Ventana en un micromundo: Sistemas sencillos de microfluidos para el estudio de transporte de microbios en medios porosos

Demostramos que mediante el uso de dispositivos de microcanales ecológicos, las estructuras físicas y las cargas de presión pueden mantenerse constantes o variarse. Mientras se investiga sistemáticamente la influencia de las propiedades químicas superficiales de los fluidos o las características de las partículas o microorganismos mediante experimentos de transporte utilizando una cepa bacteriana VIO no patógena que expresa una proteína verde fluorescente, ilustramos la importancia de la estructura del hábitat, las condiciones de flujo y el tamaño del inóculo en fenómenos fundamentales de transporte. Software microfluídico que ofrece una visión reveladora de un mundo oculto.

Hola, soy Dimitri Marker del Instituto Vanderbilt para la Educación en Restauración de Biosistemas Integrativos en la Universidad Vanderbilt. Y yo soy David Schafer, ingeniero de investigación y desarrollo aquí en los Laboratorios Viro. Hola, soy Leslie Sho del Departamento de Ingeniería Química, de Materiales y Biomolecular en el Centro de Ciencias y Ingeniería Ambiental de la Universidad de Connecticut, y yo soy Ader Dicot, también de Zebra.

Hoy vamos a mostrarle un procedimiento para crear matrices modulares de hábitats microfluídicos para investigaciones básicas en ciencias ambientales e ingeniería. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para investigar los efectos de estructuras a escala micrométrica en las interacciones de transporte microbiano en medios porosos. Así que comencemos.

El primer paso para crear un dispositivo microfluídico consiste en dibujar un diseño bidimensional del dispositivo en un programa de dibujo asistido por ordenador o programa CAD. Hemos utilizado AutoCAD, pero también existen otros programas de dibujo, como Clue in o Corel Draw. El software permite al diseñador replicar fielmente estructuras físicas en todo un campo macroscópico, mientras que las características individuales se definen con una resolución inferior a cinco micrones.

A partir del dibujo CAD, se crea una máscara fotográfica. Utilizamos una máscara de cromo fabricada por Advanced Reproductions Corporation, en el extremo norte de Massachusetts. Los siguientes pasos del proceso de fabricación del dispositivo microfluídico se llevan a cabo en un cuarto limpio para crear un molde maestro.

Una oblea de silicio limpia se recubre con resistencia fotosensible en un espinador. Primero, la oblea se fija a la plataforma del espinador y se vierten unos pocos gramos de resistencia fotosensible SU 8 20 25 en el centro de la oblea. Luego, la oblea gira durante un ciclo inicial de dispersión de 15 segundos a 500 RPM, seguido de un ciclo de recubrimiento fino a 4.000 RPM durante 35 segundos.

Después de la centrifugación, la oblea se coloca sobre una placa calefactora durante 10 minutos a 95 grados Celsius para volatilizar el exceso de disolvente. El último paso en la preparación de la oblea consiste en eliminar el borde de gota. Esto se realiza devolviendo la oblea al centrífugo y aplicando un flujo constante de removedor de borde SUA a la orilla exterior de la oblea recubierta.

El siguiente paso consiste en configurar el fotoresistente mediante exposición selectiva a luz UV. En primer lugar, se coloca la oblea recubierta sobre una superficie plana y la máscara de cromo se sitúa directamente encima. La película roja de enmascaramiento Rubylith bloquea la transferencia de patrones fuera del área deseada.

A continuación, se aplica una dosis de luz UV de 300 milijulios por centímetro cuadrado sobre la oblea recubierta a través de la máscara, utilizando un sistema de irradiación puntual. Finalmente, la oblea se calienta durante 15 minutos a 95 grados Celsius para reticular las regiones del fotoresist expuestas a la luz, haciéndolas insolubles. El último paso para crear el molde maestro consiste en eliminar las regiones del fotoresist que no han sido reticuladas, dejando estructuras en relieve elevadas.

Primero, la oblea se devuelve nuevamente al centrífugo y se cubre con la solución reveladora. Se deja el revelador sobre la oblea recubierta aproximadamente cinco minutos y luego se elimina mediante centrifugado, obteniéndose un patrón claramente visible en la oblea. Cualquier residuo restante se elimina lavando con alcohol isopropílico rociado sobre la oblea en rotación.

Utilizamos una velocidad de centrifugado de 2200 RPM en este paso durante aproximadamente cinco a 10 segundos. Finalmente, el molde terminado se seca usando una corriente de gas nitrógeno y se almacena en un recipiente hasta que sea necesario para la fabricación de un dispositivo. Fabricamos dispositivos microfluídicos utilizando el elastómero de silicona polimetil alano.

Primero, el material base y el agente de curado se dispensan en una relación de peso de 10 a 1 en un vaso de plástico. A continuación, se mezcla la mezcla utilizando un mezclador de acondicionamiento Thinky AR 100 para eliminar las burbujas.

Una vez completado el ciclo, se vierte PDMS líquido uniformemente sobre el molde maestro. Luego, el recipiente que contiene el molde maestro y el PDMS sin curar se coloca en una cámara de vacío para desgasificar. Las burbujas del polímero aparecen casi inmediatamente.

La desgasificación continúa hasta que desaparezcan todas las burbujas. El recipiente se coloca en un horno nivelado a 65 grados Celsius durante al menos cuatro horas para permitir completamente la reticulación del polímero. Luego, el PDMS curado se retira cuidadosamente del molde maestro reutilizable.

Primero, se cortan bien fuera de la región patroneada los cuatro bordes con un escalpelo, y el dispositivo se desprende de la oblea patroneada utilizando pinzas. Los bordes del dispositivo pueden recortarse con tijeras si se desea. Una subsección del dispositivo puede separarse del resto del dispositivo de PDMS moldeado.

A continuación, se perforan orificios de acceso a través del PDMS. Utilizamos punzones de biopsia disponibles comercialmente en varios tamaños diferentes montados en un eje pequeño. Se retiran los núcleos de PDMS presionando con pinzas.

Finalmente, el dispositivo recortado y perforado se limpia utilizando alcohol isopropílico y un hisopo de espuma de polipropileno con punta. El dispositivo se seca con nitrógeno y luego se coloca en el horno para eliminar todos los rastros de disolvente. El último paso en la fabricación de un dispositivo microfluídico es unir el PDMS a un sustrato de portaobjetos de vidrio y, a continuación, llenarlo con fluido primero.

El dispositivo de PDMS y una lámina de vidrio se colocan con la superficie de unión hacia arriba en un limpiador de plasma. En este experimento, utilizamos un limpiador de plasma Herrick PDC 32 G. Una vez que se establece el vacío y el plasma violeta azulado es visible, se programa un temporizador durante 30 segundos.

Se apaga el generador de plasma. Se vuelve a presurizar la cámara, y el dispositivo y el deslizador se retiran de la cámara y las superficies de unión se colocan en contacto. Al retirar los componentes activados de la cámara, es importante actuar rápidamente para que las superficies permanezcan activadas.

La presión suave ayuda a garantizar una buena unión. La calidad de la unión se verifica tirando de una esquina con pinzas. Luego, el interior hidrofílico puede llenarse fácilmente con una solución acuosa, como medio tampón o agua desionizada.

Se administra fluido acuoso en cada pocillo de origen y a través de la celda de flujo microporosa correspondiente. Una vez que todas las cámaras están llenas, se coloca una capa delgada de PDMS curado sobre todo el dispositivo para ayudar a retardar la evaporación y mantener la esterilidad. Para calibrar el flujo impulsado por presión en el dispositivo, precargue las celdas de flujo microestructuradas con agua desionizada, coloque un módulo de flujo, que actúa como una interfaz de entrega de fluido y un sello estéril en la parte superior del dispositivo.

Este módulo de flujo puede utilizarse por sí solo o conectarse a un depósito externo que contenga fluido, como una jeringa de plástico. Conecte un depósito que contenga líquido, como una jeringa de plástico o el módulo de flujo, a la entrada aguas arriba. Mantenga bien la altura del fluido en el depósito por encima de la altura del extremo aguas abajo.

Bueno, la diferencia de altura entre el depósito aguas arriba y cada pozo de salida aguas abajo define la fuerza impulsora para el flujo impulsado por presión, con el fin de cuantificar las tasas de flujo a través de los dispositivos. Se utiliza una aguja de calibre 25 de extremo romo para recolectar muestras de los pozos aguas abajo a intervalos regulares. Por ejemplo, recolectamos muestras cada 15 a 20 minutos, anotando cuidadosamente el tiempo transcurrido real entre muestras.

Se registra el peso de la jeringa antes y después del muestreo en una balanza analítica. Se grafica el volumen acumulado frente al tiempo acumulado, siendo la pendiente igual a la velocidad media de flujo másico. La gran sección transversal del depósito de entrada frente a los pozos de salida ayuda a evitar que las velocidades de flujo cambien significativamente a medida que el fluido atraviesa los dispositivos; grafique el volumen muestreado en el eje Y frente al tiempo de muestreo en el eje X.

En un programa de graficación sencillo, como Excel, para obtener la pendiente de la línea, la pendiente se utiliza para determinar la tasa promedio de flujo volumétrico. Se utiliza una solución diluida de microesferas de látex fluorescentes de tres micromolares con superficies carboxi, YG y YG simple para visualizar el flujo y estudiar las interacciones superficiales. Primero, se prepara una solución de microesferas en agua desionizada a una concentración de 0,01% de sólidos.

La solución se agrega a los pocillos aguas arriba y el módulo de flujo se vuelve a conectar a zu. El flujo de las perlas se visualiza durante una hora y se registra aproximadamente cada 10 minutos en un microscopio fluorescente Zeiss AIOt 25, equipado con una cámara monocromática MITx BCEB 0 1 3 U. Se capturan cuadros individuales en rápida sucesión y se ensamblan en videos utilizando un programa informático como Image J con iluminación de fluorescencia y luz transmitida.

Las perlas y las estructuras son visibles ambas. Cuando se bloquea la luz transmitida, solo son visibles las perlas fluorescentes brillantes. Las perlas estacionarias depositadas a lo largo de la superficie inferior o unidas a los colectores son evidentes en todo el dispositivo.

Para experimentos que utilizan bacterias vivas, se prepara un cultivo como Vibrio species, una bacteria no patógena que expresa la proteína verde fluorescente. Primero, se retira un cultivo patrón del almacenamiento en congelación profunda. Se inoculará un frasco con medio de crecimiento LB estéril con el cultivo patrón.

Utilizando un asa de inoculación desechable, el matraz se incuba durante la noche con agitación para obtener un cultivo en fase estacionaria con una concentración de aproximadamente 10 a la novena células por mililitro. Dependiendo de la aplicación, la concentración inicial de bacterias puede cuantificarse con mayor precisión. Se prepara un dispositivo microfluídico lleno con tampón estéril.

Luego, el líquido estéril en los pocillos aguas arriba se vacía y se reemplaza con 20 microlitros de cultivo bacteriano. Mediante una pipeta, las bacterias se siembran en el dispositivo aplicando succión suave con una jeringa en los pocillos de salida. Tras la incubación, la cantidad de bacterias en los pocillos puede determinarse cuantificando la intensidad de fluorescencia de cada pocillo tras la colonización. El pocillo de entrada aguas arriba se vacía como antes y se reemplaza con tampón lavado con 25 partes por mil de sales.

Se aplica una presión suave de agua de mar artificial a los pozos aguas arriba mediante una jeringa que enjuaga celdas de flujo individuales con 20 a 40 microlitros de la solución tampón. Esto equivale aproximadamente a 100 a 200 veces el volumen reducido de la porción de suelo microfluídica de la celda de flujo tras el enjuague inicial. La perfusión prolongada de bacterias a través del medio poroso se logra mediante el uso del módulo de flujo exactamente como se ha mostrado anteriormente.

Se pueden medir imágenes fluorescentes y de luz blanca del crecimiento y transporte bacteriano a lo largo del tiempo. En este experimento, se toman imágenes cada 15 a 20 horas durante un período de siete días con una cámara CCD refrigerada de color cinco de Q imaging ink. Nuestros dispositivos también pueden utilizarse para investigar los efectos de la estructura física del hábitat en la provisión de refugio a las bacterias frente a la predación por protozoos.Seen.

Aquí se observan bacterias en una celda de flujo microporosa, con los protozoos cilíados mucho más grandes, Eulo, visibles en el dispositivo mientras se alimentan de bacterias. En el análisis del flujo de fluido en el dispositivo microfluídico, encontramos que el caudal medio es de 0,71 microlitros por minuto para una carga de presión de 40 milímetros. Al aumentar la carga de presión a 60 milímetros, el caudal aumentó proporcionalmente hasta 1,04 microlitros por minuto.

Al utilizar perlas con diversas químicas de superficie en el dispositivo, observamos una mayor acumulación de perlas no carboxiladas en las superficies del dispositivo. Mientras tanto, las perlas de seis a 10 milímetros de diámetro tenían mucha más probabilidad de quedar atrapadas en las aberturas de poros más pequeñas. Las tasas de flujo más rápidas provocadas por una mayor presión hidrostática resultaron en una disminución de la retención y atrapamiento de las perlas, como sería de esperar al analizar el crecimiento bacteriano en el dispositivo microfluídico eco chipp.

Observamos las diferencias cualitativas en la intensidad de la imagen en diferentes sectores del dispositivo. La intensidad de fluorescencia puede cuantificarse como un indicador de la biomasa microbiana en el canal. En experimentos en curso, observamos que las fuerzas de cizallamiento continuas bajo condiciones de flujo bajo parecen causar la agregación bacteriana y la formación de flóculos, como es evidente en estas imágenes. Acabamos de mostrarle cómo crear y utilizar dispositivos microfluídicos sencillos para medir la escala de partículas, el transporte por colisión a través de medios porosos, o para investigar las interacciones microbianas en hábitats con microestructuras.

Al realizar estudios utilizando celdas de flujo, es importante considerar la flotabilidad de las perlas y la química superficial de los coloides y colectores. Al reducir la escala hasta el régimen microfluídico, los efectos superficiales pueden dominar los fenómenos observados. Prácticamente cualquier estructura física puede incorporarse en el diseño de celdas de flujo microfluídicas.

Así que eso es todo. Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.