Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

En este procedimiento, ARN marcado con fluorescencia. Las transcripciones se inyectan en XUS Cytes y se monitoriza su localización. En primer lugar, el ARN se marca con nucleótidos fluorescentes.

En una reacción de transcripción in vitro, el ARN se carga en un aparato de microinyección. Los ovocitos se colocan en una placa de inyección y se microinyectan cuidadosamente. Finalmente, los ovocitos se cultivan para permitir que se produzca la localización del ARN antes de obtener imágenes en el microscopio confocal.

Hola, soy James Gagnan del laboratorio de la Dra. Kimberly Mallory en el Departamento de Biología Molecular, biología celular y bioquímica de la Universidad de Brown. Hoy vamos a mostrarte un procedimiento para visualizar la localización del ARN subcelular en ovocitos Xap. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la arquitectura del ARN y los factores proteicos necesarios para la localización del ARN durante el desarrollo temprano de los vertebrados.

Así que comencemos. Para comenzar este procedimiento, transcriba el ARNm, que está marcado tanto radiactiva como fluorescentemente como se describe en el protocolo escrito adjunto. Agregue DS para degradar el ADN molde y, a continuación, detenga la reacción agregando EDTA.

Elimine los nucleótidos no incorporados y otras moléculas pequeñas girando a través de una columna G 50. A continuación, el ARN se concentra por precipitación de etanol, se lava y se vuelve a suspender. Después de determinar la concentración mediante el conteo de centelleo, diluya el ARN a 50 nano molares y almacene en alícuotas de cinco microlitros a menos 80 grados Celsius.

Cuando esté listo para realizar la microinyección, descongele un Eloqua del ARN marcado que se desnaturalice a 70 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, centrifugar durante 10 minutos a máxima velocidad en una microcentrífuga a temperatura ambiente para eliminar las partículas y mantener el hielo. A continuación, aísle los citos recortar trozos de ovario xap post lavu en un dos cónico de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de tres miligramos por mililitro.

Colagenasa en un tampón de fosfato de potasio 0,1 molar a pH 7,4. Agite suavemente a 18 grados centígrados debido a la variación de lote a lote. El tiempo de tratamiento con colagenasa puede variar y debe controlarse cuidadosamente mediante inspección visual.

Para asegurar la defoliación, continúe agitando durante 15 minutos o hasta que los ovocitos estén visiblemente separados del ovario, deje que los ovocitos se asienten en el fondo del tubo cónico. Retire la solución y reemplácela con un tampón MBSH. Repita esto, lave dos veces más para un total de tres lavados.

A continuación, clasifique manualmente la etapa tres a cuatro CYTES y el tampón MBSH bajo un microscopio óptico estándar. Los citos de la etapa tres son completamente opacos, pero blancos. Mientras que los citos de la etapa cuatro son ligeramente más grandes y moteados de pigmento.

Los citos que son ligeramente transparentes son demasiado jóvenes y los citos que están completamente pigmentados o exhiben una distribución de pigmento polarizada son demasiado viejos. Finalmente, prepare las agujas para la microinyección utilizando capilares de tres pulgadas y media tirando y biselando para hacer agujas con un diámetro exterior de aproximadamente 0,05 milímetros. Ahora que los ovocitos de ARNm y las agujas están listos, proceda a la microinyección.

Comience calibrando la aguja con agua desy para administrar dos nanómetros por inyección. Frente. Cargue la aguja con un microinyector controlado por gas y calibre el tamaño de la gota con un micrómetro después de la calibración, cargue frontalmente el ARN que se inyectará en la aguja. A continuación, coloque los ovocitos clasificados en una placa de inyección En el tampón MBSH, la placa contiene una capa de goma espuma negra.

El cite blanco destaca bien sobre un fondo negro. A continuación, inyecte cuidadosamente cada ovocito dos litros de ARN a 50 nanomolares. Asegúrese de inyectar cada ovocito una sola vez y revise la aguja regularmente para ver si se ha obstruido cuando se complete la inyección.

Expulse el ARN restante, enjuague la aguja con agua y cargue el siguiente ARN para la inyección. Después de la inyección, transfiera los citos inyectados a un pocillo de una placa estéril de 24 pocillos hasta mil. Los CYTES se pueden cultivar por pocillo.

Retire el tampón y reemplácelo con 400 microlitros de medio de cultivo de citos por pocillo. A continuación, coloque la placa de cultivo dentro de un recipiente de plástico con una toalla de papel húmeda para mantener un ambiente húmedo durante el cultivo, incube los ovocitos a 18 grados centígrados durante un intervalo de tiempo que oscile entre ocho y 48 horas después del período de incubación deseado. Los ovocitos se pueden preparar para la microscopía después de la incubación de los ovocitos inyectados.

Separe los ovocitos muertos y coloque los ovocitos sobrevivientes en frascos de vidrio. La supervivencia de más del 90% de los ovocitos se observa de forma rutinaria. Reemplace el tampón con el fijador M-E-M-F-A y meca los citos durante 20 minutos.

Proteger los ovocitos de la luz solar durante la fijación una vez finalizado el período de fijación. Lave los ovocitos retirando el fijador y reemplazándolo con un volumen igual de tampón MBSH. Repita este lavado una vez más para un total de dos lavados.

A continuación, lave los ovocitos hasta convertirlos en metanol anhidro. Primero, retire la mitad del volumen y reemplácelo con metanol. Repite esto dos veces más.

Después de estos lavados, retire toda la solución y reemplácela con metanol. Repita este lavado con metanol una vez más. Los ovocitos fijos y deshidratados pueden almacenarse a menos 20 grados centígrados hasta que estén listos para la obtención de imágenes.

Antes de la toma de imágenes, agregue el medio de limpieza de Marie a una placa de fluorescencia WPI con fondo de vidrio para cubrir la superficie de la imagen. Transfiera cuidadosamente los ovocitos del metanol a la placa de flúor, minimizando el volumen de metanol transferido a la imagen de los ovocitos en un microscopio confocal invertido, tanto un Zeiss LSM five 10 como aica TCSs P dan buenos resultados. Ahora mostraremos algunas imágenes representativas de la localización del ARN subcelular inmediatamente después de la microinyección: el ARN fluorescente se puede ver en el núcleo después de ocho horas de cultivo de control marcado con fluorescencia.

ARN se puede ver distribuido uniformemente en el citoplasma del ovocito. Sin embargo, en el proceso de localización subcelular hasta el polo vegetal del ovocito se puede observar un ARN marcado con fluorescencia que contiene secuencias que reclutan la maquinaria de transporte. Acabamos de mostrarle cómo microinyectar ARN marcados con fluorescencia en citos zap y observar la localización del ARN mediante microscopía confocal.

Al realizar este procedimiento, es importante utilizar soluciones tratadas con deci para evitar la contaminación de los ARN en el cultivo, sus citos en OCM que contienen antibióticos, y para proteger sus citos de la luz solar siempre que sea posible para evitar el fotoblanqueo. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.