con una punta de pipeta P 200. Los arañazos simulan heridas en la monocapa adherente.

Aspire el medio celular sin alterar la monocapa y enjuague con cinco mililitros de medio. Aspirar de nuevo y rellenar los pocillos con tres mililitros de suero libre. Inserte suavemente el dispositivo en la placa, asegurándose de evitar las burbujas.

Inclinar el dispositivo durante la inserción ayuda a expulsar las burbujas por un lado. Tenga cuidado de evitar ejercer una presión excesiva sobre el dispositivo, lo que podría deformar el PDMS lo suficiente como para aplastar las células subyacentes. Coloque la placa y el dispositivo en una platina de microscopio calentada a 37 grados Celsius y conecte la tubería desde el tanque de gas de origen a los puertos de entrada y salida del dispositivo.

La incubadora de cultivo debe tener un orificio para permitir la entrada de tubos y los tubos deben estar conectados Después de colocar el dispositivo en la incubadora, siga el mismo procedimiento para iniciar el flujo de gas descrito anteriormente para evaluar la cicatrización de heridas Capture imágenes de lapso de tiempo de las células cada 20 minutos durante 15 a 18 horas utilizando equipos y software de imágenes como se describió anteriormente, T scratch un algoritmo de medición de heridas se puede utilizar para analizar el área de superficie no cicatrizada después de una duración experimental deseada. Detenga el flujo de gas, retire la placa y proceda al procesamiento posterior de la celda si lo desea. El dispositivo de inserción hipóxica requiere menos de dos minutos para estabilizarse al 0,5% de oxígeno, como se muestra aquí.

El tamaño del espacio del fondo del pozo de membrana del dispositivo fue un factor crítico para determinar la eficiencia de equilibrio, ya que los tamaños de espacio más grandes requirieron más tiempo para alcanzar los valores de concentración de oxígeno en estado estacionario. El dispositivo también permite un gran control sobre la oxigenación espacial en un solo pozo, lo que permite la formación de múltiples condiciones e incluso genera un perfil cíclico de oxígeno en toda la superficie del pozo. Las monocapas de células MDCK se expusieron a un 10 % o un 21 % de oxígeno y el área superficial de la herida se analizó a lo largo del tiempo utilizando el algoritmo de cola de heridas por arañazo Ts de MATLAB.

Después de 11 horas de un total de 17 horas, el 6,87% de la herida original permaneció cuando se expuso al 10% de oxígeno, mientras que el 64,4% de la herida permaneció por debajo del 21%Como se muestra aquí, las concentraciones de oxígeno se correlacionan negativamente con el área abierta de la herida para ambas concentraciones de oxígeno. Durante la duración del experimento, acabamos de mostrarle cómo fabricar, validar y utilizar el dispositivo de inserción hipóxica para un ensayo de curación de heridas por arañazo. El dispositivo ofrece una serie de ventajas sobre otros sistemas de oxigenación, como una huella de laboratorio más pequeña y un control mucho mayor sobre la oxigenación espacial y temporal en la superficie celular.

El dispositivo puede ser utilizado por prácticamente cualquier laboratorio que estudie el efecto del oxígeno u otros gases como el dióxido de carbono en cultivos celulares in vitro. Al realizar este procedimiento, es importante remojar el dispositivo esterilizado y los medios de cultivo durante la noche, minimizando la formación de burbujas durante el experimento. Además, permita que el sistema se iguale antes de comenzar el experimento.

Esto se debe a que el caudal cambia a medida que la presión en el sistema se iguala. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.