Name: La obtención de hemocitos de la hawaiana Squid Bobtail Euprymna scolopes Y la observación de su adhesión a las bacterias simbióticas y no simbióticas- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-11T04:52:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Aprende a extraer hemocitos de Euprymna scolopes para estudiar la adhesión bacteriana mediante marcadores fluorescentes. Este método permite visualizar interacciones célula-bacteria en microscopía confocal.

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Fuentes de financiación: Universidad de Connecticut, Fundación para la Investigación y el Departamento de Biología Molecular y Celular de SVN, Sigma Xi Grant-in-Ayuda de Investigación y Antonio H. y R. Majorie Romano de Educación para Graduados de Becas para AJC

<ol><li> Preparar 500 mL de 0,22 micras, esterilizada por filtración de agua de mar artificial (FSW, la salinidad de 35 ppt). Filtro de agua de mar artificial o natural a través de un filtro de 0,22 micrones micras para eliminar las partículas y bacterias. </li><li> Anestesiar a un adulto de Hawai bobtail calamar (Euprymna scolopes) mediante la colocación de una solución al 2% de etanol en agua de mar. Colocar el animal en la anestesia por aproximadamente 10 minutos. El calamar dejará de nadar y no responden activamente al tacto. La respiración continua, indicado por el movimiento del manto, y la actividad de los cromatóforos aún deben ser observados. </li><li> Colocar los calamares con la parte ventral hacia arriba en una bandeja de cera de la disección estándar. Sumerja el animal con FSW que contiene 2% de etanol. </li><li> Utilizando un estándar de 200 puntas de pipeta l, retire el embudo y el manto de exponer el principal vaso sanguíneo cefálico ubicada entre los dos ojos. </li><li> Utilizando una aguja estéril jeringa de 1 ml con aguja de calibre 26.5, la punción de los vasos sanguíneos cefálica y retirar entre 50 a 100 l de la hemolinfa. Lugar de la hemolinfa en un tubo estéril de 1,5 ml en hielo. Nota: Si un animal servirá como un momento de múltiples donantes, sólo retirar 10-20 l de hemolinfa en un momento dado. Devolver el animal a un tanque de agua de mar normal. El animal será revivir a los 30 minutos. </li><li> Hemocitos recién recogidas se lavan y se re-suspendió en 500 l de solución de Ringer Squid s (S-Ringer, 530 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM MgCl 2, 10 mM CaCl 2 y tampón HEPES 10 mM, pH 7,5). </li><li> Las concentraciones de hemocitos son determinados por hemocitómetro, y aproximadamente 2.000 células se añaden a resbalones cámaras cubierta de vidrio, y permite que se adhieran al vidrio durante 10 minutos a temperatura ambiente. A esta densidad, los hemocitos formar una monocapa uniforme en la superficie de lámina de vidrio. </li><li> Para observar las bacterias unión a hemocitos anfitrión, hemocitos están expuestos a una cepa bacteriana marcado con fluorescencia, como Vibrio fischeri ES114 y / o Vibrio harveyi B392, cada uno con un reportero de verde fluorescente. V. ES114 fischeri y V. harveyi B392 se producen a mitad de la fase de registro en un mar de agua medios triptona (SWT) a 28 ° C en un agitador orbital. La densidad óptica a 600 nm se mide espectrofotométricamente para determinar la densidad celular. Las bacterias se sedimentaron por centrifugación (5.000 rpm durante 5 min), se desecha el sobrenadante y el pellet se resuspendió en S-Ringer. </li><li> 100.000 células bacterianas se añaden a cada cámara y por lo que hay 50 bacterias por hemocitos en promedio. Los hemocitos / mezclas de bacterias se incubaron en solución de Ringer S-s a 25 ° C durante 1 hora, un tiempo determinado para obtener el máximo nivel de la unión. </li><li> El citoplasma de los hemocitos son luego teñidas con fluorescencia CellTracker 0,005% Naranja (Invitrogen) y luego se lavan en el S-Timbres para visualizar las células. </li><li> Hemocitos teñidos con bacterias asociadas son vistos por fluorescencia utilizando un estereoscopio Zeiss Descubrimiento V20 fluorescente o un microscopio láser confocal Leica SP2 espectral, y enumeró toda la superficie de la célula animal. </li></ol> Resultados representante Debido a la hemolinfa cefalópodos contiene hemocianina extracelular y no la hemoglobina, la oxigenación, la hemolinfa se vuelve azul oscuro. Un promedio de ~ 5000 hemocitos por l de la hemolinfa se obtiene con este método. Después de la adhesión a la cubierta se desliza la recámara y la tinción fluorescente, los hemocitos debe aparecer brillante fluorescente de color rojo y ameboides en forma. Para la adhesión bacteriana, V. fischeri se adhieren bien a los hemocitos (1-2 células bacterianas por células de la sangre), mientras que V. harveyi se adhieren fuertemente (10-15 células bacterianas por hemocitos). <img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Adultos Hawaii calamar bobtail Euprymna scolopes muestra la posición de los vasos sanguíneos cefálica. <img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Resultados de la exposición de hemocitos de Vibrio fischeri (A) y Vibrio harveyi (B). Rojos, glóbulos Rastreador de naranja, verde, GFP-etiquetados bacterias.

<ol><li>Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+host+hemocytes+during+the+initiation+of+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis.</a> Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).</li>
<li>McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unseen+forces%3A+the+influence+of+bacteria+on+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unseen forces: the influence of bacteria on animal development.</a> Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).</li>
<li>McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiont+recognition+and+subsequent+morphogenesis+as+early+events+in+an+animal-bacterial+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism.</a> Science. 254, 1491-1494 (1991).</li>
<li>Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+between+symbiotic+Vibrio+fischeri+and+the+haemocytes+of+Euprymna+scolopes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes.</a> Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winnowing%3A+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).</li>
<li>Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+animal-bacterial+association%3A+recruiting+symbiotic+Vibrios+from+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+the+light-organ+microenvironment+of+Euprymna+scolopes%3A+description+of+a+population+of+host+cells+in+association+with+the+bacterial+symbiont+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri.</a> Biol Bull. 195, 89-97 (1998).</li>
<li>Visick, K. L., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+fischeri+and+its+host%3A+it+takes+two+to+tango%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).</li>
</ol>

Estudios sobre el papel del sistema inmune en la mediación de señalización molecular entre bacterias beneficiosas y sus anfitriones tienen, en los últimos años, hizo importantes contribuciones a nuestra comprensión de la co-evolución de los eucariotas con la microbiota presente. El sistema de squid / vibrio ha demostrado ser un sistema modelo manejable para responder preguntas fundamentales en este campo 2,3,5,6,8. La luz de los órganos del calamar scolopes Euprymna permite la colonización exclusivam...

<table><tbody><tr><td>Sistema de cubreobjetos de borosilicato nº 1.0 con cámara (8 cámaras)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina de 1 ml sin látex, calibre 26,5 G</td><td>BD Biosciences</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio SteREO Discovery V20</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la obtención de hemocitos de la hawaiana squid bobtail euprymna scolopes y la observación de su adhesión a las bacterias simbióticas y no simbióticas-

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Estudios sobre el papel del sistema inmune en la mediación de señalización molecular entre bacterias beneficiosas y sus anfitriones tienen, en los últimos años, hizo importantes contribuciones a nuestra comprensión de la co-evolución de los eucariotas con la microbiota presente. La asociación simbiótica entre el hawaiano calamar bobtail,<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt; Y la bacteria bioluminiscente<em&gt; Vibrio fischeri</em&gt; Se ha utilizado como un sistema modelo para entender los efectos de las bacterias beneficiosas en el desarrollo animal. Estudios recientes han demostrado que los macrófagos-hemocitos, el único componente celular del sistema inmune innato del huésped calamar, probablemente juegan un papel importante en la mediación de la creación y el mantenimiento de esta asociación. Este protocolo se mostrará cómo obtener hemocitos de<em&gt; E. scolopes</em&gt; Y luego usar estas células en ensayos de unión bacteriana. Adultos calamar son los primeros anestesiados antes de la hemolinfa se recoge con una jeringa de los vasos sanguíneos principales cefálica. Los hemocitos de acogida, contenida en la hemolinfa extraída, se adhieren a cubreobjetos de vidrio de cámara y luego se exponen a la proteína verde fluorescente marcada con simbiótica<em&gt; Vibrio fischeri</em&gt; Y no simbiótica-<em&gt; Vibrio harveyi</em&gt;. Los hemocitos son contrastados con un tinte fluorescente (celular Rastreador de Orange, Invitrogen) y luego se visualizan mediante microscopía de fluorescencia.

Este vídeo muestra cómo obtener hemocitos (células sanguíneas) de la hawaiana calamar bobtail,<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt; Para su uso en ensayos de adhesión celular biológica y bacteriana. Hemocitos se tiñen con un colorante fluorescente y se expone a las buenas prácticas agrarias con etiqueta bacterias.

La obtención de hemocitos de la hawaiana Squid Bobtail Euprymna scolopes Y la observación de su adhesión a las bacterias simbióticas y no simbióticas-

Los estudios relativos al papel del sistema inmunitario en la mediación de la señalización molecular entre las bacterias beneficiosas y sus huéspedes han logrado, en los últimos años...

Después de que se hayan retirado los calamares bobtail adultos de sus tanques y se hayan anestesiado con una solución de agua de mar filtrada con etanol al 2%, se les extrae sangre a través del vaso sanguíneo cefálico. Con una jeringa de calibre 26 y medio, la hemolinfa extraída aparece de color azul.Debido a la presencia de hemocianina, los hematocitos se diluyen hasta una concentración deseada y se distribuyen en alícuotas en una cubierta con ocho cámaras. Una vez que los hematocitos se han adherido a la cubierta, se tiñen con un marcador celular naranja, un colorante fluorescente, y se exponen a bacterias marcadas con GFP, que pueden visualizarse mediante un microscopio fluorescente. Hola, soy Spencer Olm del Departamento de Biología Molecular y Celular de la Universidad de Connecticut.Y soy Andrew Collins del Laboratorio Doméstico de NY. Hoy les mostraremos un procedimiento para extraer hemolinfa o sangre del calamar bobtail hawaiano. Usted prepara previamente este opis.Ahora bien, los calamares bobtail son animales nocturnos que se encuentran en la costa de Hawái cerca de los arrecifes de coral, y utilizan la luz producida por su simbiosis para camuflarse por la noche cuando salen a cazar su alimento favorito, que son los camarones. Utilizamos esta asociación en el laboratorio para estudiar cómo las bacterias beneficiosas colonizan los tejidos animales. Empleamos este procedimiento en nuestro laboratorio para investigar las interacciones entre los componentes del sistema inmunitario innato del hospedador y su compañero bacteriano bioluminiscente VIO ide.Así que comencemos. Antes de extraer el hemolinfa, anestesie un calamar adulto en un vaso de precipitados de un litro que contenga una solución recién preparada de etanol al 2% en 500 mililitros de agua de mar artificial filtrada y esterilizada. Después de 10 minutos, el calamar dejará de nadar y no responderá activamente al tacto.Sin embargo, aún debe observarse una respiración continua, indicada por el movimiento del manto y la actividad de los cromatóforos, lo que indica actividad de las células pigmentarias. Vierta parte de la solución estéril de agua de mar con etanol del vaso de precipitados en una bandeja estándar de disección de cera y sumerja el calamar en la bandeja con la cara ventral hacia arriba. Utilizando una punta estándar de pipeta de 200 microlitros, retire el sifón y el manto para exponer el principal vaso sanguíneo cefálico ubicado entre los dos ojos.Utilice una jeringa estéril con una aguja de calibre 26 y medio para perforar el vaso sanguíneo cefálico y extraer entre 50 y 100 microlitros de hemolinfa o entre 10 y 20 microlitros. Si el animal va a servir como donante varias veces, coloque la hemolinfa en un tubo estéril de 1,5 mililitros sobre hielo. Tenga en cuenta que, si este paso se realiza correctamente, la sangre del calamar debería presentarse de color azul oscuro.Coloque nuevamente al animal en un tanque con agua de mar normal para reanimarlo. Gire el hemolinfa en una microcentrífuga a temperatura ambiente para formar un sedimento de hemocitos y retire el sobrenadante con una pipeta. Re suspenda los hemocitos en 500 microlitros de solución de Ringer para calamar para lavarlos. Luego, centrifugue nuevamente para sedimentar las células y elimine el sobrenadante.Por último, re suspenda los hematíes y la solución de Ringer para calamar. Determine la concentración celular mediante un hemocitómetro. Luego agregue aproximadamente 2000 células a cada cámara de una cubreobjetos de vidrio.Deje que las células se adhieran al vidrio durante aproximadamente 10 minutos. A esta densidad, los hemos deben formar una monocapa uniforme sobre la superficie de vidrio. Mantenga los hemos sobre hielo mientras prepara las bacterias en un agitador orbital a 28 grados Celsius.Cultive una o más cepas de bacterias Vireo que contengan un gen reportero fluorescente verde hasta la fase logarítmica media en medio de agua de mar con tritón. Utilizando un espectrofotómetro, mida la densidad óptica del cultivo a 600 para determinar la densidad celular; en un pellet de centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet. En un mililitro de solución de Ringer para calamar, agregue bacterias a los hemocitos.En los portaobjetos de vidrio con cámara, coloque 100.000 bacterias por cámara. Incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante una hora. Para lograr una unión máxima, agregue el marcador celular naranja y una concentración final de 0,005 % para teñir el citoplasma hemo.Incubar durante 30 minutos y luego lavar con 150 microlitros de solución fresca de ringer de calamar. Añadir un microscopio confocal, observar los hecitos teñidos y las bacterias asociadas, y enumerar las bacterias sobre toda la superficie del hecito. Ahora mostraremos algunas imágenes representativas de hecitos expuestos a la bacteria no simbiótica marcada con GFP, Filio Harvey Eye, y al simbionte natural del calamar, Filio fii.Aquí hay una imagen de un sitio hemo que no fue expuesto a ninguna bacteria. La célula aparece roja y se ha activado. Así puede observarse sus extensiones similares a pseudópodos.Cuando la célula se enfrenta al simbionte bacteriano filio fii, se observa que algunas bacterias se unen a la superficie de la célula. Sin embargo, cuando las bacterias no simbióticas filio Harvey Harveyi se exponen a los hemos, se une un número significativamente mayor de bacterias. Acabamos de mostrarle cómo extraer hemolinfa de un calamar bobtail, aislar los hemos y utilizarlos en experimentos para caracterizar la adhesión bacteriana a estas células de calamar.Este protocolo podría modificarse para inmunoquímica fijando los hemocitos después de que se adhieran a la superficie del cubreobjetos. El ARN, el ADN y las proteínas también podrían extraerse una vez que los hemocitos se hayan obtenido del animal. Eso es todo.Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

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Extracción de sangre del cangrejo herradura de América, Limulus polyphemus

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Microfluidos Co-cultivo de células epiteliales y bacterias para la Investigación de la señal mediada Soluble Interacciones

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La colonización de Euprymna scolopes Squid por Vibrio fischeri</em

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