Name: Microfluidos Co-cultivo de células epiteliales y bacterias para la Investigación de la señal mediada Soluble Interacciones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-20T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Aprende a cultivar células epiteliales HeLa y bacterias E. coli en un dispositivo microfluídico tricapa para estudiar la colonización por EHEC mediante microscopía de fluorescencia. Este modelo simula el tracto gastrointestinal humano.

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Este trabajo fue apoyado en parte por la National Science Foundation (CBET 0846453) y los Institutos Nacionales de Salud (1R01GM089999).

1. Fabricación de los maestros de silicio estándar con SU-8 fotolitografía 1 (no se muestra en este video). <ol><li> El uso estándar de SU-8 métodos de fotolitografía para crear un SU-8 "maestros" (SU-8 2050, MicroChem, Newton, MA) para la fabricación de los diferentes componentes (PDMS de diferente grosor, el co-cultivo de la cámara) en una sala limpia. Moldes como maestro se pueden fabricar en cualquier centro de microfabricación (por ejemplo, Stanford microfluídica de fundición; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Antes de la replicación PDMS, exponer el SU-8 maestros a fluorosilane vapor en un desecador conectado a una fuente de vacío para facilitar la liberación fácil de PDMS del maestro. Añadir una gota de fluorosilane a una toalla de papel y aplicar vacío durante un minuto. Retire el vacío y dejar 30 minutos para la deposición de fluorosilane. Mantenga el SU-8 maestro en un recipiente cerrado para su uso futuro. </li></ol> 2. Replica moldeo de PDMS de SU-8 master 2 <ol><li> La capa de fluido y la capa de control son realizadas por moldeo réplica de PDMS de SU-8 maestro. </li><li> Mezclar el PDMS pre-polímero y la cruz enlazador en un peso de 10:01. relación y desgasificar en un desecador durante una hora (o hasta que las burbujas de aire de la mezcla de PDMS). </li><li> Coloque el SU-8 maestro en una placa de Petri y con cuidado vierta la mezcla de PDMS en la parte superior de la SU-8 maestro. Desgasificar la PDMS nuevo. </li><li> Girar el molde a 1200 rpm durante un minuto para conseguir un espesor uniforme PDMS de alrededor de 100μm en el molde. </li><li> Calentar la cápsula de Petri que contiene el PDMS y el SU-8 molde maestro a 80 ° C durante una hora para curar el PDMS. </li><li> Quite la cubierta de curado PDMS SU-8 maestros de la placa. </li><li> Pelar el molde de PDMS del maestro SU-8. </li><li> Perfore cuatro agujeros en el molde de PDMS con un calibre 20 de extremo romo de la aguja dos entradas de bacterias, una toma de corriente y un puerto de neumáticos. </li></ol> 3. La unión de varias capas dispositivos PDMS: Este dispositivo se monta con tres capas: una capa superior que contiene el canal principal, una capa de neumático medio, y una capa inferior de bacterias que contiene los canales para las bacterias. Las tres capas se montan como se describe a continuación. <ol><li> Húmedas las membranas de PDMS con metanol y con cuidado la cáscara de la SU-8 molde maestro utilizando pinzas limpias. Coloque la membrana en una hoja de teflón. </li><li> Coloque la membrana de neumáticos y la capa de fluido en una cámara de plasma de oxígeno. A su vez en el plasma durante 40 segundos (la presión de oxígeno 10 sccm, RF 100W). </li><li> Después de la exposición al plasma, alinee (10 minutos) de la membrana en la parte inferior del canal PDMS el uso de fórceps. Adición de metanol en la membrana y ayuda a las capas PDMS libre circulación de las capas, y hace que la alineación sea más fácil. En este caso, el dispositivo se coloca en un trozo de gasa para permitir que los vapores de metanol para escapar. </li><li> Curar las capas alineadas PDMS sobre una placa a 80 ° C durante 8 h. </li><li> Después de la unión de la membrana neumática en la capa inferior, repita los pasos 3,2 a 3,4 para unir el canal superior en el dispositivo montado compuesto PDMS. </li></ol> 4. Montaje del dispositivo de PDMS 3,4 <ol><li> Taladrar agujeros en los puertos de entrada y salida utilizados para la siembra de las células eucariotas y las bacterias. </li><li> Conecte el tubo Tygon (0,01 pulgadas OD) a los puertos y operar la capa de neumáticos tirando con una jeringa de 20 ml. </li><li> Coloque el modelo de PDMS y un portaobjetos de vidrio pre-limpieza en una cámara de plasma de oxígeno. A su vez en el plasma durante 20 segundos (la presión de oxígeno 20 sccm, RF de 300 vatios), sin aplicar el vacío. </li><li> Con el fin de evitar el contacto entre la isla de la pared (PDMS) de unión a la lámina de vidrio, inmediatamente conecta una jeringa en el dispositivo y aplicar vacío tirando de la jeringa y manteniéndolo en su lugar. </li><li> Presione suavemente el modelo de PDMS sobre el vidrio (en 2 minutos). </li><li> Cure el dispositivo PDMS a 80 ° C durante 10 minutos. </li></ol> 5. El tratamiento de la superficie del vidrio con la fibronectina <ol><li> Esterilizar dispositivo bajo UV durante 15 minutos después de la conexión de tubos Tygon para cada puerto. </li><li> Llena y el flujo de la esterilización en el canal PBS para eliminar los desechos en el canal. Aplicar el flujo de 10 minutos para eliminar las burbujas de aire. Las burbujas de aire pueden escapar fácilmente el PDMS, debido a su permeabilidad a los gases. </li><li> Llene una solución de tinte de color en el canal de neumáticos para evitar la formación de burbujas de aire en el canal. </li><li> Para facilitar la siembra de células eucariotas en el cristal, introducir un 1 mg / ml de solución de fibronectina en el dispositivo y se incuba durante 40 min a 37 ° C. </li><li> Lavar el exceso de fibronectina con 1 ml de medio de crecimiento. </li></ol> 6. Formación y medición de los comensales E. coli en el biofilmislas <ol><li> Diluir las bacterias comensales (por ejemplo, E. coli BW25113/pCM18) en los medios de comunicación M9 mínimo de OD 600 ~ 1 para la formación de un biofilm comensales en la puerta cerrada / islas. </li><li> Cerca de la pared isla mediante la aplicación de presión positiva-líquido. Un casero de aire-líquido del convertidor de presión se utiliza para prevenir la formación de burbujas de aire en el canal. </li><li> Introducir el comensal E. coli en las islas con la válvula cerrada, y permitir que las bacterias para fijar durante 1 hora a 32 ° C. </li><li> Lavado de las bacterias sin ataduras y perfundir una suspensión diluida bacteriana (OD 600 ~ 0,05) en 0.25mL/hr durante 12 horas. </li><li> Enjuague la biopelícula con los medios de cultivo DMEM fresco para eliminar las bacterias débilmente unidos y prepararse para la fijación de las células eucariotas. </li><li> La imagen de la biopelícula con una Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope (Bannockburn, IL), y visualizar la arquitectura de biofilm con el software Imaris 5. </li></ol> 7. La siembra de las células eucariotas alrededor de las islas bacteriana 6-8 <ol><li> Trypsinize células HeLa del frasco de cultivo de tejidos y resuspender en DMEM los medios de comunicación para una densidad de siembra de 5 x 10 5 células / ml. </li><li> Introducir células HeLa en el dispositivo con un caudal de 2 ml / min usando una bomba de jeringa Picoplus (Harvard Apparattus, MA). Asegúrese de que el muro de la isla es baja por lo que la biopelícula bacteriana es independiente de la región de células HeLa. Este paso se debe realizar en el escenario de un microscopio de luz para que la uniformidad de la siembra se puede determinar. </li><li> Abrazadera de la toma de células para reducir el movimiento de la suspensión de células en el canal y se incuba durante 6 horas a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Perfundir el dispositivo con el medio de crecimiento a 0,5 mL / h para eliminar las células sueltas. </li><li> Actualizar los medios de comunicación DMEM de HeLa y E. comensales coli, cada 6 horas. </li></ol> 8. Introducción de bacterias patógenas en la isla y la exposición a las células eucariotas <ol><li> Prepare E. coli O157: H7 (ECEH) para infectar las células HeLa a una multiplicidad de infección (MOI) de 100:1 200:1 (número de células HeLa por ECEH). </li><li> Enjuagar y lavar las bacterias comensales débilmente unidos. </li><li> Introducir una suspensión diluida EHEC (OD 600 ~ 0,1) en las islas. </li><li> Incubar dispositivo a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora durante 6 horas sin flujo para permitir que ECEH de estar expuestos a las señales presentes en el biofilm comensales. </li><li> Levantar el muro de PDMS para exponer por ECEH en las islas comensales a las células HeLa durante 6 horas. </li><li> Enjuague el canal PBS y la mancha de células vivas y muertas utilizando el kit de Live / Dead (L3224, Invitrogen, CA). </li><li> Lugares de múltiples imágenes en un microscopio Zeiss Axiovert 200M fluorescencia y estimar el número de células vivas y muertas. </li></ol> 9. Los resultados representativos 9 La secuencia de eventos en las infecciones del tracto GI fue imitado por el desarrollo de una monocapa de células HeLa y E. comensales coli biofilm y la exposición de ECEH de la biopelícula comensales antes de la infección de células HeLa. Los pasos involucrados en la fabricación de la co-cultivo de microfluidos del modelo se muestra en la Figura 1. Figura 2A muestra una representación en 3 dimensiones del dispositivo de co-cultivo. Las dos regiones en el dispositivo de co-cultivo de la cámara de cultivo de células eucariotas y la isla de bacterias se muestran en la Figura 2B con tintes de diferentes colores (morado para las regiones eucariotas y verde para la isla de bacterias). La posibilidad de aislar a las regiones de cultivo bacteriano de la región circundante eucariotas se muestra en la Figura 2C el uso de tintes de color. Figura 3 muestra los resultados representante de co-cultivo de células epiteliales y bacterias. Figura 3A muestra la colonización del biofilm comensales (verde) por la isla ECEH (rojo). Figura 3B muestra la yuxtaposición de las células epiteliales y E. comensales coli con ECEH en la isla de bacterias. El PP expresa ECEH y las buenas prácticas agrarias expresar las bacterias comensales se localizan en la isla cuando la pared PDMS se reduce, lo que demuestra la viabilidad de aislar a la isla de bacterias de las células epiteliales. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Esquema de la siembra celular en el modelo de co-cultivo. (1) El muro de PDMS se reduce para formar una isla, las bacterias comensales son introducidos en la isla, y fibronectina se corría alrededor de la isla. (2) células HeLa se siembran en las regiones que rodean la isla. (3) Después de llegar a las células HeLa confluencia y el biofilm comensales ha desarrollado, ECEH se introduce en la isla. (4) El muro de PDMS se levantapara exponer las células HeLa que rodean la isla de ECEH. El recuadro muestra los detalles de la operación de la válvula. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2a.jpg" alt="Figura 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2a"> <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2bc.jpg" alt="Figura 2bc" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2 AC"> Figura 2: Modelo de microfluidos para el co-cultivo de células epiteliales y bacterias. (A) en tres dimensiones versión del dispositivo de co-cultivo que muestra neumático accionado por regiones de captura para la formación de islas de las infecciones en las células epiteliales. Cada isla bacteriana (1200 m de diámetro y 1.000 m de distancia) tiene una entrada independiente y una salida para proporcionar medios de cultivo y la eliminación de los residuos de la isla. (B) Micrografía del dispositivo de co-cultivo con tintes de colores que muestra las diferentes regiones (zona de las células epiteliales, las islas de bacterias). (C) La fidelidad del sistema de recogida neumática se muestra mediante la reducción de la pared PDMS (panel izquierdo), utilizando un canal neumática activa (azul), la introducción de tinte púrpura en la cerrada islas, y colorante amarillo que fluye alrededor de ella durante 48 h. Cuando el muro se levanta PDMS (panel derecho), la región insular está expuesta al medio circundante de color amarillo. Barra de escala representa a 500 micras. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: Co-cultivo de células HeLa y bacterias. (A) Imagen de fluorescencia de RFP-expresando ECEH y que expresan GFP E. coli BW25113 en la isla. (B) Superposición de transmisión, verde y rojo, imágenes de fluorescencia en el dispositivo. Barra de escala representa a 200 micras.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
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<li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+sensing+hydrogel+microstructures+into+micropatterned+hepatocellular+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures.</a> Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).</li>
<li>Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+epithelial+cells+and+bacteria+for+investigating+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab-on-Chip%22%5BJournal%5D)">Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions.</a> Lab-on-Chip. , (2009).</li>
</ol>

Ensayos convencionales para la fijación y la colonización de patógenos utilizar una monocapa de células eucariotas en placas de cultivo de tejido en el que los agentes patógenos se agregan. Estos modelos no son fisiológicamente relevantes, ya que no incorporan un biofilm de bacterias comensales desarrollado en las células eucariotas. Simple adición de un cultivo de bacterias pre-convertido en células eucariotas es improbable que lleve a esta conformación, como los biofilms son muy organizadas las estructuras que se desa...

<table><tbody><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>máscara de fotolitografía de alta resolución (16.256 ppp)</td><td>Fineline-Imaging Inc, CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctil)silano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77279</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30002.02</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga programable</td><td>Laurell Tech Corp</td><td>WS0650S</td><td></td></tr><tr><td>alineador de máscara</td><td>Neurotronix</td><td>Q4000</td><td></td></tr><tr><td>grabador de plasma de oxígeno</td><td>March Plasma System, CA</td><td>CS-1701</td><td></td></tr><tr><td>bomba de jeringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilidad/citotoxicidad Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L-3224</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidos co-cultivo de células epiteliales y bacterias para la investigación de la señal mediada soluble interacciones

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

El ser humano gastrointestinal (GI) es un entorno único en el que las células epiteliales intestinales y no patógenas (comensales), las bacterias conviven. Se ha propuesto que el microambiente que el patógeno se encuentra en la capa de comensales es importante para determinar la extensión de la colonización. Los métodos actuales de cultivo para la investigación de la colonización de patógenos no son muy adecuadas para la investigación de esta hipótesis, ya que no permiten el co-cultivo de bacterias y células epiteliales de una forma que imita el microambiente del tracto gastrointestinal. Aquí se describe un co-cultivo de microfluidos modelo que permite a la cultura independiente de las células eucariotas y las bacterias, y probar el efecto del microambiente comensales en la colonización de patógenos. El modelo de co-cultivo se demuestra mediante el desarrollo de un comensal<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Biofilm entre las células HeLa, seguido por la introducción de enterohemorrágica<em&gt; E. coli</em&gt; (EHEC) en la isla de comensales, en una secuencia que reproduce la secuencia de eventos en infección del tracto GI.

Este protocolo describe un co-cultivo de microfluidos modelo de cultivo simultáneo y localizada de células epiteliales y bacterias. Este modelo se puede utilizar para investigar el papel de las diferentes señales moleculares solubles en la patogénesis, así como la pantalla de la supuesta eficacia de cepas de bacterias probióticas.

Microfluidos Co-cultivo de células epiteliales y bacterias para la Investigación de la señal mediada Soluble Interacciones

El tracto gastrointestinal (GI) humano es un entorno único en el que coexisten las células epiteliales intestinales y las bacterias no patógenas (comensales). Posee...

Este protocolo muestra el uso de un novedoso modelo de co-cultivo microfluídico que permite el cultivo independiente de células eucariotas junto con bacterias, para evaluar el efecto del microambiente comensal sobre la colonización por patógenos. El modelo de co-cultivo se demuestra mediante el desarrollo de un biofilm de Escherichia coli comensal entre células HeLa, seguido de la introducción de Escherichia coli enterohemorrágica o EHEC en la isla comensal, en una secuencia que imita la sucesión de eventos en la infección del tracto gastrointestinal.El grado resultante de colonización de células epiteliales por EHEC se visualiza mediante microscopía de fluorescencia. Hola, soy del laboratorio de biotecnología de sistemas moleculares del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad Texas y M. Hoy les mostraremos un procedimiento para cultivar bacterias y células eCard juntas en un dispositivo microfluídico, de una manera que imita la organización del tracto gastrointestinal humano.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cómo la colonización de la célula epitelial por bacterias patógenas se ve afectada por las señales que encuentran en el tracto tri antes de la colonización. Comencemos. Antes de realizar el experimento, prepare un molde de silicona diseñado y fabricado de acuerdo con el uso experimental previsto.Por ejemplo, la Stanford Microfluidics Foundry fabricará matrices diseñadas a partir de las cuales se pueden producir moldes réplica para experimentos posteriores. Se requieren moldes para dos membranas para la capa de cultivo celular eucariota y la capa neumática, y un canal bacteriano para el dispositivo de tres capas descrito en este protocolo; las alturas de los canales para las capas bacteriana, neumática y de cultivo celular eucariota son de 5, 200 y 100 micrómetros, respectivamente. Antes de preparar un molde réplica, exponga la matriz de SU-8 al vapor de fluorociclina en un desecador conectado a una fuente de vacío. Para facilitar la fácil liberación del molde de PDMS de la matriz, agregue una gota de fluoroelastómero a una toalla de papel en la cámara de vacío y aplique vacío durante un minuto.Retire el vacío y espere 30 minutos para la deposición de fluoro. Guarde el molde maestro SU-8 en una placa de Petri para su uso futuro en la creación de moldes réplica. Prepare el prepolímero de PDMS y el agente de entrecruzamiento en una proporción de peso de 10 a 1, mezcle bien y desgasifique la mezcla en una cámara de vacío durante una hora.Para eliminar las burbujas de aire, coloque el molde maestro SU-8 en una placa de Petri y vierta cuidadosamente PDMS sobre el molde maestro utilizando cinco gramos de PDMS para la y 30 gramos de PDMS para la capa bacteriana. Desgasifique nuevamente el PDMS durante 10 minutos para eliminar las burbujas de aire. A continuación, haga girar el molde durante un minuto para extender el PDMS en una membrana uniforme.En este protocolo, la membrana de cultivo celular eucariota se centrifuga a 1200 RPM durante un espesor de 150 micrómetros, y la membrana neumática se centrifuga a 800 RPM durante un espesor de 250 micrómetros. Después de la centrifugación, mantenga la placa de Petri que contiene el PDMS y el molde maestro SU-8 durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de calentarla en una placa calefactora a 80 grados Celsius durante una hora. Para curar el PDMS, después de la curación humedezca el PDMS con metanol y desprenda cuidadosamente los moldes maestros de SU-8 utilizando pinzas limpias.Coloque la capa bacteriana sobre un estereoscopio y, utilizando una aguja de extremo romo de calibre 20, perfore tres orificios: dos entradas para bacterias y una salida. El dispositivo de tres capas se ensambla en el siguiente orden: unión de la capa neumática a la capa bacteriana, y luego unión de la capa de cultivo de células eucariotas a la capa bacteriana más la capa neumática.Coloque la membrana neumática y la capa bacteriana sobre un portaobjetos de vidrio y expóngalas al plasma en una cámara de plasma de oxígeno durante 40 segundos, a una presión de oxígeno de 10 centímetros cúbicos estándar por minuto (SCCM) y una potencia de radiofrecuencia (RF) de 100 vatios. La adición de metanol en las membranas facilita el movimiento libre de las capas y hace más sencilla la alineación. Dentro de los 10 minutos posteriores a la exposición al plasma de oxígeno, coloque la capa bacteriana en una placa de Petri utilizando pinzas y un estereoscopio.Alinee la membrana neumática central con la capa bacteriana según los orificios de entrada y salida para las bacterias. Después de alinear, coloque la placa de Petri con la estructura de PDMS alineada sobre una placa calefactora a 80 grados Celsius durante ocho horas para lograr la unión. Una vez finalizado esto, taladre un orificio en la capa neumática para controlar el canal neumático.A continuación, repita los pasos desde el ensamblaje hasta la alineación para unir el canal de cultivo de células eucariotas al dispositivo compuesto de PDMS ya ensamblado. Perfore orificios en los puertos de entrada y salida utilizados para sembrar las células eucariotas. Conecte tubos de tigon a los puertos y opere la capa neumática tirando con la jeringa de 20 mililitros.Coloque la estructura compuesta de PDMS y una portaobjetos previamente limpiada en una cámara de plasma de oxígeno. Encienda el plasma durante 20 segundos sin aplicar vacío. Retire la estructura compuesta de PDMS de la cámara de plasma de oxígeno y conecte una jeringa de 20 mililitros a ella.Extraiga inmediatamente creando un vacío para evitar el contacto entre las válvulas y el vidrio. Deslice dentro de un minuto. Después de la exposición al plasma, presione suavemente la estructura de PDMS compuesta sobre el vidrio.Cure el dispositivo de PDMS en una placa calefactora a 80 grados Celsius durante 10 minutos. Después de esto, conecte tubos de teflón a cada puerto y esterilice el dispositivo bajo luz UV durante 15 minutos. A continuación, llene 500 microlitros de PBS estéril en una jeringa de un mililitro e introdúzcalos en el canal para eliminar cualquier residuo.Si se observa una burbuja de aire, sujete el tubo de salida con una microcentrífuga einor y aplique una ligera presión para forzar la salida de la burbuja a través de las capas de PDMS permeables al gas. Llene el canal neumático con agua estéril para evitar la formación de burbujas de aire en el canal.Se utiliza un convertidor casero de presión de aire a líquido para prevenir la formación de burbujas de aire en el canal neumático. Para preparar la siembra de células eucariotas sobre el vidrio, introduzca 500 microlitros de fibronectina en la región de cultivo celular mediante la entrada de cultivo de células eucariotas. Utilizando una jeringa, mantenga la válvula cerrada e incube durante 40 minutos a 37 grados Celsius.Finalmente, lave el exceso de fibronectina con un mililitro de medio de crecimiento utilizando la bomba de jeringa. El dispositivo ya está listo para usar en el experimento para formar un biofilm comensal; diluya las bacterias en medio mínimo M9 hasta una DO600 de aproximadamente uno. En este ejemplo, utilizamos una cepa de laboratorio de E. coli, pero se puede usar cualquier cepa bacteriana no patógena.Cierre la válvula que separa las regiones de cultivo celular bacteriano y eucariota aplicando presión líquida positiva. Introduzca 0,2 mililitros de e coli con una DO 600 de aproximadamente 1,0 en las islas utilizando una bomba de jeringa y permita que las bacterias se adhieran durante una hora a 32 grados Celsius. Después de la incubación.Perfusione una suspensión bacteriana diluida con una DO 600 de aproximadamente 0.05 y medio mínimo M nueve fresco a 0.25 mililitros por hora durante 12 horas. Mediante una bomba de jeringa, lave el biofilm con 0.5 mililitros de medio DMEM fresco, sin suero y sin antibióticos, a 0.5 mililitros por hora utilizando una bomba de jeringa para eliminar las bacterias débilmente adheridas y prepararlo para la imagen de la adhesión de células eucariotas. Utilice un microscopio confocal de barrido con láser Leica T-C-S-S-P cinco y visualice la arquitectura del biofilm empleando el software MS.Digiera los ojos con tripsina, retire las células HeLa de un frasco para cultivo de tejidos y resuspenda. Suspenda las células en medio DMEA hasta un volumen total de 0,1 mililitros con una densidad de siembra de cinco por 10 a la quinta células por mililitro. Introduzca las células HeLa en la región eucariota del dispositivo a una velocidad de flujo de dos mililitros por minuto utilizando una bomba de jeringa Pico Plus.A continuación, utilizando un microscopio óptico, asegúrese de que la válvula que separa la región bacteriana comensal de la región de células eucariotas esté completamente cerrada, de modo que la biopelícula bacteriana quede separada de la región de las células helo. Utilizando una pinza para tubo microcéntrifugo einor, cierre la salida celular para reducir el movimiento de la suspensión celular en el canal e incube durante seis horas a 37 grados Celsius en un incubador con 5 % de dióxido de carbono. Tras la incubación, perfunda el dispositivo utilizando una bomba de jeringa con 50 microlitros de medio de crecimiento DMEM a 0,5 mililitros por hora.Para eliminar las células no adheridas, renueve el medio DMEM para las regiones de hela y E. coli comensal cada seis horas. Prepare E. coli O157:H7, o EHEC, en medio M9 para infectar las células hela a una multiplicidad de infección o MOI de 100 a 200 células de EHEC por una célula hela. Lave las bacterias comensales débilmente adheridas según se describió en la sección anterior. Introduzca una suspensión diluida de EHEC de 100 microlitros con una DO600 de aproximadamente 0,1 en las islas mediante una bomba de jeringa a un flujo de 0,25 mililitros por hora.A continuación, incubar el dispositivo a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono durante seis horas sin flujo, para permitir que EHEC se exponga a las señales presentes en el biofilm comensal. Tras la incubación, abrir la válvula que separa las regiones de bacterias comensales y células eucariotas utilizando una bomba de vacío para crear vacío y mantener la válvula abierta durante seis horas. Esto expondrá las HEC en el biofilm bacteriano comensal a células HeLa. A continuación, incubar nuevamente durante seis horas a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono.Introduzca la tinción de células vivas y muertas en el dispositivo preparado según las instrucciones del fabricante. Para teñir la viabilidad de las células helo, inyecte 0,1 mililitros de solución sobrenadante en el área eucariota del dispositivo utilizando una jeringa de un mililitro como control para estimar la muerte de las células helo. En ausencia de EHEC, repita los tres pasos anteriores e introduzca medio DMEM estéril, sin suero y sin antibióticos en el dispositivo.En lugar de EHEC, observe múltiples ubicaciones en un microscopio de fluorescencia Zeiss AIOt 200 M y estime el número de células epiteliales vivas en verde entre las células epiteliales muertas en rojo contando el número de células verdes a partir de imágenes obtenidas en al menos siete ubicaciones. Ahora mostraremos algunas imágenes representativas del dispositivo microfluídico de capa de ensayo. En esta imagen, utilizamos un colorante alimentario inerte para representar las diferentes regiones de cultivo.El tinte morado representa la región de cultivo celular eucariota, mientras que el tinte verde representa el biofilm bacteriano comensal. En esta imagen, demostramos la viabilidad de mantener las regiones eucariota y bacteriana separadas entre sí, ya que el tinte morado en la región bacteriana es distinto del tinte amarillo circundante. Aquí se muestra la colonización del biofilm bacteriano comensal que expresa proteína verde por bacterias patógenas que expresan proteína roja.Como se muestra en esta imagen, las bacterias EHEC y las bacterias comensales son distintas de las células HeLa que rodean el biofilm bacteriano. Acabamos de mostrarle cómo ensamblar un dispositivo microfluídico en capa seca para el cultivo conjunto de bacterias y células epiteliales y estudiar habitualmente el efecto de las señales solubles en la colonización por patógenos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar eliminar cualquier burbuja en el dispositivo y usar el patógeno con una multiplicidad de infección celular adecuada.Así que eso es todo. Gracias por verlo y buena suerte con su experimento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Las bacterias producen compuestos secretados que tienen el potencial de afectar a la fisiología de sus vecinos microbianos. Aquí se describe una pantalla de co-cultivo que permite la detección de este tipo de interespecies mediadas químicamente interacciones mediante la mezcla de los microbios del suelo con cepas reportero transcripcional fluorescentes de Bacillus subtilis en medios sólidos.

Usando Coculture detectar químicamente mediadas por interacciones interespecíficas

Se describe un protocolo in vitro de co-cultivo microbioma intestinal y vellosidades intestinales durante un periodo prolongado utilizando un sistema de microphysiological gut-on-a-chip humano.

Co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos Villi en una Gut-on-a-Chip dispositivo de microfluidos

Presentamos un protocolo para investigar la diafonía entre Caco-2 irradiadas por rayos X y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El protocolo comienza con la irradiación de Caco-2 y puesta en marcha de la cultura junto con PBMC; Posteriormente, trans epitelial resistencia eléctrica se mide regularmente durante 48 h y occidental la mancha blanca /negra en Caco-2 y PBMC.

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Este informe describe un método microfluídico basado en chips para establecer un experimento de cultivo de una sola célula en el que se puede lograr un emparejamiento de alta eficiencia y un análisis microscópico de varias células individuales.

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Este estudio describe el monitoreo microscópico de la adherencia del neumococo a las cadenas del factor von Willebrand producidas en la superficie de células endoteliales primarias humanas diferenciadas bajo tensión de cizallamiento en condiciones de flujo definidas. Este protocolo se puede extender a la visualización detallada de estructuras celulares específicas y cuantificación de bacterias mediante la aplicación de procedimientos de inmunoinso diferencial.

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En la era de la inmunoterapia y el perfil genómico unicelular, la biología del cáncer requiere nuevas herramientas in vitro y computacionales para investigar la interfaz tumor-inmune en un contexto espaciotemporal adecuado. Describimos protocolos para explotar cocultivos microfluídicos inmunes al tumor en entornos 2D y 3D, compatibles con el monitoreo dinámico y multiparamétrico de las funciones celulares.

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