Multicolor análisis de citometría de flujo de la respuesta inmune celular en macacos rhesus

Este video muestra un procedimiento para estimular y teñir células mononucleares de sangre periférica o pbmc. Para el análisis de citometría de flujo multicolor, se colocan Alec Watts de pbmc aislado de sangre total en placas de cultivo de tejidos. Las células se estimulan química o biológicamente para producir una respuesta inmunitaria.

Después de la estimulación, se añade un cóctel de anticuerpos para identificar los tipos de células en función de los marcadores de superficie expresados. A continuación, las células se impregnan y se añade un cóctel diferente de anticuerpos para detectar la expresión de citocinas intracelulares, las células se analizan para determinar los perfiles de citocinas para subconjuntos específicos de pbmc. Hola, soy Amy Courtney del laboratorio del Dr. Jagan SAS en el Departamento de Inmunología del Centro Oncológico MB Anderson de la Universidad de Texas.

Hola, soy Hong ella también del laboratorio. Hoy te mostraremos un análisis multicitométrico de las respuestas de las células T. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las respuestas inmunitarias celulares en la Maca Reus.

Así que comencemos. Comience este protocolo utilizando un hemocitómetro para determinar los recuentos de células viables de pbmc de Reuss Maca mediante el método de exclusión de Trian Blue Dye. Trabajando en una campana de flujo laminar reus.

Suspender las células en medio completo a una concentración de 10 millones de células por mililitro para la estimulación inespecífica a 100 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Luego agregue 100 microlitros de medio que contenga PMA y CIN para llevar el volumen total a 0.2 mililitros con una concentración final de 50 nanogramos por mililitro PMA y 500 nanogramos por mililitro CIN para pocillos de control negativo, agregue 100 microlitros de medio completo solo a cada uno. Incubar bien las células a 37 grados centígrados en la atmósfera humidificada de dióxido de carbono al 5% después de 1,5 horas.

Un felden A al cultivo a una concentración final de 10 microgramos por mililitro y se incuba durante 4,5 horas adicionales. El felden A se añade a las citoquinas atrapadas en el aparato G de oro para aumentar la visibilidad con inmunotinción, después de la centrífuga de estimulación para eliminar el medio y luego se lava añadiendo 200 microlitros de lavado de flujo frío, tampón y centrífuga a baja velocidad. Repita este lavado, luego vuelva a enviar 50 microlitros de tampón de lavado de flujo.

Las células ya están listas para ser teñidas para la expresión de marcadores de superficie en cada pocillo de las células resuspendidas. Agregue un microlitro de tinte reactivo acuático fluorescente fijable de muertos vivos preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante y S. Incubar a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante 30 minutos mientras las células se incuban.

Prepare las soluciones de tinción que se utilizarán para los hechos en microtubos. Primero, prepare un cóctel de pie para incluir lo siguiente de manera adecuada. Anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia titulada, anti CD tres, PE SCI siete, anti CD ocho, Alexa 700, anti CD 28 por CCP SCI 5.5, anti CD 95 A, PC y anti CD cuatro Pacific Blue Inflow Wash Buffer.

A continuación, prepare controles de compensación, que se utilizarán para determinar los coeficientes de desbordamiento de cada tinción individual en otros detectores mediante la preparación de un tubo de cada anticuerpo conjugado con fluorescencia individualmente como una tinción de un solo color. Por último, prepare las tinciones de fluorescencia menos uno o FMO combinando todos los reactivos menos el que le interese. Esto se utilizará para determinar el límite entre una población positiva y negativa duplicando los niveles de autofluorescencia y los datos presentes en muestras completamente teñidas.

Después de que las células se hayan incubado en la mancha de muertos vivos, lávelas una vez con un tampón de lavado de flujo frío para eliminar el exceso de tinte, aspire el tampón de lavado. A continuación, añada las soluciones de tinción preparadas. Incubar las células a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante 30 minutos.

Lave las células teñidas con tampón de lavado de flujo frío para eliminar el exceso de anticuerpos. A continuación, añada 100 microlitros de solución de permeación de fijación BD durante al menos 10 minutos. Almacene las células a cuatro grados centígrados en la oscuridad hasta 24 horas hasta que se usen o continúen marcando las citocinas intracelulares para etiquetar las citocinas intracelulares.

Primero perme las células en 100 microlitros de una permanente X. Lavar el tampón, incubar durante 10 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad mientras las células se incuban. Prepare los anticuerpos de tinción, los controles de compensación y los controles FMO en un tampón de lavado x permanente como antes.

Después de que las células se incuben durante 10 minutos, gire hacia abajo y retire el tampón de lavado de una x permanente. Agregue los anticuerpos de tinción apropiados. A continuación, incubar las células y los anticuerpos durante 60 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad después de la incubación.

Lave las células dos veces con la solución de permeación. Después del lavado final, resus suspende las células en aldehído 1%Paraform en DPBS para fijar las células. Guarde las celdas a cuatro grados centígrados en la oscuridad hasta que se usen hasta por 24 horas.

Una vez que se hayan teñido las células, use un citómetro de flujo LSR de dos o un citómetro de flujo DP cian para realizar hechos. A continuación, analice los datos utilizando FlowJo o un software similar. La composición de PBMC en Maca reuss se determinó mediante análisis de fax.

Esta figura muestra el esquema de compuerta utilizado para el análisis de los diferentes subconjuntos de células T de un animal representativo. Los linfocitos se comprimieron primero a través de FSC de dispersión directa frente a SSC de dispersión lateral y luego se identificaron los linfocitos vivos en función de la población SSC y AQUA negativa. A continuación, se identificaron las células T mediante la expresión de CD tres, CD cuatro positivos, CD ocho negativos y CD cuatro negativos, también se determinaron las poblaciones de células T CD ocho positivas dentro de la población de células T CD tres positivas.

Los linfocitos T CD cuatro positivos y CD ocho positivos se distinguieron en diferentes subconjuntos sobre la base de la expresión de CD 28 y CD 95 como células de memoria central ingenuas y células de memoria efectora. Esta figura muestra la producción de interferón gamma e IL dos en No estimulado y pma. La NIC estimuló la CD con cuatro células T positivas y subconjuntos.

Obsérvese los distintos perfiles de citocinas provocados por la estimulación. En cada subconjunto. Tenemos que mostrarle cómo realizar el análisis de citometría de flujo múltiple de pbmc.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar configurar los controles de compensación de color único y los controles fluorescentes menos uno. Ambos controles son necesarios para el análisis adecuado de los datos de citometría de flujo. Consulte nuestro protocolo escrito para obtener más información sobre cómo elegir controles de compensación.

Además, recuerde que cuando se utilizan anticuerpos marcados con fluorescencia, es importante cubrir las muestras para protegerlas de la exposición a la luz. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.