Cuantitativas PCR en tiempo real utilizando el Thermo Scientific Solaris qPCR ensayo

En este artículo en video, se demuestra la PCR en tiempo real utilizando ensayos Solaris QPCR. Los ensayos Solaris QPCR son conjuntos de cebadores y sondas específicos para un gen, diseñados para detectar todas las variantes de empalme conocidas de un gen determinado. Bajo condiciones universales de termociclación, la sonda Solaris tiene un agente fijador del surco menor, un grupo funcional y un marcador FA en el extremo cinco prime, y un amortiguador oscuro eclipsado en el extremo tres prime.

Durante la etapa de desnaturalización de la PCR en tiempo real, la sonda permanece en solución y la fluorescencia del marcador FAM está apagada. Durante las fases de alineamiento y extensión, los cebadores de la sonda se unen a la secuencia diana y el apagador se separa del FAM. Entonces, el FAM emite una señal fluorescente intensa cuando la sonda se disocia; posteriormente, la fluorescencia vuelve a apagarse.

Se obtienen resultados de PCR en tiempo real que demuestran la sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de este ensayo eficiente. Hola, soy James Covino del equipo de Investigación y Desarrollo de Thermo Fisher Scientific en Lafayette, Colorado. Hoy les mostraremos un procedimiento para preparar una reacción QPCR estándar utilizando los reactivos de expresión génica Lars QPCR.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la inhibición de genes diana mediante tecnologías de interferencia del ARN. Así que comencemos. El ensayo Solaris QPCR STEM se define por su algoritmo único que utiliza tecnologías MGB y bases súper para proporcionar un ensayo único y conveniente para el 98 % de los genes anotados de humanos y ratones.

Normalmente, el diseño de sondas y cebadores de ADN está limitado por la temperatura de fusión de la sonda, que se determina por el número y tipo de bases. Las secuencias más largas y las ricas en GC presentan temperaturas de fusión más altas. La porción de unión al surco menor utilizada en las sondas Solaris se inserta en el surco menor de la hélice de ADN y estabiliza la interacción entre la sonda y la secuencia diana.

Esto aumenta la temperatura de fusión, lo que permite utilizar sondas más cortas. El algoritmo Solaris también incorpora selectivamente nucleótidos modificados denominados bases súper para mejorar la estabilidad de los enlaces AT y eliminar la autoasociación GG en secuencias ricas en guanina. Esto permite el uso de secuencias diana que de otro modo se evitarían.

La mayor flexibilidad de secuencia que confiere el uso de estas tecnologías permite diseñar conjuntos de cebadores y sondas que reconocen todas las variantes de empalme conocidas de un solo gen. Téngase en cuenta que siempre que sea posible se han incorporado regiones que abarcan uniones de exones en el sitio diana para aumentar la especificidad, evitando así la amplificación de ADN genómico contaminante. Los conjuntos resultantes de cebadores y sondas se analizan mediante blast utilizando tres bases de datos diferentes: genómica, transcripción y pseudogenes, para garantizar la especificidad. Además, los conjuntos de cebadores y sondas Solaris se han optimizado completamente, de modo que las condiciones de ciclado para todos los ensayos de PCR cuantitativa son idénticas, lo que permite evaluar la expresión de diversos transcritos en una sola corrida de PCR.

Para comenzar a planificar el experimento de qPCR R, identifique los reactivos necesarios para realizar la qPCR del gen de interés utilizando la búsqueda de productos Genius, disponible en thermo.com/solaris. Haga clic en el cuadro de consulta de búsqueda y seleccione el organismo diana adecuado. La búsqueda de productos Genius puede procesar muchos identificadores de genes diferentes. Aquí.

Introduzca uno de los términos de búsqueda sugeridos para el gen de interés, luego haga clic en buscar, identifique el gen de interés y haga clic en seleccionar en el lado izquierdo. Esto abrirá una ventana que muestra los diferentes reactivos disponibles para el gen de interés. Haga clic en la pestaña de detección de QPCR en el ensayo de expresión génica Solaris.

Se muestra un ensayo de cebador e hibridación de sonda Solaris diseñado óptimamente. Este único ensayo detectará todas las variantes de empalme conocidas del gen de interés. Una vez identificado el agente cebador apropiado, busque el termociclador QPCR que se utilizará en el menú e identifique la mezcla maestra compatible, ya sea la mezcla maestra con un vial separado de colorante pasivo de referencia rocks, la mezcla rocks o la mezcla baja en rocks.

Aquí utilizaremos el Roche Light Cycler 480, por lo que se empleará la mezcla maestra más el vial de rock. También es importante asegurarse de incluir un gen de referencia adecuado en este estudio. Se utilizará B2M una vez que se reciban todos los reactivos de Solaris QP CR.

Deben almacenarse a menos 20 grados Celsius hasta su uso. Los reactivos son estables durante al menos 12 meses. Debe evitarse la congelación y descongelación repetidas.

Prepare el ADNc para la PCR cuantitativa realizando reacciones de transcripción inversa sobre el ARN de la muestra. Una vez preparado el ADNc, descongele el ensayo Solaris y la mezcla maestra sobre hielo. La mezcla maestra contiene todos los componentes para la PCR cuantitativa excepto el ensayo específico del gen y los componentes de la plantilla, que incluyen termostato, ADN polimerasa dn, TPS rocks.

Si el instrumento de QPCR requiere piedras y un tampón de reacción exclusivo que contiene un colorante azul interno, también tenga a mano agua de grado PCR y placas de QPCR. Una vez que las soluciones se hayan descongelado, mézclelas agitándolas suavemente y luego centrifúguelas brevemente para evitar la pérdida de reactivo. A continuación, en un tubo de 15 mililitros, prepare una mezcla maestra del ensayo de QPCR Solaris 1x.

Al combinar el número deseado de muestras que se analizarán en una placa de 384 pocillos, agregue cinco microlitros de mezcla maestra 2x, 0,5 microlitros de ensayo Solaris 20X y agua libre de nucleasas para que el volumen final en cada pocillo sea de 10 microlitros. Después de añadir el ADNc, asegúrese de preparar suficiente mezcla para tres réplicas de cada muestra, incluyendo un control sin molde (NTC) y un control sin transcriptasa inversa (sin RT) para verificar la contaminación de los reactivos o la presencia de ADN genómico contaminante, respectivamente. A continuación, transfiera la mezcla a un depósito estéril.

Luego, utilizando un pipetador multicanal, transfiera el volumen adecuado de una mezcla maestra x a los pozos correspondientes de la placa de PCR. Si se utilizan placas blancas, el colorante azul interno incluido en la mezcla maestra ayudará a seguir el progreso del pipeteo. Se pueden analizar múltiples bibliotecas de ADNc y genes de referencia en la misma placa, ya que todas las condiciones de ciclado son idénticas.

Una vez que se haya añadido el mezcla maestra 1x a los pozos adecuados, agregue la plantilla de ADN diluida a cada pozo de modo que el volumen final sea de 10 microlitros; pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Selle la placa con un sello adhesivo o con un sello térmico, como se muestra aquí.

Coloque la placa en una centrífuga y centrifugue para hacer descender los reactivos al fondo del pocillo y eliminar cualquier burbuja que pueda interferir con las lecturas de fluorescencia. En el termociclador, la polimerasa con inicio en caliente presente en la mezcla maestra Solaris QPCR debe activarse a 95 grados Celsius durante 15 minutos, un ciclo, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 grados Celsius durante 15 segundos y una extensión a 60 grados Celsius durante 60 segundos. Este protocolo es el mismo para todos los ensayos Soliris QPCR, independientemente del gen que se esté amplificando.

Finalmente, coloque la placa en el instrumento de QPCR e inicie el programa. Esta figura demuestra el alto rendimiento de los ensayos Solaris aquí, se amplificaron 10 diluciones decimales de ADN sintético o ADNc utilizando los ensayos de expresión génica Solaris QPCR para CDC 20 y F two RL one, las curvas de amplificación en escala logarítmica y las curvas estándar para 10 diluciones log 10 demuestran el alto rendimiento del ensayo incluso a bajas concentraciones de entrada.

El rendimiento de cada ensayo se mide mediante el valor de eficiencia al cuadrado, el rango dinámico sobre 10, las diluciones log₁₀ y el límite inferior de detección. Los datos mostrados aquí demuestran la reproducibilidad de los ensayos Solaris. En este caso, alícuotas de ADNc se amplificaron en dos laboratorios separados geográficamente utilizando ensayos de expresión génica Solaris qPCR y mezcla maestra.

Se calcularon los mismos niveles de expresión para dos dianas génicas en ambos laboratorios. Acabamos de mostrarle cómo preparar una reacción estándar de QPCR utilizando los reactivos de expresión génica Solaris QPCR. Al realizar este experimento, es importante recordar preparar mezclas maestras con la concentración final correcta de reactivos e incluir réplicas biológicas y/o técnicas apropiadas.

Además, es fundamental configurar el instrumento de QPCR con las condiciones de termociclado correctas para Solaris. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.