Name: Cuantitativas PCR en tiempo real utilizando el Thermo Scientific Solaris qPCR ensayo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a realizar PCR cuantitativa en tiempo real utilizando los ensayos Solaris para análisis de expresión génica. Este método permite detectar todas las variantes de empalme conocidas con alta especificidad y reproducibilidad.

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1. El Thermo Scientific Solaris ensayo qPCR diseño de algoritmos <ol><li> El algoritmo utilizado en el diseño de Solaris qPCR sonda / primer pares se ajusta a la Tm de cada componente lo que permite condiciones universales ciclismo. Obligatoria la incorporación de la MGB, o surco menor, fracción en la investigación aumenta el Tm y permite una más corta que las sondas diseñadas para la flexibilidad y el rendimiento del ensayo mayor. Como su nombre indica, MGBs son una clase de antibióticos que pueden encajar en el surco menor de la hélice del ADN. MGBs se adjunta al final de 3 a 5 de una sonda de ADN. En la solución, la fluorescencia reportero FAM de la sonda se apaga por saciar la Eclipse oscuro. Cuando la sonda se une a una secuencia objetivo, el cambio resultante en 3-D la conformación de la sonda s permite que una señal fluorescente fuerte. La unión de la sonda de ADN de secuencia objetivo es estabilizado por el MGB, que permite el uso de muy específicas, las sondas más cortas, manteniendo la temperatura de fusión adecuado para PCR. Por lo tanto, la detección de la señal se produce durante la fase de recocido de amplificación de la diana. Durante la etapa de extensión, la sonda MGB se disocia y la fluorescencia se apaga de nuevo. Debido a que la sonda se disocia, no afecta la eficiencia de la PCR. </li><li> Otra característica del algoritmo de Solaris es el uso de superbases. Superbases se modifican las bases que han mejorado la capacidad de unión para mejorar la estabilidad de los bonos A y eliminar GG libre asociación en guanina secuencias ricas. Por otra parte, no apagar fluoróforos adyacentes conectados a la terminal 5. Estas bases son colocados de forma selectiva, de acuerdo con el algoritmo, para ampliar la disponibilidad de la secuencia blanco. Esto hace posible el uso de secuencias, como las regiones ricas en GC, que de otra forma se evitaría en el diseño de cebadores y sondas. </li><li> Siempre que sea posible, el algoritmo de Solaris incluye las regiones de unión exón de expansión en el sitio de destino. Esto aumenta la especificidad al evitar la amplificación de ADN genómico contaminante. </li><li> Es importante destacar que el algoritmo también identifica una secuencia consenso de todas las variantes de empalme conocidos, de tal manera que todos están cubiertos por una sola sonda / primer set. Por lo tanto, sólo un ensayo que se necesita para un determinado gen de interés. </li><li> Por último, el sistema operativo Solaris ensayo qPCR algoritmo de diseño utiliza parámetros muy estrictos para las consideraciones de diseño críticos, entre ellos el contenido de GC, la duración, Tm, y tramos de nucleótidos homogénea. Las secuencias resultantes se analizaron para BLAST especificidad con tres diferentes bases de datos: genómica, el expediente académico, y pseudogen. </li></ol> 2. La obtención de reactivos Solaris <ol><li> Para obtener los reactivos de Solaris, visite <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Una vez en el sitio web, haga clic en "Búsqueda de Productos GENEius". Para ir directamente a la búsqueda de productos GENEius, vaya a <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Haga clic en la caja de consulta de búsqueda y elegir el organismo de destino apropiado. </li><li> La búsqueda de productos GENEius puede procesar muchos identificadores de genes diferentes. Aquí se pueden introducir uno de los términos de búsqueda sugeridos para encontrar el gen de interés, incluyendo Ref. Sec. de adhesión, la identificación de genes, el símbolo del gen, una descripción de genes, la identificación o el número de Sanger, o un número de catálogo. A continuación, haga clic en "Buscar". </li><li> Identificar el gen de interés y haga clic en "Seleccionar" en el lado izquierdo. Esto abrirá una ventana que muestra los diferentes productos de Thermo Scientific para el gen de interés. En "Productos" seleccione la opción "Detección de qPCR" Tab. </li><li> En el marco del "Ensayo de Solaris expresión génica" la partida, podrás ver un óptimo diseño de la sonda Solaris / ensayo manual. Este ensayo un cubrirá todas las variantes conocidas de empalme de genes objetivo. Elija la cantidad deseada. Están disponibles en 100, 200, 400 y 1000 X 25 reacciones l (si el ensayo se identifica como hecho a la medida, el tamaño del paquete de 100 no estará disponible). Haga clic en "Añadir al carro". </li><li> A continuación, seleccionar la combinación adecuada para dominar el termociclador que se utilizará. Para determinar qué mezcla maestra que funcionará mejor con la máquina disponible, haga clic en "Find a Mix Master, que funciona mejor con su termociclador de PCR!" </li><li> Buscar la cicladora qPCR que se utilizará en el menú para determinar cuál es la combinación de su uso. </li><li> Volver a la ventana de búsqueda GENEius producto, y seleccionar la combinación maestro adecuado. La mezcla maestra viene en 100, 200, 400 y 1000 tamaños de reacción. Haga clic en "Añadir al carro". </li><li> Genes de referencia sugerido y los kits de verso cDNA síntesis también se puede pedir para una completa QRT-PCR análisis. </li><li> Cuando los reactivos Solaris qPCR llegar, almacenarlos a -20 ° C hasta que esté listo para su uso. Los siguientes reactivos deben ser recibidos: Una solución de 20X, con dos primers siempre a 800 nM cada uno y una sonda del gen específico establecido en 200 nm, secuenciadorescia de información tanto para la sonda y cebadores, y Solaris Gene qPCR Expresión Master Mix en una concentración de 2X. Solaris qPCR ensayos de expresión de genes son estables durante un mínimo de 12 meses. Evite congelar y descongelar repetidas. </li></ol> 3. qPCR configuración <ol><li> Comience el protocolo qPCR con cDNA. ARN total se extrajo utilizando un método spin columna. El Thermo Scientific kit Verso cDNA síntesis se recomienda para la transcripción inversa para generar ADNc. </li><li> Prepárese para qPCR por el deshielo de los cebadores, las sondas, y mezcla maestra sobre el hielo. También tener a mano agua grado PCR y qPCR opaco placas blancas, que pueden mejorar la sensibilidad de la PCR en tiempo real. </li><li> La mezcla maestra contiene todos los componentes para PCR en tiempo real, incluyendo: 1) la ADN polimerasa Thermo-Start, una versión de arranque en caliente de la ADN polimerasa Thermoprime. Este tipo de polimerasa se utiliza para evitar la amplificación no específica durante la reacción de instalar y requiere la activación de paso a 95 ° C 15 min. 2) en la mezcla de dNTPs Solaris Maestro, dTTP reemplaza dUTP para maximizar la eficiencia de amplificación 3) tampón de reacción de propiedad, optimizado para trabajar con Solaris cartilla / sonda de ensayos. Este tampón de reacción contiene un tinte azul para aumentar el contraste entre el reactivo y el plástico. 4) ROX, si su instrumento qPCR requiere ROX. </li><li> Una vez que las soluciones se han descongelado, mezcle agitando el tubo (no vortex). Girar hacia abajo para evitar la pérdida de reactivo. </li><li> Luego, prepare un tubo de 15 ml estériles Falcon para establecer la mezcla de reacción para el gen de interés, más uno para el gen de referencia, la ampliación en función del número de muestras. Prepare suficiente como para que tres réplicas se pueden preparar para cada muestra, incluyendo un control sin plantilla (NTC) y las muestras de la curva estándar, si el método de la curva estándar se utiliza para el análisis. </li><li> Para cada muestra se ejecutan en una placa y 96, mezclar los siguientes: 5 l de la mezcla de Solaris qPCR 2X Master, 0,5 l de la versión de Solaris Primer / sonda conjunto (20 veces), y el agua PCR grado tal que el volumen final de reacción, una vez el ADNc se agrega será de 25 mL. Para cada muestra se ejecutan en una placa de 384 y mezclar los siguientes: 12,5 l de la mezcla de Solaris qPCR 2X Master, 1,25 l de la versión de Solaris Primer / sonda conjunto (20 veces), y el agua como PCR grado que el volumen final de reacción, una vez que el cDNA se agrega será de 10 mL. </li><li> Utilizando una pipeta multicanal, la transferencia de la mezcla maestra a los pocillos correspondientes de la placa. El tinte azul incluido en la mezcla maestra ayudará en el progreso de pipeteo de seguimiento en las placas blancas. A continuación, agregue el 5.1 l plantilla de cDNA (de una placa y 96) o 2.1 L de cDNA plantilla (para una placa de 384 pocillos). Pipeta de arriba a abajo para mezclar. Colocar la placa en una centrífuga y centrifugar para eliminar las burbujas, ya que estos interfieren con las lecturas de fluorescencia. </li><li> Programa del termociclador: La enzima se debe activar con un 95 º C 15 minutos (1 ciclo). Luego 40 ciclos de 95 ° C, la desnaturalización de 15 segundos, y el recocido y extensión a 60 ° C durante 60 segundos. </li><li> Colocar la placa en el instrumento qPCR. Iniciar el programa. </li></ol> Representante qPCR resultados utilizando Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ensayos de Solaris dar una detección fiable incluso en concentraciones muy bajas de entrada, a juzgar por la eficiencia de la PCR y los valores de r2. Diez de 10 diluciones de cDNA sintetizado a partir de la secuencia sintética de amplificación del ARN o la secuencia de amplificación de ADN se amplificó en un instrumento ABI 7900HT con Solaris Gene qPCR ensayo de expresión de F2RL1 o Cdc20, respectivamente. Las curvas de amplificación escala logarítmica, y las curvas de calibración se muestran junto con el rendimiento de cada ensayo en particular la eficiencia, el valor de r2, el rango dinámico de 10 log10 diluciones y el límite inferior de detección. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Ensayos de Solaris dar resultados consistentes, incluso entre los diferentes investigadores y laboratorios. siRNAs dirigidos ALDOA y PPIB, así como un control no-objetivo (NTC), fueron transfectadas en células HeLa a 100 nm, 10, 1 y 0,1 la concentración final. Las células fueron cosechadas y el ARN total aislado 48 horas después del tratamiento. cDNA fue sintetizado utilizando Thermo Scientific Kit Verso cDNA Síntesis. Una alícuota del cDNA se amplificó en dos laboratorios separados geográficamente, utilizando Solaris qPCR ensayos de expresión genética para la detección de ALDOA, PPIB y GAPDH en un LightCycler de Roche 480 (de 384 pozos) de la plataforma. Caída se calculó utilizando el método ΔΔCq (normalizado a GAPDH genes de referencia y las células tratadas con NTC). Los mismos niveles de caída se manifestó en favor tanto de los objetivos de genes entre los dos investigadores en ambos sitios.

Los autores de este artículo son empleados de Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris ensayos qPCR un método sencillo, mejor para la realización de análisis qPCR. Utilizando un algoritmo de alto rigor, la incorporación de la tecnología y la MGB superbases, estos conjuntos de cebadores y sonda de maximizar la fidelidad y la solidez de los experimentos de qPCR. Un primer y sonda conjunto reconoce todas las variantes conocidas de empalme de un determinado gen. El sitio de destino, siempre que sea posible, incluye las regiones que abarca el exón, para asegurarse de que el ADN genómico no se amplifica. Estas características hacen posible el funcionamiento de numerosas muestras de forma simultánea, lo que reduce la cantidad de tiempo necesario para realizar experimentos complejos. Dado que la mezcla principal es azul, es posible el uso de placas de color blanco opaco, lo que mejora la sensibilidad de la PCR cuantitativa, sin perder de vista la pipeta. En conjunto, las características de diseño del ensayo qPCR Solaris hacen de este ensayo qPCR novela un ensayo simple, pero de alto rendimiento que es específica y sólida.

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Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

El Solaris Gene qPCR ensayo de expresión es un nuevo tipo de juego de cebadores / sonda, diseñada para simplificar el proceso de qPCR mientras se mantiene la sensibilidad y la precisión de la prueba. Estos conjuntos de cebadores / sonda se pre-diseñados para&gt; 98% de los genomas humano y del ratón y mejoras de las características importantes de las tecnologías ya disponibles. Estas mejoras han sido posibles gracias a un algoritmo de diseño novedoso, desarrollado por expertos en bioinformática Thermo Scientific. Varias funciones convenientes han sido incorporados en el ensayo qPCR Solaris para agilizar el proceso de llevar a cabo cuantitativas PCR en tiempo real. En primer lugar, el protocolo es similar a otras alternativas comúnmente empleados, por lo que los métodos utilizados en qPCR es probable que esté familiarizado. En segundo lugar, la mezcla maestra es de color azul, lo que hace que la configuración de las reacciones qPCR más fácil de seguir. En tercer lugar, las condiciones de ciclos térmicos son los mismos para todos los ensayos (los genes), lo que permite ejecutar muchas muestras a la vez y reducir las posibilidades de error. Finalmente, la sonda y la información de la secuencia de los cebadores se proporcionan, lo que simplifica el proceso de publicación. En este sentido, se muestra cómo obtener la reactivos de Solaris con la función de búsqueda de productos GENEius encontrar en el sitio web de pedidos (www.thermo.com / solaris) y el uso de los reactivos para la realización de Solaris qPCR utilizando el método de la curva estándar.

El Solaris qPCR ensayos de expresión génica son nuevas pre-diseñados qPCR primer / sonda combinaciones diseñadas para simplificar el proceso de qPCR sin sacrificar la especificidad y la robustez de la prueba.

Cuantitativas PCR en tiempo real utilizando el Thermo Scientific Solaris qPCR ensayo

El ensayo de expresión génica Solaris qPCR es un nuevo tipo de juego de cebadores y sondas, diseñado para simplificar el proceso de qPCR manteniendo la sensibilidad y...

En este artículo en video, se demuestra la PCR en tiempo real utilizando ensayos Solaris QPCR. Los ensayos Solaris QPCR son conjuntos de cebadores y sondas específicos para un gen, diseñados para detectar todas las variantes de empalme conocidas de un gen determinado. Bajo condiciones universales de termociclación, la sonda Solaris tiene un agente fijador del surco menor, un grupo funcional y un marcador FA en el extremo cinco prime, y un amortiguador oscuro eclipsado en el extremo tres prime.Durante la etapa de desnaturalización de la PCR en tiempo real, la sonda permanece en solución y la fluorescencia del marcador FAM está apagada. Durante las fases de alineamiento y extensión, los cebadores de la sonda se unen a la secuencia diana y el apagador se separa del FAM. Entonces, el FAM emite una señal fluorescente intensa cuando la sonda se disocia; posteriormente, la fluorescencia vuelve a apagarse.Se obtienen resultados de PCR en tiempo real que demuestran la sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de este ensayo eficiente. Hola, soy James Covino del equipo de Investigación y Desarrollo de Thermo Fisher Scientific en Lafayette, Colorado. Hoy les mostraremos un procedimiento para preparar una reacción QPCR estándar utilizando los reactivos de expresión génica Lars QPCR.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la inhibición de genes diana mediante tecnologías de interferencia del ARN. Así que comencemos. El ensayo Solaris QPCR STEM se define por su algoritmo único que utiliza tecnologías MGB y bases súper para proporcionar un ensayo único y conveniente para el 98 % de los genes anotados de humanos y ratones.Normalmente, el diseño de sondas y cebadores de ADN está limitado por la temperatura de fusión de la sonda, que se determina por el número y tipo de bases. Las secuencias más largas y las ricas en GC presentan temperaturas de fusión más altas. La porción de unión al surco menor utilizada en las sondas Solaris se inserta en el surco menor de la hélice de ADN y estabiliza la interacción entre la sonda y la secuencia diana.Esto aumenta la temperatura de fusión, lo que permite utilizar sondas más cortas. El algoritmo Solaris también incorpora selectivamente nucleótidos modificados denominados bases súper para mejorar la estabilidad de los enlaces AT y eliminar la autoasociación GG en secuencias ricas en guanina. Esto permite el uso de secuencias diana que de otro modo se evitarían.La mayor flexibilidad de secuencia que confiere el uso de estas tecnologías permite diseñar conjuntos de cebadores y sondas que reconocen todas las variantes de empalme conocidas de un solo gen. Téngase en cuenta que siempre que sea posible se han incorporado regiones que abarcan uniones de exones en el sitio diana para aumentar la especificidad, evitando así la amplificación de ADN genómico contaminante. Los conjuntos resultantes de cebadores y sondas se analizan mediante blast utilizando tres bases de datos diferentes: genómica, transcripción y pseudogenes, para garantizar la especificidad. Además, los conjuntos de cebadores y sondas Solaris se han optimizado completamente, de modo que las condiciones de ciclado para todos los ensayos de PCR cuantitativa son idénticas, lo que permite evaluar la expresión de diversos transcritos en una sola corrida de PCR.Para comenzar a planificar el experimento de qPCR R, identifique los reactivos necesarios para realizar la qPCR del gen de interés utilizando la búsqueda de productos Genius, disponible en thermo.com/solaris. Haga clic en el cuadro de consulta de búsqueda y seleccione el organismo diana adecuado. La búsqueda de productos Genius puede procesar muchos identificadores de genes diferentes. Aquí.Introduzca uno de los términos de búsqueda sugeridos para el gen de interés, luego haga clic en buscar, identifique el gen de interés y haga clic en seleccionar en el lado izquierdo. Esto abrirá una ventana que muestra los diferentes reactivos disponibles para el gen de interés. Haga clic en la pestaña de detección de QPCR en el ensayo de expresión génica Solaris.Se muestra un ensayo de cebador e hibridación de sonda Solaris diseñado óptimamente. Este único ensayo detectará todas las variantes de empalme conocidas del gen de interés. Una vez identificado el agente cebador apropiado, busque el termociclador QPCR que se utilizará en el menú e identifique la mezcla maestra compatible, ya sea la mezcla maestra con un vial separado de colorante pasivo de referencia rocks, la mezcla rocks o la mezcla baja en rocks.Aquí utilizaremos el Roche Light Cycler 480, por lo que se empleará la mezcla maestra más el vial de rock. También es importante asegurarse de incluir un gen de referencia adecuado en este estudio. Se utilizará B2M una vez que se reciban todos los reactivos de Solaris QP CR.Deben almacenarse a menos 20 grados Celsius hasta su uso. Los reactivos son estables durante al menos 12 meses. Debe evitarse la congelación y descongelación repetidas.Prepare el ADNc para la PCR cuantitativa realizando reacciones de transcripción inversa sobre el ARN de la muestra. Una vez preparado el ADNc, descongele el ensayo Solaris y la mezcla maestra sobre hielo. La mezcla maestra contiene todos los componentes para la PCR cuantitativa excepto el ensayo específico del gen y los componentes de la plantilla, que incluyen termostato, ADN polimerasa dn, TPS rocks.Si el instrumento de QPCR requiere piedras y un tampón de reacción exclusivo que contiene un colorante azul interno, también tenga a mano agua de grado PCR y placas de QPCR. Una vez que las soluciones se hayan descongelado, mézclelas agitándolas suavemente y luego centrifúguelas brevemente para evitar la pérdida de reactivo. A continuación, en un tubo de 15 mililitros, prepare una mezcla maestra del ensayo de QPCR Solaris 1x.Al combinar el número deseado de muestras que se analizarán en una placa de 384 pocillos, agregue cinco microlitros de mezcla maestra 2x, 0,5 microlitros de ensayo Solaris 20X y agua libre de nucleasas para que el volumen final en cada pocillo sea de 10 microlitros. Después de añadir el ADNc, asegúrese de preparar suficiente mezcla para tres réplicas de cada muestra, incluyendo un control sin molde (NTC) y un control sin transcriptasa inversa (sin RT) para verificar la contaminación de los reactivos o la presencia de ADN genómico contaminante, respectivamente. A continuación, transfiera la mezcla a un depósito estéril.Luego, utilizando un pipetador multicanal, transfiera el volumen adecuado de una mezcla maestra x a los pozos correspondientes de la placa de PCR. Si se utilizan placas blancas, el colorante azul interno incluido en la mezcla maestra ayudará a seguir el progreso del pipeteo. Se pueden analizar múltiples bibliotecas de ADNc y genes de referencia en la misma placa, ya que todas las condiciones de ciclado son idénticas.Una vez que se haya añadido el mezcla maestra 1x a los pozos adecuados, agregue la plantilla de ADN diluida a cada pozo de modo que el volumen final sea de 10 microlitros; pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Selle la placa con un sello adhesivo o con un sello térmico, como se muestra aquí.Coloque la placa en una centrífuga y centrifugue para hacer descender los reactivos al fondo del pocillo y eliminar cualquier burbuja que pueda interferir con las lecturas de fluorescencia. En el termociclador, la polimerasa con inicio en caliente presente en la mezcla maestra Solaris QPCR debe activarse a 95 grados Celsius durante 15 minutos, un ciclo, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 grados Celsius durante 15 segundos y una extensión a 60 grados Celsius durante 60 segundos. Este protocolo es el mismo para todos los ensayos Soliris QPCR, independientemente del gen que se esté amplificando.Finalmente, coloque la placa en el instrumento de QPCR e inicie el programa. Esta figura demuestra el alto rendimiento de los ensayos Solaris aquí, se amplificaron 10 diluciones decimales de ADN sintético o ADNc utilizando los ensayos de expresión génica Solaris QPCR para CDC 20 y F two RL one, las curvas de amplificación en escala logarítmica y las curvas estándar para 10 diluciones log 10 demuestran el alto rendimiento del ensayo incluso a bajas concentraciones de entrada.El rendimiento de cada ensayo se mide mediante el valor de eficiencia al cuadrado, el rango dinámico sobre 10, las diluciones log₁₀ y el límite inferior de detección. Los datos mostrados aquí demuestran la reproducibilidad de los ensayos Solaris. En este caso, alícuotas de ADNc se amplificaron en dos laboratorios separados geográficamente utilizando ensayos de expresión génica Solaris qPCR y mezcla maestra.Se calcularon los mismos niveles de expresión para dos dianas génicas en ambos laboratorios. Acabamos de mostrarle cómo preparar una reacción estándar de QPCR utilizando los reactivos de expresión génica Solaris QPCR. Al realizar este experimento, es importante recordar preparar mezclas maestras con la concentración final correcta de reactivos e incluir réplicas biológicas y/o técnicas apropiadas.Además, es fundamental configurar el instrumento de QPCR con las condiciones de termociclado correctas para Solaris. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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