Electrodo de fabricación e implantación de Aplysia californica Para grabaciones multi-canal neural y muscular en los animales intactos, libremente Comportarse

Para hacer el conjunto de electrodos para grabaciones in vivo multicanal, se crean cuatro electrodos diferenciales y se hilan juntos con los electrodos diferenciales individuales que se ramifican. En los extremos, se sujeta al animal anestesiado y se hace una incisión a un lado de la mancha ocular. Se localizan los nervios y músculos objetivo y los electrodos se unen a la gota de superpegamento en la base del gancho y luego se aíslan con un sellador de sellado rápido.

Hola, soy Miranda Collins del laboratorio del Dr. Halal Thiel del departamento de biología de la Universidad Kiss Western Reserve. Hoy les mostraré un procedimiento para ensamblar e implantar electrodos para grabaciones in vivo en SIA, California. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el control neuromuscular de la alimentación y la sia.

Empecemos. Para crear el electrodo, use unas tijeras para cortar un trozo de alambre de acero inoxidable recubierto de esmalte de 0.001 pulgadas de diámetro de aproximadamente dos pies de largo. Coloca una pequeña bola de masilla en cada extremo del alambre.

Dobla el alambre por la mitad y gira los extremos para crear un par trenzado llamado electrodo diferencial. Pega con cinta adhesiva ambos extremos del cable para evitar que se desenrede. Haga cuatro electrodos diferenciales usando un color diferente de cinta adhesiva para cada electrodo diferencial.

Para fines de identificación, tuerza dos de los electrodos diferenciales juntos, dejando dos pulgadas sin enroscar en un extremo y una pulgada en el otro extremo. Repita con el par restante de jodos diferenciales. Retuerza ambos juegos de dos electrodos diferenciales juntos, asegurándose de que los extremos permanezcan sin retorcer.

Sostenga el conjunto de electrodos y aplique pegamento de silicona doméstico en la unión de los cuatro electrodos diferenciales, dejando los extremos libres. Cuelga y deja que el pegamento se seque durante al menos cuatro horas. Para aislar las ramas, coloque el conjunto de electrodos sobre una superficie móvil plana, como un trozo de madera.

Use un pequeño trozo de plástico para elevar el conjunto de electrodos justo antes de que se ramifique y asegúrelo con cinta adhesiva. Abre los extremos y asegúralos con cinta adhesiva. En el microscopio de disección, use pinzas para cubrir las ramas con pegamento de silicona.

Los extremos de una pulgada de largo estarán dentro del animal, por lo que deben tener una capa muy delgada de pegamento. Deja que el pegamento se seque durante al menos tres horas. Acorte el extremo de una pulgada de largo de un electrodo diferencial a dos centímetros en cada extremo del electrodo.

Use pinzas para raspar la silicona y el esmalte de ambos alambres. Para revelar un centímetro de alambre desnudo, enrolle un alambre desnudo en un gancho para grabar. Luego, el otro cable hacia arriba y lejos del gancho para que sirva como cable de tierra en el extremo de dos pulgadas de largo, suelde un pin de conector dorado a cada cable.

Use un trozo de cinta adhesiva para asegurar el extremo y mantener el espacio entre el suelo y las clavijas de grabación. Repita estos pasos para que haya ganchos y conectores dorados en los cuatro electrodos diferenciales. Coloque una bola de uno a dos centímetros de pegamento de silicona en el cable a aproximadamente 1,5 pulgadas del extremo del gancho.

Para anclar los electrodos dentro del animal que se deja secar durante al menos una hora, seleccione un animal sano que pese entre 350 y 450 gramos en respuesta a pequeños trozos de algas. El animal debe generar mordeduras a intervalos de entre tres y cinco segundos. La cirugía completa con implante de electrodos debe durar aproximadamente una hora.

Coloque al animal anestesiado en una bandeja de disección con la pata hacia abajo mirando al animal de frente. Mueva el área de las branquias hacia la izquierda de modo que el animal quede parcialmente de lado, inclinado hacia afuera, inmovilizado hacia abajo con los tentáculos anteriores. Coloque la bandeja en la platina de un microscopio de disección.

Levante la bandeja en un ángulo de aproximadamente 20 grados para elevar la cabeza y recoja la hemolinfa en la cola lejos de la incisión con tijeras de disección, comience una incisión ligeramente a la derecha del punto del ojo y extiéndala de uno a 1,5 centímetros hacia la cabeza. Usa tus tractores. Colóquelo en los bordes de la bandeja para mantener la incisión abierta.

Para exponer la masa bucal. Use pinzas para levantar la membrana transparente debajo de la piel y use tijeras para cortar una abertura, que coincida con la incisión principal. Mete los bordes de la membrana en los retractores.

Coloque el conjunto de electrodos en un micromanipulador y muévalo sobre la incisión del animal. Cada uno de los cuatro electrodos tardará entre 10 y 15 minutos en conectarse, primero se mostrará el acceso a los nervios, seguido de la conexión del electrodo al nervio final. Sin embargo, en la práctica, cada nervio debe conectarse a un electrodo antes de que se exponga el siguiente nervio.

El nervio ular es el más difícil de acceder y debe abordarse primero. Hay dos opciones para acceder al nervio ular. La primera opción, que es preferible, es mirar debajo del ganglio bucal entre BN uno y VN dos.

Si una rama del nervio ular es visible, use pinzas de punta fina dobladas en un gancho para levantar la rama. Si una rama del nervio ular no es accesible por encima del músculo, una segunda opción es acceder a ella a través de una pequeña incisión en I dos junto al tejido conectivo en la base del ganglio bucal. La incisión en I dos debe pasar a través de dos capas del músculo I dos para unir un electrodo a I dos.

Use las pinzas en forma de gancho para levantar y separar dos bandas del nervio bucal de acceso a dos músculos I aquí. El nervio bucal tres está aquí y se utilizará para demostrar la fijación del electrodo. Todos los electrodos están unidos de la misma manera que se ha demostrado ahora en el nervio bucal tres.

Una vez que el nervio esté enganchado en las pinzas, use otro juego de pinzas para manipular un gancho de electrodo en el nervio usando el micromanipulador. Levante el gancho de modo que el nervio se levante y se aleje de la masa bucal. Libre de cualquier otro nervio o tejido levantado lo menos posible, medio centímetro o menos.

Para evitar estirar demasiado el nervio, use una toallita kim para secar el electrodo y el área adyacente del nervio. Se usa un alfiler de insecto para aplicar el pegamento, asegure el electrodo con un poco de superpegamento donde la base del gancho esté en contacto con la parte inferior del nervio. Aplique una gota de solución salina alysia o hemo linfa para fijar el superpegamento.

Luego, seque el gancho en rojo en una mezcla de bolsa de hielo. Pegamento de sellado rápido. Esto hace que el pegamento funcione durante unos 30 minutos.

Es posible que sea necesario realizar mezclas adicionales en el transcurso de la cirugía. Use el alfiler para insectos para cubrir completamente cualquier cable expuesto del anzuelo con una pequeña cantidad de sellado rápido. Evitar el cable de tierra.

Deja que el pegamento se asiente durante cinco minutos. Reajustar el pegamento. Si se separa del gancho, espera hasta que el pegamento esté seco antes de acceder al siguiente nervio.

Una vez que todos los electrodos estén conectados, deslice el conjunto de electrodos en el animal hasta el anclaje de silicona. Suturar la incisión alrededor del cable del electrodo que sobresale. Manteniendo el ancla dentro del animal, superpega los puntos para asegurar un buen sellado.

Inserte las puntas doradas del conector en el otro extremo del electrodo en un pequeño bloque de espuma de poliestireno. Regrese el animal al tanque principal en un recipiente de aislamiento aireado para que se recupere durante la noche. Aclimatar al animal en un recipiente aireado mientras esté conectado al equipo de grabación durante al menos 1,5 horas.

Monitoree la señal mientras el animal se está aclimatando para verificar que todos los electrodos estén funcionando y que los niveles de ruido sean bajos. Use una cámara de video para registrar el comportamiento de alimentación mientras usa la computadora para registrar las señales de los electrodos neuronales y musculares. Sincronice las grabaciones de video y electrodos utilizando una señal de onda cuadrada que controla un contador digital en la vista de la cámara mientras se graba simultáneamente como un canal adicional en la computadora.

En aScope, cuando el animal se está alimentando, habrá ráfagas de actividad en los nervios y los músculos. Este es un ejemplo de un patrón de deglución con actividad EMG de I dos y ENG de RN, BN dos y BN tres. Acabamos de mostrarle cómo fabricar e implantar electrodos multicanal para registrar la actividad neuronal y muscular durante el comportamiento de alimentación en sia que se comporta libremente.

Al realizar este procedimiento, asegúrese de manipular el nervio con cuidado y asegúrese de sellar completamente los ganchos de grabación de manera que no quede expuesto ninguno de los cables. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.