La importancia de la concentración de la proteína correcta para la cinética y la determinación de afinidad en el análisis de la estructura-función

El objetivo general de este artículo de video es proporcionar respuestas a las siguientes dos preguntas. En primer lugar, ¿se pueden realizar estudios de las interacciones de las proteínas de forma más fiable midiendo la fracción de una muestra de proteína que es realmente capaz de unirse a otra proteína? Dos, ¿cómo puede el análisis cinético darnos una mejor comprensión de la estructura, las relaciones funcionales?

Ambas preguntas se abordarán en un experimento con Corp X 100, un instrumento que detecta interacciones de proteínas en tiempo real sin usar etiquetas. Este experimento examinará la interacción de la cistatina B bovina con la cistina proteasa papaína, la estructura cristalina de las dos proteínas en complejo apunta a varios residuos involucrados en la unión a la proteasa para determinar cómo cada uno de los residuos que interactúan afecta la interacción de la cistatina B papina. Varias variantes de cistatina B se producen a través de la mutagénesis dirigida al sitio.

En tales experimentos, siempre existe la posibilidad de que las proteínas recombinantes no se plieguen correctamente, se agreguen o se deterioren, lo que lleva a resultados incorrectos e irreproducibles. VIACORE X 100 tiene la capacidad de determinar la fracción de proteína que está disponible para unirse mediante el análisis de concentración libre de calibración abreviado CFCA. Este enfoque permite determinar la concentración de proteína con actividad de unión retenida incluso cuando los estándares de calibración no están disponibles.

En este caso, se utilizará CFCA para determinar la concentración de las variantes de cistatina B. Estos datos se utilizarán como insumo en la determinación de la cinética de unión de las variantes de cistatina B a la pepina, que también se evalúa utilizando BOR X 100. Hola, soy CLA gram de GE Healthcare en Suecia.

Hoy mi colega Eva Pool te mostrará cómo hacer un análisis de la relación de la función estructural utilizando BOR X 100 Las proteínas recombinantes pueden exhibir un plegamiento inadecuado o una actividad de bin suelto con el tiempo, y este comportamiento no puede ser detectado por métodos que se basan en la medición de la concentración total. En efecto, esto puede dar lugar a datos cinéticos incorrectos después de las mediciones de concentración mediante el análisis de concentración libre de calibración. B.A core X 100 se utiliza para analizar la cinética y la afinidad de la interacción de las variantes de cistatina B con el pepane.

Estos parámetros darán una idea del mecanismo de enlace. Comenzamos con una breve explicación del diseño experimental, así que comencemos. La interacción entre la cistina, la proteasa, la papina y el inhibidor cistatina B está dominada por contactos hidrofóbicos, como lo revela la estructura cristalina de las dos proteínas en complejo.

Desde el lado del inhibidor, las áreas de contacto son los terminales N y C Ns y dos bucles de horquilla. En este estudio, se examinan cuatro mutantes, cada uno de los cuales contiene cisteína tres a la mutación siria introducida para prevenir la dimerización: cistatina B. Según el contexto revelado en la estructura cristalina, la leucina 73 se mutó a glicina, la histamina 75 a glicina y la tirosina 97 se cambió a alanina. Las dos mutaciones de glicina se introdujeron para examinar la importancia de las cadenas laterales de histidina 75 y leucina 73 para la unión a la peguina, el residuo de tirosina se mutó a alanina para investigar la interacción entre el extremo C de la cistatina B y la pepina.

Los tres mutantes dobles, así como el tres de INE a un mutante único sirio, se prueban para determinar su interacción con una variante catalymente inactiva de la papaína S metil popina. Esta forma catalmente inactiva del Proteus tiene un grupo metilo unido a CYS 25 en la hendidura activa. Para simplificar, llamaremos a esta variante propan en todo el protocolo.

El CFCA se basa en la medición de la velocidad de unión en condiciones en las que la velocidad está limitada por la difusión de las moléculas de analito a la superficie. Esto se ve favorecido por los altos niveles de inmovilización del ligando. Antes de iniciar el procedimiento de inmovilización, coloque el tampón HEPs utilizado en los experimentos en la bandeja izquierda e inserte ambos tubos.

Coloque también una botella de residuos vacía en la bandeja de la derecha. A continuación, inserte un nuevo sensor de yeso cinco en el instrumento inicializado a través del software core X 100 y, en la pantalla de inicio, haga clic en el elemento de la herramienta de chip de acoplamiento. Haga clic en iniciar documento en el software.

A continuación, use el asistente de inmovilización para configurar el pape y la inmovilización apuntando el acoplamiento a la censura CM cinco desde la pantalla de inicio, haga clic en el botón de otras opciones, luego seleccione asistentes. Esto muestra una ventana con los asistentes disponibles. Seleccione inmovilización y luego haga clic en el botón nuevo En la parte inferior derecha, aparece la primera pantalla del asistente de inmovilización con el objetivo de acoplamiento al sensor de yeso cinco es el predeterminado.

Marque la casilla debajo de la celda de flujo dos para inmovilizar en la celda de flujo dos. La celda de flujo uno se deja sin modificar para usarla como superficie de referencia de las tres opciones disponibles a continuación. Marque la casilla especificar tiempo de contacto en el nivel de destino derecho cambia a tiempo de contacto, especifique un tiempo de contacto de 900 segundos.

A continuación, ingrese los parámetros de inmovilización en la captura de la solución de ligando de corte de molécula. Entra la papaína. A continuación, haga clic en Siguiente.

La siguiente pantalla muestra la disposición del estante de muestras. La posición uno mantendrá et etanolamina utilizada para desactivar el activo restante después del acoplamiento del ligando papaína a la superficie del chip. Inserte la solución de etanolamina en la posición uno en la posición dos.

Coloque el ligando papaína la papaína se almacena en un exceso de sulfato de metilo y se alude a 50 microgramos por mililitro en tampón de acetato de sodio de 10 milimolares. pH 4.5 reconstituir los reactivos de acoplamiento EDC y NHS del kit de acoplamiento de aminas con pipeta de agua destilada doble 85 microlitros de EDC en un vial. Tápalo y colócalo en la posición tres.

Utilice el mismo volumen para NHS en la posición cuatro. Observe que el archivo cinco debe estar tapado y vacío para que el instrumento mezcle ED, C y NHS en este archivo. Recuerde también llenar la lima de lavado en la posición H2O con agua desionizada fresca.

Cuando el bastidor esté lleno de acuerdo con el contorno de la pantalla, haga clic en cargar muestras y cargue el bastidor en el instrumento. Cuando el bastidor esté cargado, haga clic en siguiente. Antes de iniciar la ejecución, se muestra una lista de comprobación.

Asegúrese de que todas las viñetas se cumplan cuando lo estén. La ejecución se inicia pulsando el botón de inicio. La carrera se inicia durante el procedimiento de inmovilización.

Los datos se recopilan en tiempo real. En primer lugar, se inyectan los reactivos de acoplamiento. A continuación, el pape se acopla a la superficie de la viruta y el procedimiento finaliza con la desactivación de los ésteres activos restantes.

Después de la ejecución, una ventana de diálogo resume el resultado de la ejecución. En esta ventana, se muestra el nivel de inmovilización. Todo el procedimiento de acoplamiento debería dar como resultado aproximadamente 3000 RU de papaína inmovilizada.

Una vez que la papaína se haya inmovilizado en el chip sensor, comience el análisis de CFCA diluyendo las muestras de mutante de cistatina B a una concentración total de aproximadamente 10 nanomolares en al menos 300 microlitros. Registre el factor de dilución, ya que lo utilizaremos más adelante en la configuración del ensayo. Comience abriendo el cuadro de diálogo del asistente como se describe en la sección anterior en la sección de concentración de la carpeta de ensayo.

Elija calibración libre y, a continuación, elija nuevo. La primera pantalla del asistente muestra la secuencia de inyección. Los ajustes pueden permanecer sin cambios, ya que aquí se utilizan el chip sensor CM five y un enfoque de ensayo de inmovilización directa.

Haga clic en siguiente en la siguiente pantalla. Deje activadas las casillas de verificación primero antes de ejecutar y ejecutar los ciclos de inicio. Además, deje el número predeterminado de ciclos de inicio sin cambios en tres.

Introduzca el búfer de montones en el nombre del campo de la solución. A continuación, haga clic en Siguiente. En la siguiente pantalla, ingrese el nombre de la solución de regeneración, que es hidróxido de sodio de 20 milimolares.

Deje los demás parámetros sin cambios. Haga clic en siguiente para ver la tabla de ejemplo. Configure las muestras de acuerdo con la tabla de muestras.

Cada fila de la tabla de ejemplo da como resultado dos ciclos. Uno con un caudal de 10 microlitros por minuto y otro con 100 microlitros por minuto. Comience la carrera con un espacio en blanco.

Luego ingrese el nombre del factor de dilución, el coeficiente de difusión a 20 grados Celsius y el peso molecular. Para cada mutante, el coeficiente de difusión se puede calcular utilizando la herramienta web en el sitio web del producto. Se proporciona un enlace a esta herramienta en el navegador de soporte del software.

Dado que se recomienda ejecutar cada muestra y duplicarla, copie toda la tabla desde la fila en blanco hasta la última muestra y péguela en la parte inferior de la tabla. Haga clic en siguiente para continuar. La siguiente pantalla muestra el rack de muestras.

Coloque las muestras y los reactivos en el bastidor de acuerdo con el diseño descrito por el software. Cargue el rack en el instrumento pulsando el botón de carga de muestras. A continuación, haga clic en Siguiente.

Después de cargar las muestras, se muestra una pantalla de recordatorio con una lista de comprobación. Asegúrese de verificar todo y luego presione inicio. Los datos se recopilan en tiempo real durante la ejecución.

Una vez finalizada la ejecución, cierre la ventana que muestra los datos recopilados. Observe que ha aparecido un nuevo elemento de resultado en la ventana principal. Para calcular las concentraciones a partir de los datos, seleccione el nuevo elemento de resultado y haga clic en el botón.

Evalúe a través del núcleo X 100. El software de evaluación se inicia mostrando todos los datos recopilados desde la barra de herramientas, seleccione el análisis de concentración y luego la calibración libre en el menú. En la primera ventana, elija los datos que desea incluir en el análisis.

Desplácese por la lista y recorra la lista de vistas para ver los datos de todas las muestras. Si desea excluir algún dato, quite la marca de verificación de la lista. Haga clic en siguiente para iniciar el cálculo.

El modelo de interacción CFCA se ajusta automáticamente a los datos experimentales cuando se completa el ajuste, los resultados se informan para cada muestra en la ventana de resultados. Recorra los accesorios de cada muestra seleccionando la fila correspondiente en la tabla. La columna llamada concentración medida muestra la concentración en la muestra que se analizó.

La concentración en la muestra original se calcula utilizando el factor de dilución ingresado anteriormente y se muestra en la columna concentración calculada cuando esté listo, haga clic en finalizar para guardar el resultado. Ahora que conocemos las concentraciones de las proteínas del análisis de CFCA, tenemos una excelente base para nuestras mediciones cinéticas posteriores. El análisis cinético ahora nos ayudará a comprender la importancia de los residuos de aminoácidos clave para el mecanismo de unión.

Comencemos con una configuración del análisis cinético. El análisis cinético comienza acoplando un nuevo chip sensor CM five en el instrumento en la pantalla de inicio. Elija crear un flujo de trabajo de ensayo para la afinidad de la cinética.

En la esquina superior izquierda, aparece una ventana de diálogo donde se introduce información sobre el ligando. Ingrese el nombre papaína en el cuadro del nombre del ligando y elija otra proteína de la lista de tipos de especies. A continuación, seleccione inmovilizar el ligando de forma covalente utilizando el chip sensor CM cinco de los dos enfoques alternativos de fijación de ligandos presentados, el flujo de trabajo de ensayo recomendado se describe ahora en el lado derecho de la ventana.

Comienza con una etapa de inmovilización seguida de una etapa de ensayo. Presione continuar para continuar. Guarde el flujo de trabajo de ensayo según lo solicitado introduciendo un nombre y pulsando guardar.

El software ahora describe el flujo de trabajo de ensayo con botones asociados a cada paso. El primer paso en la preparación de la superficie del sensor es encontrar un pH de movilización. Dado que este pH es conocido, presione ingresar valor conocido en el cuadro de diálogo que aparece.

Introduzca el nombre del tampón, el acetato y el pH 4,5 y elija guardar. El flujo de trabajo del ensayo ahora se actualiza con una marca de verificación verde para indicar que este paso se ha completado. Ahora es el momento de inmovilizar, presione el botón de correr en el paso inmovilizado.

Esto hace que aparezca el mismo asistente que se usó para el propano y la inmovilización para el análisis de CFCA, la inmovilización de papina para el análisis cinético se configura de la misma manera aquí, excepto que se inyecta una solución más diluida durante menos tiempo. Esto es con el fin de inmovilizar menos papin para evitar situaciones en las que las tasas de unión de los mutantes de cistatina estén limitadas por difusión para que los datos cinéticos puedan medirse de forma aislada. Dado que el nombre del ligando y el pH de inmovilización se introdujeron en los pasos anteriores del flujo de trabajo del ensayo, ambos están preestablecidos aquí.

La única actualización requerida es de 50 segundos para el tiempo de contacto. A continuación, la inmovilización procede como se ha mostrado anteriormente. El enlace esperado después del nivel de inmovilización es de 50 R ru.

Una marca de verificación verde junto al botón de ejecución indica que la inmovilización se ha completado. A continuación, introduzca la solución de regeneración en el flujo de trabajo en el paso. Busque las condiciones de regeneración haciendo clic en introducir valores conocidos en el cuadro de diálogo que aparece.

Introduzca la solución de regeneración y el tiempo de contacto. A continuación, haga clic en Guardar. Ahora que el ligando está inmovilizado y se ingresan las condiciones de regeneración, todo está configurado para generar datos cinéticos en el cuadro de ensayo de afinidad de cinética de ejecución, presione el botón de ejecución el primer paso en la cinética.

El asistente de afinidad describe la secuencia de inyección de cada ciclo para la cinética de ciclo único, que se utiliza aquí, no es necesario cambiar nada. Haga clic en siguiente para continuar. En el siguiente paso, mantenga la configuración predeterminada que indica el cebado del sistema antes de la ejecución.

Elija ejecutar un ciclo de inicio para equilibrar la superficie del chip. A continuación, defina los parámetros de inyección para la muestra. Dado que la solución de regeneración se especificó anteriormente y la configuración está predefinida, no es necesario cambiar ninguno de los parámetros en la pantalla.

Haga clic en Siguiente. Por último, especifique las muestras. Introduzca dos filas para cada variante mutante, una en blanco y la otra con muestra.

Un ciclo de blanco se indica ajustando el parámetro de concentración más alto a cero. Dos. Las variantes de cistatina B pueden caber en cada corrida. Para cada mutante, ingrese el peso molecular, la concentración más alta y el factor de dilución, presione siguiente.

En la siguiente pantalla, se describe el estante de muestras. Prepare una serie de diluciones de las muestras de proteínas y coloque los viales con tapas en la gradilla Como se indica en la pantalla, se coloca un vial con tampón en la posición 13 y un vial con la solución de regeneración se coloca en la posición 14. Asegúrese de llenar la posición de agua con agua dulce.

Coloque el bastidor en la máquina y cargue las muestras presionando el botón cargar muestras y haga clic en siguiente. Al igual que antes, realice una comprobación final antes de continuar con la ejecución del experimento pulsando Iniciar Los datos de interacción aparecen en tiempo real. Una vez finalizada la ejecución, proceda inmediatamente a ejecutar las variantes restantes de cistatina B de acuerdo con lo que se acaba de demostrar.

Si las variantes restantes de cistatina B se ejecutan en sucesión, omita el paso principal y el ciclo de inicio desmarcando las casillas de verificación correspondientes en el paso. Cuando se realiza cada ejecución, se puede acceder a los datos desde el enlace. Todos los resultados en el flujo de trabajo del ensayo.

Aparecerá una ventana de diálogo con todos los resultados generados dentro de este flujo de trabajo. Para calcular las constantes de velocidad cinética, seleccione el resultado a evaluar y presione evaluar ser un software de evaluación central X 100 se inicia nuevamente mostrando todos los datos colectivos. Seleccione Afinidad cinética en el menú de la barra de herramientas.

En la primera pantalla, se selecciona la cisteína tres a la mutante siria para su evaluación. Los datos de este mutante se muestran junto con la ejecución en blanco realizada para este mutante haciendo clic. Próximo. La siguiente pantalla muestra los datos con la ejecución en blanco restado de la ejecución con muestra.

Elija evaluar la cinética haciendo clic en el botón cinética. Ahora elija ajustar los datos a un modelo de interacción uno a uno. Al hacer clic en el botón ajustar, el ajuste se muestra en la pantalla a medida que se calcula.

Una vez que está listo, los controles de calidad se aplican automáticamente y se resaltan en la parte inferior. Revise los elementos de control de calidad y luego observe los datos de gramos del sensor para asegurarse de que los gramos del sensor muestren suficiente curvatura. Además, eche un vistazo a la gráfica residual que muestra las diferencias entre los datos recopilados y el modelo ajustado.

Preste atención a las desviaciones sistemáticas y no aleatorias. Este ajuste es aceptable. Ahora eche un vistazo a los datos cinéticos en la pestaña de informes.

La constante de velocidad de asociación, la constante de tasa de disociación y la constante de disociación de equilibrio. Cuando termine, presione finalizar y repita el mismo procedimiento para todos los demás mutantes. Estos son los resultados representativos del análisis de CFCA para las diferentes variantes de cistatina B examinadas.

Los datos específicos de concentración de unión se extraen de los gramos del sensor obtenidos a caudales de 10 y 100 microlitros por minuto. Al comparar la concentración determinada por una medición de dos 80 con la determinada por CFCA, está claro que, si bien en la mayoría de los casos la proteína es completamente activa para la variante de glicina leucina 73, la fracción de proteína activa es muy baja. La cinética de las variantes de cistatina B que se unen a la pepina se determina mediante cinética de ciclo único.

Los gramos del sensor muestran datos en blanco y datos sustraídos de referencia con cinética para un modelo de interacción uno a uno superpuesto en negro. La concentración de unión específica medida por CFCA para la variante de leucina 73 es solo alrededor del 10% de la concentración total de proteína, según lo determinado por una medición de dos 80. Al utilizar la concentración correcta en el cálculo de los parámetros cinéticos, queda claro que la tasa de asociación de Lucien 73 es similar a la de las otras variantes.

Si bien las tasas de asociación de los mutantes son comparables a las de la proteína de tipo salvaje, la constante de la tasa de disociación de los mutantes puede ser mayor en cerca de dos órdenes de magnitud con un aumento correspondiente en la constante de disociación de equilibrio. La reducción de las afinidades depende principalmente del aumento de las tasas de disociación, lo que indica que tanto el segundo bucle de unión como el extremo C terminal de la cistatina B contribuyen a la afinidad de unión al mantener el inhibidor unido a la enzima una vez que se ha formado el complejo, el uso del análisis de concentración libre de calibración fue esencial para esta conclusión porque uno de los mutantes resultó tener una actividad de unión muy baja, Mi colega Pol le ha mostrado ahora cómo utilizar bi core X 100 en un estudio de funciones estructurado. Al realizar estos experimentos, es importante recordar que, aunque tanto la concentración como el análisis cinético se basan en el mismo procedimiento de unión, las condiciones experimentales son bastante diferentes.