Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

Hola, mi nombre es Jay Harkins. Soy científico investigador en Protein Discovery. Hoy demostraré lo fácil que es usar el nuevo sistema de fraccionamiento 8, 100 sin gel para lograr un fraccionamiento basado en el peso molecular de alta recuperación.

Con gel free, puede cargar hasta un miligramo de proteína total por canal y fraccionar de forma reproducible hasta ocho muestras en unos 90 minutos. Por lo tanto, el sistema incluye un instrumento, un cartucho desechable y todos los tampones que necesita para realizar el experimento. Así que comencemos.

Comience este procedimiento configurando y etiquetando hasta ocho tubos de 500 microlitros en cada tubo. Agregue hasta un miligramo de la muestra de proteína en un volumen de hasta 112 microlitros. La cantidad de proteína en la muestra depende de la complejidad de la muestra.

Para muestras más complejas, como el homogeneizado de tejido utilizado para esta demostración, de 150 a 200 microgramos por canal generará los mejores resultados. A continuación, agregue 30 microlitros de cinco tampones de muestra, que se proporcionan en el kit de cartucho sin gel. A cada muestra de proteína, agregue ocho microlitros de un DTT molar.

A continuación, ajuste cada muestra con agua hasta un volumen final de 150 microlitros. A continuación, calentar los viales durante cinco minutos a 95 grados centígrados para desnaturalizar la muestra. Deje que las muestras calentadas se enfríen a temperatura ambiente mientras la muestra se enfría.

Retire el cartucho gel free 8, 100 de la bolsa de aluminio. Retire y deseche el sellador de placas. Retire el búfer de almacenamiento de los compartimentos del cartucho con una pipeta.

Si se van a utilizar las ocho cámaras del cartucho, invierta el cartucho para drenar el búfer de almacenamiento de los compartimentos. A continuación, se añaden ocho mililitros de tampón de funcionamiento sin gel a cada uno de los depósitos de tampón del ánodo. Se añaden seis mililitros a cada uno de los depósitos de tampón del cátodo y se pipetean 100 microlitros en cada una de las cámaras de recolección.

Con un pipeteador de ocho canales de 100 a 200 microlitros, retire y deseche cualquier tampón que fluyera desde el depósito de tampón del cátodo a la cámara de carga de muestras e inmediatamente cargue las muestras en las cámaras de carga. Una vez cargadas las muestras, coloque el cartucho en la estación de fraccionamiento sin gel 8, 100. A continuación, baje las guías de electrodos y cierre la tapa utilizando la interfaz gráfica de usuario fácil de programar en la pantalla táctil de los instrumentos, vaya a la lista de métodos preprogramados disponibles.

Seleccione el método apropiado pulsando el botón de método. Presione el botón de recuperación e ingrese el número del método preprogramado deseado Usando el teclado en pantalla, presione OK. A continuación, pulse el botón Aplicar.

El método que se ha aplicado aparecerá en la parte inferior de la pantalla principal. Cada uno de los métodos preprogramados consta de voltajes establecidos y pausas basadas en el tiempo diseñadas para resolver proteínas dentro de un rango específico de pesos moleculares. Una vez que se haya seleccionado el método apropiado, presione el botón de canal en la pantalla principal.

A continuación, seleccione los canales que se utilizarán en la ejecución. Para seleccionar los ocho canales, presione seleccionar todo. A continuación, pulse Listo.

Para volver a la pantalla principal, asegúrese de que la tapa de seguridad esté cerrada y que la luz indicadora esté verde en la parte inferior de la pantalla. Ahora presione iniciar para comenzar el experimento mientras el sistema está funcionando, los círculos que se muestran en el cuadro en el lado izquierdo de la pantalla representan el estado de cada canal. Un círculo verde indica que el canal está activo.

Los voltajes y corrientes aplicados se muestran a la derecha de los círculos de estado del canal. El gel free 8, 100 se detendrá automáticamente para la recolección de fracciones en el intervalo especificado en el método. Cuando el instrumento está en pausa para recolectar fracciones, aparecerá un cuadro de texto que le notificará que se ha producido una pausa y los círculos de estado se volverán amarillos.

Dentro del cartucho, se aplica un voltaje constante entre los depósitos del ánodo y el cátodo. Bajo este potencial, la mezcla de proteínas es impulsada electroforéticamente desde la cámara de carga hacia el molde de precisión especialmente diseñado. Las proteínas del gel primero se apilan dentro de una banda afilada en el gel de apilamiento y luego se resuelven en función de sus respectivos pesos moleculares en el gel de resolución.

A medida que las proteínas eluyen del gel, quedan atrapadas y se concentran en la fase líquida. En la cámara de recolección sin gel. A continuación, el instrumento se detiene.

En función de intervalos de tiempo preseleccionados, se recogen fracciones y con una pipeta. A continuación, se vuelve a aplicar el potencial para aludir a la segunda fracción de peso molecular de interés. Este proceso se repite hasta que se hayan recogido todas las fracciones deseadas.

Cada cartucho contiene ocho canales electroforéticos independientes para que el usuario pueda ejecutar tantos canales como necesite y guardar los canales no utilizados para su uso posterior. Para eliminar las fracciones, abra la tapa del instrumento y, a continuación, utilice la pipeta de canal innato. Transfiera los 150 microlitros de líquido en cada una de las cámaras de recolección a tubos de recolección o a una placa de pocillos múltiples.

Una vez eliminadas las fracciones, lavar dos veces la cámara de recogida con un tampón de funcionamiento sin gel añadiendo 100 microlitros por canal y pipeteando dos veces hacia arriba y hacia abajo. Después del lavado, agregue 100 microlitros de tampón de marcha sin gel nuevamente a las cámaras de recolección. Cierre la tapa y presione el botón reanudar.

El gel free 8, 100 se ejecutará hasta el próximo intervalo de tiempo. El tiempo total restante en el experimento se muestra en el lado derecho de la pantalla. Presione el botón sobre el cuadro que muestra el tiempo para alternar entre el tiempo restante, el tiempo transcurrido y el tiempo para hacer una pausa.

Una vez que se han recogido todas las fracciones, se pueden utilizar inmediatamente para una preparación posterior, como el enfoque isoeléctrico o la electroforesis en gel, o para el análisis mediante cromatografía líquida, espectrometría de masas o inmunoafinidad. En esta demostración, ocho muestras de proteínas de 200 microgramos cada una se dividieron en 12 fracciones cada una para un total de 96 fracciones. Para visualizar los resultados del fraccionamiento y alícuota de cada una de las 12 fracciones de la muestra de homogeneizado de hígado bovino, se corrió en un gel 1D estándar y se tiñó con plata.

Como se muestra en esta figura, la muestra de proteína se fraccionó en 12 fracciones distintas que abarcan el rango de peso molecular de 3,5 kilodaltons a 150 kilodaltons. El gel que se muestra aquí destaca la capacidad del sistema 8, 100 sin gel para fraccionar una gran cantidad de proteína en distintas fracciones de peso molecular. Se trata de una herramienta increíblemente potente para la proteómica de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba mediante espectrometría de masas, así como para experimentos de inmunoafinidad en los que se requiere una única fracción de peso molecular de proteína intacta purificada.

Ha sido un placer mostrarle lo fácil que es utilizar el sistema de fraccionamiento 8, 100 sin gel para dividir de forma reproducible su muestra en fracciones discretas de peso molecular y lograr una alta recuperación de fase líquida. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.