La obtención de hemocitos de la hawaiana Squid Bobtail Euprymna scolopes Y la observación de su adhesión a las bacterias simbióticas y no simbióticas-

Después de que se hayan retirado los calamares bobtail adultos de sus tanques y se hayan anestesiado con una solución de agua de mar filtrada con etanol al 2%, se les extrae sangre a través del vaso sanguíneo cefálico. Con una jeringa de calibre 26 y medio, la hemolinfa extraída aparece de color azul.

Debido a la presencia de hemocianina, los hematocitos se diluyen hasta una concentración deseada y se distribuyen en alícuotas en una cubierta con ocho cámaras. Una vez que los hematocitos se han adherido a la cubierta, se tiñen con un marcador celular naranja, un colorante fluorescente, y se exponen a bacterias marcadas con GFP, que pueden visualizarse mediante un microscopio fluorescente. Hola, soy Spencer Olm del Departamento de Biología Molecular y Celular de la Universidad de Connecticut.

Y soy Andrew Collins del Laboratorio Doméstico de NY. Hoy les mostraremos un procedimiento para extraer hemolinfa o sangre del calamar bobtail hawaiano. Usted prepara previamente este opis.

Ahora bien, los calamares bobtail son animales nocturnos que se encuentran en la costa de Hawái cerca de los arrecifes de coral, y utilizan la luz producida por su simbiosis para camuflarse por la noche cuando salen a cazar su alimento favorito, que son los camarones. Utilizamos esta asociación en el laboratorio para estudiar cómo las bacterias beneficiosas colonizan los tejidos animales. Empleamos este procedimiento en nuestro laboratorio para investigar las interacciones entre los componentes del sistema inmunitario innato del hospedador y su compañero bacteriano bioluminiscente VIO ide.

Así que comencemos. Antes de extraer el hemolinfa, anestesie un calamar adulto en un vaso de precipitados de un litro que contenga una solución recién preparada de etanol al 2% en 500 mililitros de agua de mar artificial filtrada y esterilizada. Después de 10 minutos, el calamar dejará de nadar y no responderá activamente al tacto.

Sin embargo, aún debe observarse una respiración continua, indicada por el movimiento del manto y la actividad de los cromatóforos, lo que indica actividad de las células pigmentarias. Vierta parte de la solución estéril de agua de mar con etanol del vaso de precipitados en una bandeja estándar de disección de cera y sumerja el calamar en la bandeja con la cara ventral hacia arriba. Utilizando una punta estándar de pipeta de 200 microlitros, retire el sifón y el manto para exponer el principal vaso sanguíneo cefálico ubicado entre los dos ojos.

Utilice una jeringa estéril con una aguja de calibre 26 y medio para perforar el vaso sanguíneo cefálico y extraer entre 50 y 100 microlitros de hemolinfa o entre 10 y 20 microlitros. Si el animal va a servir como donante varias veces, coloque la hemolinfa en un tubo estéril de 1,5 mililitros sobre hielo. Tenga en cuenta que, si este paso se realiza correctamente, la sangre del calamar debería presentarse de color azul oscuro.

Coloque nuevamente al animal en un tanque con agua de mar normal para reanimarlo. Gire el hemolinfa en una microcentrífuga a temperatura ambiente para formar un sedimento de hemocitos y retire el sobrenadante con una pipeta. Re suspenda los hemocitos en 500 microlitros de solución de Ringer para calamar para lavarlos. Luego, centrifugue nuevamente para sedimentar las células y elimine el sobrenadante.

Por último, re suspenda los hematíes y la solución de Ringer para calamar. Determine la concentración celular mediante un hemocitómetro. Luego agregue aproximadamente 2000 células a cada cámara de una cubreobjetos de vidrio.

Deje que las células se adhieran al vidrio durante aproximadamente 10 minutos. A esta densidad, los hemos deben formar una monocapa uniforme sobre la superficie de vidrio. Mantenga los hemos sobre hielo mientras prepara las bacterias en un agitador orbital a 28 grados Celsius.

Cultive una o más cepas de bacterias Vireo que contengan un gen reportero fluorescente verde hasta la fase logarítmica media en medio de agua de mar con tritón. Utilizando un espectrofotómetro, mida la densidad óptica del cultivo a 600 para determinar la densidad celular; en un pellet de centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet. En un mililitro de solución de Ringer para calamar, agregue bacterias a los hemocitos.

En los portaobjetos de vidrio con cámara, coloque 100.000 bacterias por cámara. Incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante una hora. Para lograr una unión máxima, agregue el marcador celular naranja y una concentración final de 0,005 % para teñir el citoplasma hemo.

Incubar durante 30 minutos y luego lavar con 150 microlitros de solución fresca de ringer de calamar. Añadir un microscopio confocal, observar los hecitos teñidos y las bacterias asociadas, y enumerar las bacterias sobre toda la superficie del hecito. Ahora mostraremos algunas imágenes representativas de hecitos expuestos a la bacteria no simbiótica marcada con GFP, Filio Harvey Eye, y al simbionte natural del calamar, Filio fii.

Aquí hay una imagen de un sitio hemo que no fue expuesto a ninguna bacteria. La célula aparece roja y se ha activado. Así puede observarse sus extensiones similares a pseudópodos.

Cuando la célula se enfrenta al simbionte bacteriano filio fii, se observa que algunas bacterias se unen a la superficie de la célula. Sin embargo, cuando las bacterias no simbióticas filio Harvey Harveyi se exponen a los hemos, se une un número significativamente mayor de bacterias. Acabamos de mostrarle cómo extraer hemolinfa de un calamar bobtail, aislar los hemos y utilizarlos en experimentos para caracterizar la adhesión bacteriana a estas células de calamar.

Este protocolo podría modificarse para inmunoquímica fijando los hemocitos después de que se adhieran a la superficie del cubreobjetos. El ARN, el ADN y las proteínas también podrían extraerse una vez que los hemocitos se hayan obtenido del animal. Eso es todo.

Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.