Name: El estudio de Piscinas vesícula sináptica con fotoconversión de tintes estirilo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprende el método de fotoconversión de tintes FM para estudiar piscinas de vesículas sinápticas en Drosophila melanogaster. Esta técnica permite visualizar la dinámica de vesículas mediante microscopía electrónica.

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1) Preparación de Drosophila melanogaster muscular unión neuronal (UNM) <ol><li> Prepare estándar Drosophila salina (130 mM NaCl, 36 mM de sacarosa, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM de MgCl 2, 5 mM Hepes, pH 7,3 4. </li><li> Diseccionar la preparación en solución salina (1,1). Las larvas de Drosophila se consumía dorsal de lado en un plato Sylgard; la cara dorsal es seccionado longitudinal, y los órganos internos son removidos. La preparación se estira y se consumía. Varios músculos ventrales pueden ser entonces utilizados. </li></ol> 2) La estimulación y la tinción de FM <ol><li> Es aconsejable hacer todos los pasos siguientes en condiciones de poca luz, con el fin de proteger a los colorantes FM de blanqueo. </li><li> Para la estimulación química de los nervios, el tampón de potasio se utiliza. Prepare Drosophila salina (ver 1.1), que contiene 90 mM de KCl y 10 mM de FM1-43 tinte. Mantener la solución de la luz. </li><li> Baño de la preparación con el buffer preparado previamente durante 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Lavar con solución salina normal Drosophila (1,1) para eliminar extracelular FM1-43 tinte. Proceder rápidamente a la fijación. </li></ol> 3) fijación <ol><li> Baño de la preparación con el 2,5% de glutaraldehído en tampón fosfato salino (PBS) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Para una buena conservación de las características morfológicas, el glutaraldehído es preferible a paraformaldehído. </li><li> Lavar una vez con PBS y luego dejar la preparación sumergidas durante 15 minutos en 100 mM de NH 4 Cl. Este paso se realiza con el fin de calmar los grupos aldehído libre de fijador de glutaraldehído restantes. </li><li> Lavar la solución de NH 4 Cl con normalidad PBS. </li></ol> 4) fotoconversión <ol><li> Incubar la preparación NMJ durante 30 minutos a 4 ° C en PBS que contiene 1,5 mg ml-1 de diaminobencidina (DAB). </li><li> Coloque la muestra bajo el microscopio de fluorescencia. Encontrar y enfocar la señal fluorescente con un agua relativamente bajo aumento del objetivo de inmersión (20x 0,5 NA). </li><li> Iluminar la muestra con la intensidad máxima de la lámpara hasta que el colorante FM es totalmente blanqueada (fig. 1C). Para controlar si fotoconversión ha ocurrido, es recomendable comprobar en la muestra objeto de transmisión de la luz antes y después de colorante blanqueo de la FM paso. Si fotoconversión se lleva a cabo, un precipitado de color pardo oscuro que se espera (fig. 1C). El tiempo de iluminación es variable, dependiendo de la fuerza de iluminación y también en la penetración de DAB en la preparación. Para la mayoría de las preparaciones, encontramos momentos de iluminación de ~ 30 a 45 minutos para ser óptimo cuando se utiliza un objetivo de 20x. Períodos más cortos de iluminación se utilizan para los objetivos de mayor aumento (60x). </li><li> Para la iluminación se prefiere usar una lámpara de mercurio, con una lámpara que contiene un espejo de nuevo, que recoge los rayos de luz difundida de vuelta, y por lo tanto aumenta la intensidad total. </li></ol> 5) Procesamiento de la muestra para la EM <ol><li> Osmication <ol class="lalpha"><li> Prepare una solución con un volumen de tetróxido de osmio en el volumen de árboles de agua (aprox. 300 l por ejemplo). Trabajo con tetróxido de osmio se debe hacer bajo el capó, el uso de guantes y equipo de protección aye. </li><li> Incubar la preparación en la solución de tetróxido de osmio durante 1 hora a temperatura ambiente (Bajo el capó). </li><li> Lavar exhaustivamente con PBS (4-5 veces 5 minutos) y la transferencia de cada muestra a un frasco de vidrio limpio. </li></ol></li><li> Deshidratación <ol class="lalpha"><li> Preparar las soluciones independientes que contienen 30, 50, 70 90, 95 y 100% de etanol. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 30% para cada muestra durante 5 minutos. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 50% para cada muestra durante 5 minutos. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 70% para cada muestra durante 5 minutos. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 90% para cada muestra durante 5 minutos. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 95% para cada muestra por 5 minutos (repita 3 veces). </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 100% a cada muestra por 5 minutos (repita 3 veces). </li></ol></li><li> Incorporación y posterior procesamiento <ol class="lalpha"><li> Mezclar 1 volumen de Epon resina con un volumen de etanol. Agregar a la preparación en rotación continua (2-4 horas). </li><li> Colocar la preparación en Epon 100% en los frascos abiertos, permiten que el etanol restante se evapore (4-6 horas). </li><li> Colocar la preparación en moldes a 60 ° C durante 36 horas. </li><li> Procesamiento electrónico de microscopía. Proceso de la preparación de las secciones 50 a 80 nm fina, utilizando procedimientos estándar ultramicrotomía. </li></ol></li><li> Imágenes de microscopía electrónica de <ol class="lalpha"><li> La preparación es fotografiado usando los procedimientos convencionales de EM. </li></ol></li></ol> 6) Los resultados representativos Los resultados esperados se resumen en las Figuras 1C y 2. El procedimiento da como resultado la iluminación en la formación de brown precipitar DAB, que será visible tanto en la fluorescencia y las imágenes de la transmisión. La primera aparición durante la iluminación es la desaparición de la fluorescencia asociada con la coloración tintes FM. La fluorescencia de fondo inducida por el fijador aldehído, por el contrario, será visible durante todo el experimento. El blanqueo se realiza normalmente en ~ 10-20 minutos después del comienzo de la iluminación. Por lo general no fotoconversión producto se puede observar en este punto del tiempo. La iluminación debe ser continua, y después de unos 10 minutos los preparativos se convertirá en una sombra marrón debido a la acumulación de DAB (Fig. 1C iv) No está claro por qué la precipitación de DAB y FM tinte de blanqueo no tienen lugar al mismo tiempo, es posible que una proporción relativamente grande cantidad de DAB oxidado necesita acumular antes de la agregación y la precipitación, y que por lo tanto, esta reacción es más lenta que el proceso de blanqueo. En esta etapa, sin embargo, la preparación no está listo para el procesamiento de la microscopía electrónica, como la precipitación de DAB es probable incompleta. Preferimos esperar 5-10 minutos más, durante el cual la preparación (terminal nerviosa presináptica) supone una de color marrón oscuro (o negro) de color, indicativo de una conversión completa. Una conversión ligera de la superficie general de la preparación (por ejemplo, de las fibras musculares en la unión neuromuscular) se puede observar en esta etapa. Es más probable en relación a la conversión de DAB inducida por autofluorescencia (y / o fluorescencia fijador), y no es perjudicial para el procedimiento. La preparación es procesada para microscopía electrónica, y debe ser inspeccionado para detectar la presencia de la oscuridad (etiquetado) de las vesículas. Como hemos demostrado antes de 5,6, estas vesículas son mucho más denso que los no etiquetados, y por lo tanto fáciles de distinguir (Figura 2B). Para aumentar la posibilidad de distinguir bien los diferentes tipos de vesículas, no por contraste, las manchas después de las secciones se deben realizar (sin acetato de uranilo o manchas citrato de plomo), la tinción de osmio es suficiente para observar los elementos más móviles, y no es tan oscuro como precipitar DAB. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: colorantes FM y lo utilizan para fotoconversión. (A) representan los pasos de un experimento clásico para la carga y distaining vesículas utilizando colorante FM en la estimulación. (I) incubar la muestra en FM tinte que contiene tampón. (Ii) Estimular (eléctrica o químicamente) para inducir la fusión de vesículas en presencia de FM tinte. (Iii) La endocitosis subsecuencia después de la estimulación a cargar algunos vesículas con tinte FM sigue presente en la memoria intermedia extracelular. (Iv) sustituir el tinte FM extracelular mediante el lavado con tampón. (V) Un nuevo estímulo induce vesículas cargadas de lanzar su tinte de FM en la exocitosis. (B) Esquema que muestra la cabeza, el puente y la cola del colorante FM1-43. (C) Ejemplo de un experimento fotoconversión en Drosophila NMJ. (I) Después de cargar la UNM con FM1-43, el lavado de las moléculas de colorante y la fijación externa, la fluorescencia de una terminación nerviosa se ​​pueden observar con un microscopio convencional de epifluorescencia (63x). (II-III) bajo iluminación continua el tinte es totalmente blanqueada. (Iv) Cuando la iluminación continua, de color negro aparece debido a la precipitación diaminobencidina. Barra de escala representa 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: EM ejemplos de las muestras photoconverted (A) La imagen muestra una terminación nerviosa que contiene las vesículas sinápticas, pero no de ellos son photoconverted, lo que podría ser causado por no tener suficiente iluminación o la penetración diaminobencidina pobres en el tejido.. (B) bouton Synaptic con varios oscura (lleno) vesículas que pasó por fotoconversión FM. (C) El exceso de los resultados de la iluminación en una terminal general oscuro, donde no hay vesículas o orgánulos son distinguibles. Las barras de escala representan a 200 nm.

<ol><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li>
<li>Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li>
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<li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optically+determined+size+of+exo%2Fendo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li>
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<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li>
<li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li>
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<li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li>
</ol>

A pocos pasos críticos deben ser tomados en cuenta: <ul><li> La incubación DAB debe realizarse sólo después de un lavado profundo y enfriamiento de los preparativos. De lo contrario el glutaraldehído no reaccionado va a interactuar con DAB y provocar su precipitación (por lo general en forma de cristales planos, que no son densos a los electrones). Preparados en los casos esta precipitación se lleva a cabo en abundancia rara vez son útiles para microscopía electrónica. </li><li> Veces la iluminación debe ser optimiz...

<table><tbody><tr><td>FM 1-43</td><td>Invitrogen</td><td>F10317</td><td></td></tr><tr><td>Resina Epon</td><td>Plano GmbH</td><td>R1030</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de di-aminobencidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído al 50%</td><td>AppliChem</td><td>A3166</td><td>Grado EM</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>104186298</td><td></td></tr><tr><td>Axioskop 2 FS plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetivo 20x 0,5 NA</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Objetivo seco</td></tr><tr><td>Lámpara de Hg de 100 W</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carcasa de lámpara con espejo trasero</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>1007-980</td><td></td></tr><tr><td>Cámara MRm</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>0445-554</td><td>Adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Filtro de excitación (HQ 470/40)</td><td>AHF</td><td>F49-671</td><td></td></tr><tr><td>Dicroico (495 DCLP)</td><td>AHF</td><td>F33-100</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión (HQ 500 LP)</td><td>AHF</td><td>F42-018</td><td></td></tr><tr><td>ME</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proscan CCD HSS</td><td>Proscan Electronic Sys.</td><td></td><td>1024 x 1024</td></tr></tbody></table>

el estudio de piscinas vesícula sináptica con fotoconversión de tintes estirilo

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

La fusión de las vesículas sinápticas con la membrana plasmática (exocitosis) es un paso necesario en la liberación de neurotransmisores y la comunicación neuronal. Las vesículas se recuperan de la membrana plasmática (endocitosis) y se agruparon junto con el grupo general de vesículas dentro de la terminal nerviosa, hasta que se someten a un nuevo exo-y el ciclo de endocitosis (reciclaje de vesículas). Estos procesos han sido estudiados usando una variedad de técnicas como la microscopía electrónica, las grabaciones de electrofisiología, amperometría y medidas de capacitancia. Es importante destacar que, durante las últimas dos décadas una serie de marcadores marcados con fluorescencia surgido, lo que las técnicas ópticas para rastrear las vesículas en la dinámica de su reciclaje. Uno de los marcadores más comúnmente utilizado es el estirilo o FM tinte 1; estructuralmente, todos los tintes FM contiene una cabeza hidrofílica y una cola lipofílica conectados a través de un anillo aromático y uno o más dobles enlaces (Fig. 1B). Un experimento clásico tinte FM para etiquetar un grupo de vesículas consiste en bañar la preparación (Fig. 1AI) con el colorante durante la estimulación del nervio (eléctrica o con alto contenido de K +). Esto induce reciclaje de vesículas y la posterior carga del medio de contraste en las vesículas recientemente endocitosis (Fig. 1A I-III). Después de cargar las vesículas con el tinte, una segunda ronda de estímulo en un baño de tinte sin que desencadenan la liberación de FM a través de exocitosis (Fig. 1A IV-V), proceso que puede ser seguido por el control de la disminución de la intensidad de fluorescencia (decoloración). A pesar de los tintes FM han contribuido en gran medida en el campo de reciclaje de vesículas, que no es posible determinar la localización exacta o la morfología de las vesículas individuales mediante microscopía de fluorescencia convencional. Por esa razón, se explica aquí cómo colorantes FM también se puede utilizar como marcadores endocítica mediante microscopía electrónica, a través de fotoconversión. La técnica fotoconversión explota la propiedad de los tintes fluorescentes para generar especies reactivas de oxígeno en condiciones de iluminación intensa. Preparativos marcados con fluorescencia se sumergen en una solución que contiene diaminobencidina (DAB) y se ilumina. Las especies reactivas generadas por las moléculas de colorante oxidar el DAB, que forma un precipitado estable, insoluble que tiene un aspecto oscuro y se pueden distinguir fácilmente en el microscopio electrónico de 2,3. Como DAB sólo es oxidado en las inmediaciones de las moléculas fluorescentes (como las especies reactivas de oxígeno son de corta duración), la técnica se asegura de que las estructuras sólo la etiqueta fluorescente va a contener la precipitación de electrones de alta densidad. La técnica permite así que el estudio de la ubicación exacta y la morfología de la forma activa de reciclaje orgánulos.

Colorantes FM han sido de inestimable ayuda en la comprensión de la dinámica sináptica. FM son normalmente seguidos bajo el microscopio de fluorescencia en condiciones de estimulación diferente. Sin embargo, fotoconversión de tintes FM combinada con el microscopio electrónico permite la visualización de los distintos grupos de vesículas sinápticas, entre los componentes de la ultraestructura otra parte, en botones sinápticos.

El estudio de Piscinas vesícula sináptica con fotoconversión de tintes estirilo

La fusión de las vesículas sinápticas con la membrana plasmática (exocitosis) es un paso necesario para la liberación de neurotransmisores y la comunicación neuronal. La ...

Este video demuestra el procedimiento para la conversión fotográfica del colorante Styro Dye FM 1-43. Para estudiar los grupos de vesículas sinápticas en drosophila melanogaster, primero se diseccionan larvas de drosophila para exponer los músculos ventrales que constituyen la preparación de la unión neuromuscular o NMJ. Las preparaciones se incuban en un tampón que contiene FM D, mostrado aquí en gris, que marca la membrana celular.Luego se estimulan eléctrica o químicamente para inducir la fusión física, con la membrana de la vesícula internalizada a continuación. La exocitosis estimulada se tiñirá con FM D. El colorante extracelular FM se lava luego, eliminándolo de la membrana plasmática, y el tejido se fija bajo iluminación continua de alta intensidad. El colorante se decolora completamente y aparece el color negro debido a la precipitación de di amino Ben.Este precipitado puede luego visualizarse mediante microscopía electrónica de transmisión. Hola, soy Philippe o Paso del laboratorio de Sylvia Olli en el Instituto Europeo de Neurociencias en Gaon, Alemania. Hoy les mostraremos un procedimiento para la conversión fotoquímica con FM en la unión neuromuscular.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la reciclaje de vesículas sinápticas. Bien, comencemos trabajando bajo un microscopio estereoscópico. Comience fijando una larva de Drosophila con el lado dorsal hacia arriba en un plato recubierto con Sylgard.Cúbralo con solución salina para drosófila utilizando una aguja de jeringa y, con tijeras de disección, corte longitudinalmente el lado dorsal. Luego, retire los órganos internos. A continuación, estire la preparación y vuélvala a fijar en el platillo de Sylgard.Varios músculos ventrales pueden utilizarse entonces para proteger los colorantes FM utilizados en este procedimiento contra el blanqueo. Este procedimiento debe realizarse en condiciones de poca luz. Cubra la preparación de drosófila fijada con solución salina de drosófila que contenga 90 milimolares de cloruro de potasio y 10 micromolares de FM.1 43 para estimular químicamente los nervios.Incubar durante un minuto a temperatura ambiente tras la estimulación. Retire la solución estimulante y sumerja el platillo con la drosófila fijada. Prepare en un vaso de precipitados lleno con 100 mililitros de solución salina para drosófila dos veces para eliminar el colorante FM 1-43 extracelular trabajando bajo una campana de seguridad química.Fije la preparación de la unión neuromuscular en glutaraldehído al 2,5 % en solución salina tamponada con fosfato o PBS durante 45 minutos a temperatura ambiente. Lave la preparación una vez con PBS, luego retírela del recipiente tipo puro y sumérjala en cloruro de amonio 100 milimolar durante 15 minutos. Para neutralizar los grupos aldehído libres del fijador de glutaraldehído residual.Utilizando PBS normal, lave la solución de cloruro de amonio, coloque la preparación de la unión neuromuscular en un nuevo recipiente tipo cigarro y sumérjala en DAB (diaminobencidina) filtrado al 1,5 miligramo por mililitro en PBS e incube durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Coloque la muestra bajo un microscopio fluorescente equipado con una fuente de luz de lámpara de mercurio con carcasa que contiene un espejo trasero, utilizando un objetivo seco de magnificación relativamente baja.Localice la muestra. Luego, utilizando un cubo de filtros estándar con excitación azul y fluorescencia verde, enfoque la señal fluorescente. Las uniones neuromusculares aparecen como puntos brillantes sobre los músculos.A continuación, utilizando el mismo conjunto de filtros de fluorescencia, ilumine la muestra con intensidad máxima hasta que el FM D esté completamente decolorado. Usando un objetivo de 20 x, deberían ser suficientes entre 30 y 45 minutos. Sin embargo, el tiempo de fotoconversión varía según la intensidad de la iluminación, la profundidad de penetración del DAB en la preparación y el objetivo utilizado.Tras la iluminación, examine la muestra bajo luz de transmisión. Si ha tenido lugar la fotoconversión, debería observarse un precipitado marrón oscuro. Regrese al microscopio de disección y luego use tijeras para cortar el punto fotoconvertido de la larva.Regrese al microscopio de disección. Luego, use tijeras para cortar el punto fotocambiado de la larva. Ahora coloque la muestra en un tubo microcentrífugo que contenga PBS, trabajando bajo una campana de seguridad química y utilizando el equipo de seguridad adecuado, incluyendo guantes y protección ocular.Prepare 300 microlitros de tetróxido de osmio al 1% por muestra. Coloque ahora la muestra en un frasco de vidrio con tapa de plástico y agregue la solución de tetróxido de osmio preparada para postfijar la preparación. Mientras la muestra se incuba, prepare soluciones separadas que contengan etanol al 30, 50, 70, 90, 95 y 100%.Lave la muestra cuatro a cinco veces con PBS durante cinco minutos cada vez. Después de cada lavado, use una punta de plástico en su pipeta para transferir la muestra a un nuevo frasco. Después del último lavado, transfiera la muestra a un frasco de vidrio limpio.A continuación, deshidrate la muestra colocándola en una serie de soluciones de etanol. Comience incubando en un mililitro de etanol al 30 %. Luego, después de cinco minutos, retire el etanol utilizando una pipeta Pasteur y reemplácelo con un mililitro de etanol al 50 %.Continúe con la deshidratación, incubando la preparación de la unión neuromuscular en las soluciones al 70, 90 y luego al 95%. A continuación, la muestra se incubará en solución de etanol al 95% más veces que en etanol al 100%, durante tres veces tras la deshidratación. Añada dos mililitros de resina EIN uno a uno al etanol y coloque la muestra en un rotador para incubar.De dos a cuatro horas a temperatura ambiente tras la rotación al 100 %ein e introduzca la muestra en un matraz abierto para permitir que el etanol restante se evapore durante cuatro a seis horas. Vierta EIN fresco en un molde. Añada las preparaciones e incube a 60 grados Celsius durante 36 horas.Cuando las preparaciones incluidas con EIN estén listas, utilice un ultramicrotomo para preparar cortes finos de 50 a 80 nanómetros de grosor I con una cuchilla de diamante. Las muestras se cortan en secciones delgadas. Las secciones flotan sobre el baño de agua de la cuchilla y posteriormente pueden recogerse sobre rejillas normales de microscopía electrónica.Las preparaciones ya están listas para ser observadas mediante procedimientos convencionales de microscopía electrónica. Las uniones neuromusculares aisladas de Drosophila melanogaster fueron estimuladas usando potasio alto y las membranas internas fueron marcadas con FM 1-43, como se muestra aquí.La fluorescencia de un terminal nervioso se puede observar utilizando un microscopio convencional de epifluorescencia. Bajo iluminación continua, el colorante se decolora completamente y, cuando la iluminación continúa, aparece un color negro debido a la precipitación de dinobencina. Este terminal nervioso contiene vesículas sinápticas, pero ninguna de ellas se ha fotocambiado.Esto podría deberse a una iluminación insuficiente o a una mala penetración del DIA amino bencina en el tejido. Por el contrario, una iluminación excesiva da como resultado un terminal generalmente oscuro en el que no se pueden distinguir vesículas u orgánulos; con la cantidad adecuada de iluminación, se puede observar la fotoconversión. Esta micrografía muestra un botón sináptico en el que se observa un grupo de vesículas oscuras, lo que indica la fotoconversión de FM.Acabamos de mostrarle cómo fotoconvertir vesículas sinápticas marcadas con fem die. Al realizar este procedimiento, es importante recordar siempre calibrar cuidadosamente los tiempos de iluminación para el paso de conversión. Eso es todo.Gracias por ver el video. Buena suerte con sus experimentos.

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Aquí mostramos cómo cuantificar el número y la distribución espacial de las zonas activas sinápticas en los fotorreceptores de Drosophila melanogaster, resaltada con un marcador molecular codificada genéticamente, y su modulación después de la exposición prolongada a la luz.

Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

Vesícula sináptica (SV) ciclismo es el mecanismo principal de comunicación intercelular en las sinapsis neuronales. Liberación y absorción del tinte de FM son los medios primarios de análisis cuantitativo de la SV endo - y exocitosis. Aquí, comparamos todos los métodos de estimulación para conducir bicicleta en la sinapsis de Drosophila Unión neuromuscular (NMJ) modelo FM1-43.

Tinte de FM ciclismo en la sinapsis: comparación de potasio alto despolarización, eléctrico y Channelrhodopsin estimulación

Describimos un análisis óptico para la vesícula sináptica (SV) reciclado en neuronas cultivadas. Combinar este protocolo con doble transfección para expresar un marcador presináptico y la proteína de interés nos permite localizar sitios presinápticos, su vesícula sináptica capacidad de reciclaje y determinar el papel de la proteína de interés.

Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

Aprende el método de fotoconversión de tintes FM para estudiar piscinas de vesículas sinápticas en Drosophila melanogaster. Esta técnica permite visualizar la dinámica de vesículas mediante microscopía electrónica.

El estudio de Piscinas vesícula sináptica con fotoconversión de tintes estirilo

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