Ventana en un micromundo: Sistemas sencillos de microfluidos para el estudio de transporte de microbios en medios porosos

Demostramos que mediante el uso de dispositivos de chip ecológico, las estructuras físicas y los cabezales de presión pueden mantenerse constantes o variados. Si bien la influencia de las propiedades de los fluidos de la química de la superficie o las características de las partículas o microbios se investigan sistemáticamente a través de experimentos de transporte utilizando una proteína fluorescente verde no patógena que expresa la cepa bacteriana VIO, ilustramos la importancia de la estructura del hábitat, las condiciones de flujo y el tamaño del inóculo en los fenómenos fundamentales de transporte. Software microfluídico visión convincente de un mundo oculto.

Hola, nuestro marcador Dimitri del Instituto de Educación en Restauración de Biosistemas Integrativos de Vanderbilt de la Universidad de Vanderbilt. Y yo soy David Schafer, ingeniero de investigación y desarrollo aquí en los Laboratorios Viro. Hola, soy Leslie Sho del Departamento de Materiales Químicos e Ingeniería Biomolecular en el Centro de Ciencia e Ingeniería Ambiental de la Universidad de Connecticut, y me agregan Dicot también de Zebra.

Hoy vamos a mostrarte un procedimiento para crear matrices modulares de hábitats microfluídicos para la investigación básica de ciencia e ingeniería ambiental. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para investigar los efectos de las estructuras a escala micrométrica en las interacciones de transporte microbiano en los medios forestales. Así que comencemos.

El primer paso para crear un dispositivo microfluídico es dibujar un diseño bidimensional del dispositivo en un dibujo asistido por computadora o en un programa CAD. Hemos utilizado AutoCAD, pero también hay otros programas de dibujo disponibles, como clue in o coral draw. El software permite al diseñador replicar fielmente las estructuras físicas en un campo macroscópico, mientras que las características individuales se definen con una resolución de menos de cinco micras.

A partir del dibujo CAD, se crea una máscara fotográfica. Utilizamos una mascarilla de cromo fabricada por Advanced Reproductions Corporation, en el extremo norte de Massachusetts. Los siguientes pasos de la producción de dispositivos microfluídicos se llevan a cabo en una sala limpia para crear un maestro.

Una oblea de silicio limpia está recubierta con fotorresistencia en un codificador de espín. En primer lugar, la oblea se conecta a la plataforma del codificador de espín y se vierten unos gramos de fotorresistencia SU 8 20 25 en el centro de la oblea. Luego, la oblea se hace girar durante un ciclo inicial de distribución de 15 segundos a 500 RPM, seguido de un ciclo de recubrimiento delgado de 4,000 RPM durante 35 segundos.

Después de girar, la oblea se coloca en una placa caliente durante 10 minutos a 95 grados centígrados para volatilizar el exceso de solvente. El último paso en la preparación de la oblea es quitar el cordón del borde. Esto se hace devolviendo la oblea al codificador de espín y aplicando un flujo constante de eliminador de velocidad de borde SUA al borde exterior de la oblea recubierta.

El siguiente paso es modelar la fotorresistencia mediante una exposición selectiva a la luz ultravioleta. Primero, la oblea recubierta se coloca sobre una superficie plana y la máscara cromada se coloca directamente encima. La película de enmascarar roja Rubylith bloquea la transferencia de patrones fuera del área deseada.

A continuación, se administra una dosis cuadrada de 300 mili JUUL por centímetro de luz ultravioleta a la oblea recubierta a través de la mascarilla mediante un sistema de transporte puntual. Finalmente, la oblea se hornea durante 15 minutos a 95 grados centígrados para reticular las regiones expuestas a la luz de la fotorresistencia y hacerlas insolubles. El último paso en la creación del maestro es eliminar las regiones no reticuladas de la fotorresistencia, dejando atrás las estructuras de relieve elevadas.

En primer lugar, la oblea se devuelve una vez más al codificador de espín y se cubre con la solución de desarrollador. El revelador se deja en la oblea recubierta aproximadamente cinco minutos y luego se gira, lo que da como resultado un patrón claramente evidente en la oblea. Cualquier residuo restante se lava rociando alcohol isopropílico sobre la oblea giratoria.

Usamos una velocidad de giro de 2200 RPM para este paso durante aproximadamente cinco a 10 segundos. Finalmente, el maestro terminado se seca usando una corriente de gas nitrógeno y se almacena en un plato hasta que sea necesario para fundir un dispositivo. Fabricamos dispositivos microfluídicos utilizando el elastómero de silicona polimetilalano.

Primero, el material base y el agente de curado se entregan en una proporción de peso de 10 a uno en un vaso de plástico. A continuación, se mezcla la mezcla. Andy burbujeaba con un mezclador de acondicionamiento AR 100.

Una vez que se completa el ciclo, el PDMS líquido se vierte uniformemente sobre el maestro. A continuación, el plato que contiene el maestro y el PDMS sin curar se coloca en una cámara de vacío para desgasificarlo. Las burbujas de polímero aparecen casi de inmediato.

La desgasificación continúa hasta que todas las burbujas desaparecen. El plato se coloca en un horno nivelado a 65 grados centígrados durante al menos cuatro horas para permitir completamente la reticulación del polímero. A continuación, el PDMS curado se retira cuidadosamente del maestro reutilizable.

Los primeros cuatro bordes se cortan bien fuera de la región estampada con un bisturí, el dispositivo se despega de la oblea estampada con pinzas. Los bordes del dispositivo se pueden recortar con tijeras si se desea. Una subsección del dispositivo puede estar separada del resto del dispositivo PDMS moldeado.

A continuación, se perforan los orificios de acceso a través del PDMS. Utilizamos punzones de biopsia que están disponibles comercialmente en varios tamaños diferentes montados en un eje pequeño. Los núcleos de PDMS de prensa se retiran con pinzas.

Finalmente, el dispositivo recortado y perforado se limpia con alcohol isopropílico y un hisopo de polipropileno con punta de espuma. El dispositivo se seca con nitrógeno y luego se coloca en el horno para eliminar todos los restos de solvente. El último paso en la fabricación de un dispositivo microfluídico es unir el PDMS a un sustrato de portaobjetos de vidrio y luego llenarlo primero con fluido.

El dispositivo PDMS y un portaobjetos de vidrio se colocan con la superficie de unión espaciada en un limpiador de plasma. En este experimento, utilizamos un limpiador de plasma herrick PDC 32 G. Una vez que se establece el vacío y el plasma violeta azul es visible, se configura un temporizador para 30 segundos.

El generador de plasma está apagado. La cámara se vuelve a presurizar y el dispositivo y el control deslizante tomados de la cámara y las superficies de unión se colocan en contacto. Al retirar los componentes activados de la cámara, es importante moverse rápidamente para que las superficies permanezcan activadas.

Una presión suave ayuda a garantizar una buena unión. La calidad de la unión se comprueba tirando de una esquina con pinzas. El interior hidrófilo puede llenarse fácilmente con una solución acuosa, como un medio tampón, o desionizar.

El fluido de agua se administra en cada pozo fuente y a través de la celda de flujo microporosa correspondiente. Una vez que todas las cámaras están llenas, se coloca una capa delgada de PDMS curado sobre todo el dispositivo para ayudar a retardar la evaporación y mantener la esterilidad. Para calibrar el flujo impulsado por presión en el dispositivo, precargue las celdas de flujo microestructuradas con agua desionizada, coloque un módulo de flujo, que actúa como interfaz de suministro de fluido y un sello estéril en la parte superior del dispositivo.

Este módulo de flujo se puede usar solo o conectado a un depósito externo que contenga fluido, como una jeringa de plástico. Conecte un depósito que contenga líquido, como una jeringa de plástico o el módulo de flujo, a la entrada aguas arriba. Mantener bien la altura del fluido en el embalse por encima de la altura del aguas abajo.

Bueno, la diferencia de altura entre el embalse aguas arriba y cada pozo de salida aguas abajo define la fuerza impulsora del flujo impulsado por la presión para cuantificar los caudales a través de los dispositivos. Se utiliza una aguja roma de calibre 25 para recoger muestras de los pozos aguas abajo a intervalos regulares. Por ejemplo, recolectamos muestras cada 15 a 20 minutos anotando cuidadosamente el tiempo real transcurrido entre muestras.

El peso de la jeringa se registra antes y después de la toma de muestras en una balanza analítica. El volumen agregado frente al tiempo agregado se representa gráficamente con la pendiente igual al caudal másico promedio. La gran sección transversal del depósito de entrada frente a los pozos de salida ayuda a evitar que los caudales cambien significativamente a medida que el fluido se mueve a través de los dispositivos, trace el volumen muestreado en el eje Y frente al tiempo de muestreo en el eje x.

En un programa gráfico simple como Excel para obtener la pendiente de la línea, se utiliza la pendiente para el caudal volumétrico promedio. Se utiliza una solución diluida de tres perlas de látex fluorescente micromolar con superficies de carboxi, YG y YG lisas para visualizar el flujo y estudiar las interacciones de la superficie. Primero, se prepara una solución de perlas en agua desionizada a una concentración de 0,01% de sólidos.

La solución se agrega a los pozos aguas arriba y el módulo de flujo se vuelve a conectar a zu. El flujo de perlas de flujo se visualiza en el transcurso de una hora y se registra aproximadamente cada 10 minutos en un microscopio fluorescente Zeiss AIOt 25, equipado con una cámara monocromática MITx BCEB 0 1 3 U. Los fotogramas individuales se capturan en rápida sucesión y se ensamblan en películas utilizando un programa de software como Image J con iluminación de fluorescencia e iluminación de luz transmitida.

Tanto las cuentas como las estructuras son visibles. Cuando se bloquea la luz transmitida, solo se ven las perlas fluorescentes brillantes. Las perlas estacionarias depositadas a lo largo de la superficie inferior o unidas a los colectores son evidentes en todo el dispositivo.

Para los experimentos con bacterias vivas, se prepara un cultivo como la especie Vibrio, una proteína fluorescente verde no patógena que expresa bacterias. En primer lugar, se elimina un cultivo de stock del almacenamiento libre profundo. Un matraz con medios de crecimiento LB estériles se inocula con el cultivo madre.

Utilizando un asa de inoculación desechable, el matraz se incuba durante la noche con agitación para dar lugar a un cultivo en fase estacionaria con una concentración de aproximadamente 10 a la novena célula por mililitro. Dependiendo de la aplicación, la concentración inicial de bacterias puede cuantificarse con mayor precisión. Se prepara un dispositivo microfluídico lleno de tampón estéril.

A continuación, el líquido estéril de los pozos aguas arriba se vacía y se sustituye por 20 microlitros del cultivo de bacterias. Usando una pipeta, las bacterias se siembran en el dispositivo mediante una succión suave con una jeringa en los pocillos de salida Después de la incubación, la cantidad de bacterias en los pocillos se puede determinar cuantificando la intensidad de fluorescencia de cada pocillo después de la colonización. El pozo de entrada aguas arriba se vacía como antes y se reemplaza con un tampón lavado con 25 partes por mil sales.

El agua de mar artificial aplica una presión suave a los pozos aguas arriba con una jeringa que lava las celdas de flujo individuales con 20 a 40 microlitros de la solución tampón. Esto es aproximadamente de 100 a 200 veces el volumen pobre de la porción de suelo microfluídico de la celda de flujo después del lavado inicial. La perfusión a largo plazo de las bacterias a través del medio poroso se logra mediante el uso del módulo de flujo exactamente como se muestra antes.

Las imágenes fluorescentes y de luz blanca del crecimiento y transporte bacteriano se pueden medir a lo largo del tiempo. En este experimento, las imágenes se toman cada 15 a 20 horas durante un período de siete días con una cámara CCD enfriada a cinco colores de tinta de imagen Q. Nuestros dispositivos también se pueden utilizar para investigar los efectos de la estructura física del hábitat en la provisión de refugio a las bacterias de la depredación por parte de los protozoos. Visto.

Aquí hay bacterias en una celda de flujo microporosa con el eulo de protozoos ciliados mucho más grande visible en el dispositivo que se alimenta de bacterias. En el análisis del flujo de fluido en el dispositivo microfluídico, encontramos que el caudal promedio es de 0,71 microlitros por minuto para una cabeza de presión de 40 milímetros. Al aumentar la carga de presión a 60 milímetros, el caudal aumentó proporcionalmente a 1,04 microlitros por minuto.

Cuando se utilizan perlas con diversas químicas superficiales en el dispositivo, observamos una mayor acumulación de perlas no carboxiladas en las superficies del dispositivo. Mientras que las cuentas de seis a 10 milímetros de diámetro eran mucho más propensas a ser arrastradas en las aberturas de los poros más pequeños. Los caudales más rápidos causados por una mayor presión hidrostática dieron como resultado una disminución de la retención y el arrastre de cordones, como se esperaría para analizar el crecimiento bacteriano en el dispositivo microfluídico eco chipp.

Observamos las diferencias cualitativas en la intensidad de la imagen en diferentes sectores del dispositivo. La intensidad de la fluorescencia se puede cuantificar como un proxy de la biomasa microbiana en el canal. En experimentos en curso, observamos que las fuerzas de cizallamiento continuas de las condiciones de bajo flujo parecen causar la agregación bacteriana y la formación de lotes, como es evidente en estas imágenes, Acabamos de mostrarle cómo crear y usar dispositivos microfluídicos simples para medir la escala de partículas, colisionar el transporte a través de medios porosos o para investigar las interacciones microbianas en hábitats microestructurados.

Al realizar estudios con celdas de flujo, es importante tener en cuenta la flotabilidad de las perlas y la química de la superficie de los coloides y colectores. Al reducir la escala al régimen microfluídico, los efectos de superficie pueden dominar los fenómenos observados. Prácticamente cualquier estructura física se puede incorporar en el diseño de celdas de flujo microfluídico.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.