Name: Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprende a visualizar el transporte de ARN en ovocitos de Xenopus mediante microinyección y microscopía confocal. Este método permite estudiar la localización subcelular del ARN en tiempo real.

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Nuestro trabajo en la localización del ARN es apoyado por una subvención del NIH (R01GM071049) de KLM.

Parte 1: La transcripción de ARNm marcado con fluorescencia. <ol><li> Linealizar el plásmido de ADN que contiene el elemento de localización del ARN o la secuencia pertinente y resuspender en 1 mg / l con DEPC tratados con H 2 O. La plantilla de ADN debe tener sitios aguas arriba promotor de la transcripción T7, SP6, T3 o ARN polimerasa. </li><li> Añadir los siguientes reactivos a un tubo de 1,5 ml estéril: <table><tbody><tr><td> a. 10X buffer Tx (ver M &amp; M) </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> b. 20X tapa / mezcla de NTP (ver M &amp; M) </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen) </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> d. UTP, [α-32P] (1 Ci / l) (Perkin Elmer) </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> e. DEPC-H 2 O </td><td> 11 l </td></tr><tr><td> f. 0,2 M TDT </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> g. RNasin (Promega) </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> h. la plantilla de ADN lineal </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> i. ARN polimerasa (Promega) </td><td> 1 l </td></tr></tbody></table></li><li> Mezclar los reactivos con cuidado y centrifugar brevemente (10 seg. En una microcentrífuga). </li><li> Incubar durante 2-4 horas a 37 ° C, que cubre el tubo con papel de aluminio para evitar que photobleaching de fluoróforo. </li><li> Añadir 1 l de 1 mg / ml RNasa libre de DNasa (Promega) que degradan el ADN de la plantilla. </li><li> Incubar 15 minutos a 37 ° C. </li><li> Agregar 79 l 20 mM EDTA (pH 8,0) para detener la reacción. </li><li> Quitar un l a un tubo por separado, etiquetados como "entrada" y guardar. </li><li> Girar la reacción a través de una columna de 1 ml G50 (ver Materiales y Métodos), que incluye los nucleótidos no incorporados, excluyendo de ARNm de larga duración. </li><li> Concentrar el ARN mediante precipitación con etanol: <ol class="lalpha"><li> Añadir 250 l de etanol 100%, 10 l 7 millones de CH 3 COONH 4, 1 l transporte del ARN (tRNA de levadura, 10 g / l) o una de glucógeno l (20 mg / ml). </li><li> Mezclar bien y congelar hasta que esté sólido a -80 ° C durante&gt; 30 minutos o en hielo seco durante 15 minutos. </li><li> Vuelta a la máxima velocidad en microcentrífuga durante 15 minutos, el sobrenadante se decanta. </li><li> Lavar con 150 ml de etanol al 75%. </li><li> Girar durante 3 minutos a máxima velocidad en microcentrífuga, se decanta el sobrenadante. </li><li> Secar el pellet a 37 ° C durante 3 minutos, asegurándose de que todo el etanol se ha evaporado. </li></ol></li><li> Resuspender en 11 l DEPC-H 2 O y eliminar un l a un tubo por separado, etiquetados como "incorporados". </li><li> Determinar la incorporación por ciento y se diluye el ARN de 50 nm (ver Materiales y Métodos para el cálculo). </li><li> El ARN se deben congelar en alícuotas de 5 l, para un solo uso para evitar la congelación / descongelación ciclos y se puede almacenar durante varias semanas a -80 ° C. </li></ol> Parte 2: Preparación para la microinyección. <ol><li> ARN de preparación: Descongelar una alícuota de ARN (50 nM), y desnaturalizar el ARN a 70 ° C durante 3-5 minutos. Girar durante 10 minutos en microcentrífuga a temperatura ambiente a la máxima velocidad para eliminar cualquier partícula, y mantener en hielo. </li><li> Ovocito de preparación: <ol class="lalpha"><li> Extraer quirúrgicamente del ovario de Xenopus laevis mujeres (Nasco). </li><li> Piezas especiales de Xenopus laevis ovario en un tubo cónico de 50 ml que contienen 25 ml de solución de colagenasa (ver Materiales y Métodos). </li><li> Agitar suavemente a 18 ° C durante 15 minutos, o hasta que los ovocitos son visiblemente separados del ovario. Debido a la variación entre lotes, el tiempo de la colagenasa tratamiento puede variar y deben ser vigilados cuidadosamente a través de inspección visual para defoliculation. </li><li> Permita que los ovocitos que se establecen en el tubo, retirar la solución y lavar los ovocitos con tampón MBSH (ver Materiales y Métodos). </li><li> Repetir el lavado dos veces más para un total de tres lavados. Este protocolo de aislamiento de los ovocitos es similar a la que se detalla en Cohen et al., 2009. </li><li> Manual tipo estadio III / IV ovocitos (Dumont, 1972) en tampón MBSH bajo un microscopio de disección estándar. Etapa III ovocitos son completamente opacos, pero de color blanco, mientras que la etapa IV ovocitos son ligeramente más grandes y pintados con un pigmento. Los ovocitos que son un poco transparentes son demasiado jóvenes y que los ovocitos completamente pigmentados o distribución presentan pigmento polarizados son demasiado viejos. </li></ol></li><li> Aguja de preparación: Pull and agujas de bisel a un diámetro exterior de ~ 0,05 mm. (Usamos Drummond Científico de 3,5 pulgadas capilares (para n º 3-000-203-G / X), un Sutter Instrument Co. micropipeta extractor y una biseladora WPI Inc.). </li></ol> Parte 3: Microinyección <ol><li> Calibrar la aguja con DEPC-H 2 O 2 para entregar nl por inyección. Estamos frente a la carga con una aguja de nuestra microinyector impulsadas por gas (ver Materiales y Métodos), y calibrar el tamaño de gota con un micrómetro. </li><li> La carga de ARN utilizando una aguja. </li><li> Lugar ordenados ovocitos en un plato de inyección que contiene tampón MBSH. Nos microinject en un plato con una capa de espuma de caucho negro. Los ovocitos pálido destacan también en un blanco background. </li><li> Con cuidado, se inyectan cada ovocito con 2 nl de ARN de 50 nm. </li><li> Expulsar a ARN, enjuague la aguja con DEPC-H 2 O, y carga de ARN para la inyección siguiente. </li></ol> Parte 4: Cultura de ovocitos <ol><li> Ovocitos a cabo en un pocillo de una placa estéril 24 y (Sigma Aldrich). Nos cultura hasta un millar de ovocitos por pocillo. </li><li> Quitar búfer y reemplazar con 400 l O ocyte C ultura edium M (OCM; ver Materiales y Métodos) por pocillo. Coloque la placa de la cultura dentro de un recipiente de plástico hermético con una toalla de papel húmeda para mantener el ambiente húmedo durante el cultivo. </li><li> Incubar los ovocitos a 18 ° C para los puntos de tiempo que oscila entre 8 y 48 horas. </li></ol> Parte 5: fijación, deshidratación y almacenamiento de ovocitos <ol><li> Resolver cualquier ovocitos muertos y el lugar ovocitos supervivientes en frascos de vidrio. En forma rutinaria observar la supervivencia&gt; 90%. </li><li> Ovocitos lugar en MEMFA fijación (véase Materiales y Métodos) y el rock durante 20 minutos. Proteger a los ovocitos de la luz cubriendo con papel de aluminio. </li><li> Lavado de los ovocitos mediante la eliminación de fijador y su sustitución con un volumen igual de tampón de MBSH. Repetir este lavado una vez más para un total de dos lavados. </li><li> Lavado de los ovocitos en metanol anhidro: <ol class="lalpha"><li> Eliminar la mitad del volumen, reemplazar con metanol. </li><li> Repita el paso "a" dos veces. </li><li> Eliminar toda la solución, reemplace con metanol. </li><li> Repetir el lavado de metanol. </li></ol></li><li> Los ovocitos se pueden almacenar a -20 ° C hasta el momento de la imagen. </li></ol> Parte 6: Imagen de localización del ARN por microscopía confocal <ol><li> Antes de imágenes, añadir media Murray s de Compensación (2:1 benzoato de bencilo, alcohol bencílico) a un FluoroDish con fondo de cristal (WPI Inc.) para cubrir la superficie de la imagen. </li><li> Con cuidado, la transferencia de los óvulos a partir de metanol para FluoroDish, minimizando el volumen de metanol transferidos. </li><li> La imagen en un microscopio confocal invertido (Hemos utilizado con éxito un LSM510 Zeiss y una Leica TCS SP2). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1704/1704fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1:.. Visualización de la localización subcelular de ARN mediante la microinyección de transcripciones Fluorescente etiquetados microinyección A. A continuación, el ARN marcado con Alexa Fluor 546 es un principio restringido al núcleo B. Después de ocho horas de la cultura, una etiqueta fluorescente del ARN de control puede ser visto de manera uniforme distribuidos en el citoplasma del ovocito. C. Sin embargo, el ARN marcado con fluorescencia que contiene secuencias que reclutar a la maquinaria de transporte se puede ver en el proceso de localización subcelular al polo vegetal del oocito (hacia abajo). Barra de escala = 50 micras.

<ol><li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li>
<li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+transport+in+ovo%3A+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li>
<li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li>
<li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTB%2FhnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li>
<li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li>
<li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li>
<li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li>
</ol>

Los experimentos con animales de laboratorio se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Universidad de Brown.

Aquí hemos presentado un protocolo para visualizar la localización del mRNA en ovocitos de Xenopus. Este método, usando la etiqueta fluorescente transcripciones de ARN tiene una mayor relación señal-ruido de lo que se obtiene con la marcada con digoxigenina transcripciones y es más sencillo y más rápido de lo in-situ los enfoques basados ​​en (Mowry y Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Usando este método, podemos diseñar ARN secuencia de mutaciones y rápida prueba para la función in vivo. A...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X buffer Tx <ul><li class="none"> 60 mM MgCl 2 </li><li class="none"> 400 mM Tris-HCl (pH 7,5) </li><li class="none"> 20 mM espermidina-HCl </li></ul> 20x tapa / NTP mezcla <ul><li class="none"> 10 mM CTP </li><li class="none"> 10 mM ATP </li><li class="none"> 9 mM UTP </li><li class="none"> 2 mM GTP </li><li class="none"> 20 mM G (ppp) G Cap analógica (New England Biolabs) </li></ul> G-50 columna <ul><li class="none"> 5 g de hidratos de Sephadex G-50 cuentas (Sigma Aldrich) en 100 mL de agua desionizada H 2 O. DEPC de tratar durante 30 minutos. y autoclave. Tienda de archivo incompleto a temperatura ambiente. Antes de usar, agregar lo siguiente RNasa libre de las soluciones: </li><li class="none"> 0,5 ml de 0,2 M EDTA </li><li class="none"> 1 ml 1 M Tris pH 8,0 </li><li class="none"> 0,5 ml de 20% SDS </li><li class="none"> Tienda completa G-50 la solución a 4 ° C. </li><li class="none"> Retire y deseche el émbolo de una jeringa de 3 ml (BD Biosciences) y colocar el cilindro de la jeringa en un tubo cónico de 15 ml (Corning). Conecte la jeringa con una pequeña cantidad de lana de vidrio (un enchufe cerca de la mitad del tamaño de un centavo). </li><li class="none"> Remolino completa solución de G-50 para volver a suspender cuentas. </li><li class="none"> Añadir 2 ml de solución de G-50 a la columna vacía. </li><li class="none"> Giro de 1 minuto a 1000 x g en centrífuga de mesa. </li><li class="none"> Añadir 200 l tratada con DEPC H2O desionizada a cada columna. Spin. </li><li class="none"> Repetir el lavado dos veces más para un total de tres lavados. </li><li class="none"> Retire el cuerpo de la jeringa a un nuevo tubo de 15 ml cónicos. </li></ul> Colagenasa solución <ul><li class="none"> 75 mg de colagenasa de Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) </li><li class="none"> 25 ml 0,1 M KPO 3 + (pH 7,4) </li></ul> MBSH buffer <ul><li class="none"> 88 mM NaCl </li><li class="none"> 1 mM KCl </li><li class="none"> 2,4 mM de NaHCO3 </li><li class="none"> 0,82 mM MgSO 4 7H 2 O X </li><li class="none"> 0,33 mM Ca (NO 3) 2 X 4 H 2 O </li><li class="none"> 0,41 mM CaCl 2 X 6 H 2 O </li><li class="none"> HEPES 10 mM (pH 7,6) </li></ul> Ovocito medio de cultivo <ul><li class="none"> 50% L15 </li><li class="none"> 15 mM HEPES (pH 7,6) </li><li class="none"> 1 mg / ml de insulina </li><li class="none"> 100 mg / ml de gentamicina </li><li class="none"> 50 U / ml de nistatina </li><li class="none"> 50 U / ml de penicilina </li><li class="none"> 50 mg / ml de estreptomicina </li></ul> MEMFA solución <ul><li class="none"> 0,1 M MOPS (pH 7,4) </li><li class="none"> 2 mM EGTA </li><li class="none"> 1 mM MgSO 4 </li><li class="none"> 3,7% de formaldehído </li></ul> Informática ARN rendimiento <ul><li class="none"> Determinar CPM en la &quot;entrada&quot; y &quot;incorporado&quot; las muestras usando un contador de centelleo estándar. </li><li class="none"> incorporación = (&quot;incorporados&quot;) / (10 x &quot;de entrada&quot;) </li><li class="none"> Los valores típicos de la incorporación rango entre ~ 0,03 y 0,10. </li><li class="none"> El rendimiento máximo teórico de diferentes polimerasas: T7, T3, SP6 - 2,64 mg </li><li class="none"> Reacción de rendimiento en mg = (rendimiento máximo de la polimerasa utilizada) X (incorporación) </li><li class="none"> Diluir el ARN de 50 nm = (ug RNA) / 320 / (longitud del ARN en las bases) / (5X10 -8) </li><li class="none"> La reacción suele producir ~ 50 a 100 l de ARN de 50 nm. </li></ul>

visualizar la localización del arn en xenopus los ovocitos

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Localización del ARN es un mecanismo conservado del establecimiento de la polaridad celular. Vg1 ARNm se localiza en el polo vegetal de ovocitos de Xenopus laevis y actúa para restringir el espacio de expresión génica de la proteína Vg1. El control estricto de Vg1 distribución de esta forma es necesaria para la especificación adecuada capa germinal en el embrión en desarrollo. Elementos de la secuencia de ARN en el 3 &#39;UTR del ARNm, el elemento de localización Vg1 (VLE) son necesarios y suficientes para el transporte directo. Para estudiar el reconocimiento y el transporte de Vg1 ARNm in vivo, hemos desarrollado una técnica que permite un amplio análisis de trans-factor de los mecanismos de transporte dirigido a través de una lectura visual simple. Para visualizar la localización del ARN, que sintetiza la etiqueta fluorescente del ARN VLE y microinject esta transcripción en oocitos individual. Después del cultivo de ovocitos para permitir el transporte del ARN se inyecta, los ovocitos son fijos y deshidratado antes de la imagen por microscopía confocal. Visualización de patrones de localización del ARNm proporciona una lectura para el control de la vía completa de ARN de transporte y para la identificación de los roles en la dirección de ARN de transporte para el cis-elementos que actúan en la transcripción y factores de trans-acción que se unen a los VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Hemos ampliado esta técnica a través de co-localización con ARN y las proteínas adicionales (Gagnon y Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), y en combinación con la interrupción de las proteínas motoras y el citoesqueleto (Messitt et al., 2008) de la sonda de mecanismos que subyacen a la localización del ARNm.

La visualización de<em&gt; In vivo</em&gt; ARN de transporte se realiza mediante la microinyección de la etiqueta fluorescente en las transcripciones de ARN<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocitos, seguido por microscopía confocal.

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

La localización del ARN es un mecanismo conservado para establecer la polaridad celular. El ARNm de Vg1 se localiza en el polo vegetal de los ovocitos de Xenopus laevis y actúa para...

En este procedimiento, el ARN marcado con fluorescencia. Los transcritos se inyectan en los ocitos de XUS y su localización se monitorea. Primero, el ARN se marca con nucleótidos fluorescentes.En una reacción de transcripción in vitro, el ARN se carga luego en un aparato de microinyección. Los ovocitos se colocan en una placa de inyección y se microinyectan cuidadosamente. Finalmente, los ovocitos se cultivan para permitir que ocurra la localización del ARN antes de la obtención de imágenes mediante microscopía confocal.Hola, soy James Gagnan del laboratorio de la Dra. Kimberly Mallory en el Departamento de Biología Molecular, Biología Celular y Bioquímica de la Universidad de Brown. Hoy les mostraremos un procedimiento para visualizar la localización subcelular de ARN en ovocitos de Xap. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la arquitectura del ARN y los factores proteicos necesarios para la localización del ARN durante el desarrollo temprano de los vertebrados.Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, transcriba el ARNm, que está marcado de forma radiactiva y fluorescente según se describe en el protocolo escrito adjunto. Añada DS para degradar el ADN molde y luego detenga la reacción añadiendo EDTA.Elimine los nucleótidos no incorporados y otras moléculas pequeñas centrifugando a través de una columna G 50. Luego, se concentra el ARN mediante precipitación con etanol, se lava y se resuspende. Después de determinar la concentración mediante recuento de centelleo, diluya el ARN hasta 50 nanomolar y almacénelo en alícuotas de cinco microlitros a menos 80 grados Celsius.Cuando esté listo para realizar la microinyección, descongele un Eloqua del ARN marcado y desnature a 70 grados Celsius durante cinco minutos. Luego, centrifugue durante 10 minutos a velocidad máxima en una microcentrífuga a temperatura ambiente para eliminar partículas y mantenga en hielo. A continuación, aísle los cistos, corte trozos de ovario xap post lavu en un cónico de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de tres miligramos por mililitro.Colagenasa en un tampón de fosfato de potasio 0,1 molar a pH 7,4. Agitar suavemente a 18 grados Celsius debido a la variación entre lotes. El tiempo de tratamiento con colagenasa puede variar y debe monitorearse cuidadosamente mediante inspección visual.Para asegurar la defoliación, continúe agitando durante 15 minutos o hasta que los ovocitos se separen visiblemente del ovario; permita que los ovocitos sedimenten en el fondo del tubo cónico. Retire la solución y sustitúyala por tampón MBSH. Repita este paso, lavando dos veces más para un total de tres lavados.A continuación, clasifique manualmente los cistos de estadio tres a cuatro en tampón MBSH bajo un microscopio óptico estándar. Los cistos de estadio tres son completamente opacos, pero de color blanco. Mientras que los cistos de estadio cuatro son ligeramente más grandes y moteados con pigmento.Los ovocitos que son ligeramente transparentes son demasiado jóvenes y los ovocitos que están completamente pigmentados o presentan una distribución polarizada del pigmento son demasiado viejos. Finalmente, prepare las agujas para la microinyección utilizando capilares de tres pulgadas y media, estirándolos y biselándolos para fabricar agujas con un diámetro externo de aproximadamente 0,05 milímetros. Ahora que los ovocitos con ARNm y las agujas están listos, proceda a la microinyección.Comience calibrando la aguja con agua desionizada para administrar dos nanómetros por inyección. Cargue la aguja utilizando un microinyector controlado por gas y calibre el tamaño de la gota usando un micrómetro. Después de la calibración, cargue por delante el ARN que se va a inyectar en la aguja. A continuación, coloque los ovocitos clasificados en un platillo de inyección con tampón MBSH; el platillo contiene una capa de espuma de caucho negro.Los ovocitos blancos se destacan bien sobre un fondo negro. Luego, inyecte cuidadosamente cada ovocito con dos litros de ARN a 50 nanomolares. Asegúrese de inyectar cada ovocito solo una vez y verifique regularmente la aguja en busca de obstrucciones cuando la inyección haya finalizado.Expulse el ARN restante, enjuague la aguja con agua desionizada y cargue el siguiente ARN para la inyección. Después de la inyección, transfiera los ovocitos inyectados a un pocillo de una placa estéril de 24 pocillos hasta un máximo de mil. Los OVOCITOS pueden cultivarse por pocillo.Retire el tampón y sustitúyalo con 400 microlitros de medio de cultivo celular por pocillo. Luego, coloque la placa de cultivo dentro de un recipiente de plástico con una toalla de papel húmeda para mantener un ambiente húmedo durante el cultivo, e incube los ovocitos a 18 grados Celsius durante períodos que varían entre ocho y 48 horas tras el período de incubación deseado. Los ovocitos pueden prepararse para microscopía tras la incubación de los ovocitos inyectados.Separar las ovocélulas muertas y colocar las ovocélulas viables en viales de vidrio. Habitualmente se observa una supervivencia superior al 90 % de las ovocélulas. Reemplazar el tampón con fijador M-E-M-F-A y agitar suavemente las células durante 20 minutos.Proteja los ovocitos de la luz solar durante la fijación una vez completado el período de fijación. Lave los ovocitos eliminando el fijador y reemplazándolo con un volumen igual de tampón MBSH. Repita este lavado una vez más para un total de dos lavados.A continuación, lave los ovocitos con metanol anhidro. Primero, retire la mitad del volumen y reemplácelo con metanol. Repita este paso dos veces más.Después de estos lavados, retire toda la solución y sustitúyala por metanol. Repita este lavado con metanol una vez más. Los ovocitos fijados y deshidratados pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius hasta que estén listos para ser analizados mediante imágenes.Antes de la obtención de imágenes, agregue el medio de aclarado de Marie a un platillo fluoro de fondo de vidrio de WPI para cubrir la superficie de imagen. Transfiera cuidadosamente los ovocitos del metanol al platillo fluoro, minimizando el volumen de metanol transferido. Observe los ovocitos en un microscopio confocal invertido; tanto el Zeiss LSM five 10 como el aica TCSs P ofrecen buenos resultados. Ahora mostraremos algunas imágenes representativas de la localización subcelular de ARN inmediatamente después de la microinyección: se puede observar ARN fluorescente en el núcleo tras ocho horas de cultivo del control marcado con fluorescencia.El ARN puede observarse distribuido uniformemente en el citoplasma del ovocito. Sin embargo, un ARN marcado con fluorescencia que contiene secuencias capaces de reclutar el mecanismo de transporte puede observarse en proceso de localización subcelular hacia el polo vegetal del ovocito. Acabamos de mostrarle cómo microinyectar ARNs marcados con fluorescencia en ovocitos y observar la localización del ARN mediante microscopía confocal.Al realizar este procedimiento, es importante utilizar soluciones tratadas con DEPC para evitar la contaminación por ARN en el cultivo, mantener sus citoocitos en OCM que contenga antibióticos y proteger sus citoocitos de la luz solar siempre que sea posible para evitar el blanqueamiento fotográfico. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

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Uso de la sola molécula fluorescente en Situ del hibridación (SM-pescado) para cuantificar y Localize mRNAs en oocitos murinos

Este protocolo tiene como objetivo demostrar cómo microinyectar una mezcla de ADN/DOTAP en los auriculares de embriones Xenopus laevis de un día de edad, y cómo imagen y reconstrucción de proteínafluorescentes verdes individuales (GFP) expresando árboles axonales ópticos en intactos, los renacuajos vivos de Xenopus.

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Describimos un método para la preparación y obtención de imágenes en vivo de extractos citoplasmáticos sin diluir de huevos de Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparación de extracto de huevo y métodos de imágenes en vivo para visualizar la organización citoplasmática dinámica

Este protocolo proporciona un marco experimental para documentar el impacto físico del citoesqueleto en la forma nuclear y los orgánulos internos sin membrana en el sistema de ovocitos de ratón. El marco se puede adaptar para su uso en otros tipos de células y contextos.

Captura de la agitación basada en el citoesqueleto del núcleo del ovocito de ratón a través de escalas espaciales

Describimos métodos para visualizar la transcripción naciente durante la activación del genoma cigótico en células individuales durante la embriogénesis temprana.

Visualización de la activación del genoma cigótico en células individuales de embriones tempranos

Aprende a visualizar el transporte de ARN en ovocitos de Xenopus mediante microinyección y microscopía confocal. Este método permite estudiar la localización subcelular del ARN en tiempo real.

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

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