El estudio de Piscinas vesícula sináptica con fotoconversión de tintes estirilo

Este video demuestra el procedimiento para la conversión fotográfica del colorante Styro Dye FM 1-43. Para estudiar los grupos de vesículas sinápticas en drosophila melanogaster, primero se diseccionan larvas de drosophila para exponer los músculos ventrales que constituyen la preparación de la unión neuromuscular o NMJ. Las preparaciones se incuban en un tampón que contiene FM D, mostrado aquí en gris, que marca la membrana celular.

Luego se estimulan eléctrica o químicamente para inducir la fusión física, con la membrana de la vesícula interna siguiendo a continuación. La exocitosis estimulada se tiñirá con FM D. El colorante extracelular FM se lava luego, eliminándolo de la membrana plasmática, y el tejido se fija bajo iluminación continua de alta intensidad. El colorante se decolora completamente y aparece el color negro debido a la precipitación de di amino Ben.

Este precipitado puede luego visualizarse mediante microscopía electrónica de transmisión. Hola, soy Philippe o Paso del laboratorio de Sylvia Olli en el Instituto Europeo de Neurociencias en Gaon, Alemania. Hoy les mostraremos un procedimiento para la conversión fotoquímica de FM en la unión neuromuscular.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la reciclaje de vesículas sinápticas. Bien, comencemos trabajando bajo un microscopio estereoscópico. Comience fijando una larva de Drosophila con el lado dorsal hacia arriba en un recipiente recubierto con sonda.

Cúbralo con solución salina de drosófila utilizando una aguja de jeringa y, con tijeras de disección, corte longitudinalmente el lado dorsal. Luego, retire los órganos internos. A continuación, estire la preparación y vuélvala a fijar en el platillo de Sylgard.

Varios músculos ventrales pueden utilizarse entonces para proteger los colorantes FM utilizados en este procedimiento del blanqueo. Este procedimiento debe realizarse en condiciones de poca luz. Cubra la preparación de *Drosophila* fijada con solución salina de *Drosophila* que contenga 90 milimolares de cloruro de potasio y 10 micromolares de FM 1-43 para estimular químicamente los nervios.

Incubar durante un minuto a temperatura ambiente tras la estimulación. Retirar la solución estimulante y sumergir el platillo con la *Drosophila* fijada. Realizar la preparación en un vaso de precipitados con 100 mililitros de solución salina para *Drosophila* dos veces para eliminar el colorante FM 1-43 extracelular, trabajando bajo una campana de seguridad química.

Fije la preparación de la unión neuromuscular en glutaraldehído al 2,5 % en solución salina tamponada con fosfato o PBS durante 45 minutos a temperatura ambiente. Lave la preparación una vez con PBS, luego retírela del recipiente tipo puro y sumérjala en cloruro de amonio 100 milimolar durante 15 minutos. Para neutralizar los grupos aldehído libres del fijador de glutaraldehído residual.

Utilizando PBS normal, lave la solución de cloruro de amonio, coloque la preparación de la unión neuromuscular en un nuevo recipiente tipo piretro y sumérjala en DAB (diaminobencidina) filtrado al 1,5 miligramo por mililitro en PBS e incube durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Coloque la muestra bajo un microscopio fluorescente equipado con una fuente de luz de lámpara de mercurio, cuya carcasa contenga un espejo trasero, utilizando un objetivo seco de aumento relativamente bajo.

Localice la muestra. Luego, utilizando un cubo de filtros estándar con excitación azul y fluorescencia verde, enfoque la señal fluorescente. Las uniones neuromusculares aparecen como puntos brillantes sobre los músculos.

A continuación, utilizando el mismo conjunto de filtros de fluorescencia, ilumine la muestra a intensidad máxima hasta que el FM D se haya decolorado por completo. Usando un objetivo de 20 x, deberían ser suficientes entre 30 y 45 minutos. Sin embargo, el tiempo de fotoconversión varía según la intensidad de la iluminación, la profundidad de penetración del DAB en la preparación y el objetivo utilizado.

Tras la iluminación, examine la muestra bajo luz de transmisión. Si ha tenido lugar la fotoconversión, debería observarse un precipitado marrón oscuro. Regrese al microscopio de disección y luego use tijeras para cortar el punto fotoconvertido de la larva.

Regrese al microscopio de disección. Luego use tijeras para cortar el punto fotocambiado de la larva. Ahora coloque la muestra en un tubo microcentrífugo que contenga PBS, trabajando bajo una campana de seguridad química y utilizando equipo de seguridad adecuado, incluyendo guantes y protección ocular.

Prepare 300 microlitros de tetróxido de osmio al 1% por muestra. Coloque ahora la muestra en un frasco de vidrio con tapa de plástico y añada la solución de tetróxido de osmio preparada para postfijar la preparación. Mientras la muestra se incuba, prepare soluciones separadas que contengan etanol al 30, 50, 70, 90, 95 y 100%.

Lave la muestra de cuatro a cinco veces con PBS durante cinco minutos cada vez. Después de cada lavado, use un PE plástico en su pipeta para transferir la muestra a un nuevo matraz. Después del último lavado, transfiera la muestra a un matraz de vidrio limpio.

A continuación, deshidrate la muestra colocándola en una serie de soluciones de etanol. Comience incubando en un mililitro de etanol al 30%. Luego, después de cinco minutos, retire el etanol utilizando una pipeta Pasteur y sustitúyalo por un mililitro de etanol al 50%.

Continúe con la deshidratación, incubando la preparación de la unión neuromuscular en las soluciones al 70, 90 y luego al 95%. A continuación, la muestra se incubará en solución de etanol al 95% más veces que en etanol al 100%, durante tres veces tras la deshidratación. Añada dos mililitros de resina EIN uno a uno al etanol y coloque la muestra en un rotador para incubar.

De dos a cuatro horas a temperatura ambiente tras la rotación al 100 %ein y coloque la muestra en un matraz abierto para permitir que el etanol restante evapore durante cuatro a seis horas. Vierta EIN fresco en un molde. Añada los preparados e incube a 60 grados Celsius durante 36 horas.

Cuando las preparaciones con EIN integradas estén listas, utilice un ultramicrotomo para preparar cortes finos de 50 a 80 nanómetros de grosor I con una cuchilla de diamante. Las muestras se cortan en secciones delgadas. Las secciones flotan sobre el baño de agua de la cuchilla y posteriormente pueden recogerse en rejillas normales de microscopía electrónica.

Las preparaciones ya están listas para ser observadas mediante procedimientos convencionales de microscopía electrónica. Las uniones neuromusculares aisladas de Drosophila melanogaster fueron estimuladas usando potasio alto y las membranas internas fueron marcadas con FM 1-43, como se muestra aquí.

La fluorescencia de un terminal nervioso se puede observar utilizando un microscopio convencional de epifluorescencia. Bajo iluminación continua, el colorante se decolora completamente y, cuando la iluminación continúa, aparece un color negro debido a la precipitación de dino bencina. Este terminal nervioso contiene vesículas sinápticas, pero ninguna de ellas se ha fotocambiado.

Esto podría deberse a una iluminación insuficiente o a una mala penetración del DIA amino bencina en el tejido. Por el contrario, una iluminación excesiva da como resultado un terminal generalmente oscuro en el que no se pueden distinguir vesículas u orgánulos; con la cantidad adecuada de iluminación, se puede observar la fotoconversión. Esta micrografía muestra un botón sináptico en el que se observa un grupo de vesículas oscuras, lo que indica la fotoconversión de FM.

Acabamos de mostrarle cómo fotoconvertir vesículas sinápticas marcadas con fem die. Al realizar este procedimiento, es importante recordar siempre calibrar cuidadosamente los tiempos de iluminación para el paso de conversión. Eso es todo.

Gracias por ver el video. Buena suerte con sus experimentos.