Name: Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-03T16:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprende a usar el sistema GELFREE 8100 para fraccionamiento de proteínas por peso molecular con alta recuperación en fase líquida. Este método simplifica el análisis proteómico de muestras complejas.

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1. Preparación de muestras de proteínas <ol><li> En un tubo de microcentrífuga 500 l, combine las siguientes: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen a añadir: </td></tr><tr><td> * La proteína de la muestra (hasta 1 mg) </td><td> Hasta 112 l </td></tr><tr><td> Tampón de muestra (5 veces), siempre en el cartucho de juego </td><td> 30 l </td></tr><tr><td> DTT 1M </td><td> 8μL </td></tr><tr><td> 18 Ω H 2 O </td><td> l x a un total de volumen de muestra de 150μL ** </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Desnaturalizar las muestras a 95 ° C durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente. </li></ol> * La cantidad total de proteínas que ha separado dependerá de la complejidad de la muestra. Para muestras más complejas, tales como tejido homogeneizado, 150-200 mg por canal se recomienda. ** Si el volumen de la muestra es inferior a 112 l, agregar 18 Ω H 2 O para llevar el volumen final de 150 mL. 2. Carga del cartucho GELFREE <ol><li> Retire el cartucho de GELFREE 8100 de la bolsa de aluminio. </li><li> Retire y deseche el papel sellador del plato. </li><li> Quitar el tampón de almacenamiento de los compartimentos del cartucho con una pipeta. Si los 8 cámaras del cartucho se utiliza, el cartucho puede ser invertida para drenar el buffer de almacenamiento de los compartimentos. </li><li> Prepare el cartucho para la carga mediante la adición de buffer GELFREE ejecución de cada una de las cámaras de cartucho de la siguiente manera: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> GELFREE Cartucho Cámara </td><td> Volumen de Buffer GELFREE Running añadir </td></tr><tr><td> Depósito tampón anódico </td><td> 8 ml </td></tr><tr><td> Cátodo tanque de regulación </td><td> 6 mL </td></tr><tr><td> Colección de cámaras </td><td> 100 L cada uno </td></tr></tbody></table><ol start="5"><li> Retire y deseche cualquier buffer de la cámara de carga de la muestra. </li><li> Cargar las 150 muestras l en las cámaras de carga mediante una pipeta de 8 canales. </li><li> Coloque el cartucho cargado en la estación de Fraccionamiento GELFREE 8100. Baje la matrices de electrodos y cierre la tapa. </li></ol> 3. La ejecución del cartucho <ol><li> Usando la pantalla del instrumento s de la pantalla táctil, pulse el botón método para ver la lista de métodos preprogramados. Cada uno de los métodos pre-programados consiste en establecer las tensiones y las pausas en función del tiempo destinado a resolver las proteínas dentro de un rango específico de pesos moleculares. El 8100 GELFREE automáticamente una pausa para la recogida de fracción en los intervalos especificados en el método. </li><li> Una vez que el método apropiado ha sido identificado, presione el botón de recuperar, e introduzca el número deseado de la pre-programados método mediante el teclado en pantalla. Pulse Aceptar y luego pulse el botón Aplicar. El método que se ha aplicado en la parte inferior de la pantalla principal. </li><li> Para seleccionar los canales (número de muestras) que se utilizarán en la ejecución, presione el botón del canal en la pantalla principal. Para seleccionar los ocho canales, pulse Seleccionar todo. A continuación, pulse Listo para volver a la pantalla principal. </li><li> Asegúrese de que la tapa está cerrada y la seguridad de que el indicador es de color verde en la parte inferior de la pantalla. </li><li> Para comenzar la separación de proteínas, pulse Iniciar. La estación de fraccionamiento se detendrá automáticamente cuando sea el momento de recoger las fracciones. Nota: Aunque el sistema está funcionando, los círculos se muestra en el cuadro en la parte izquierda de la pantalla muestran el estado de cada canal. Un círculo verde indica que el canal está activo, un círculo amarillo indica que el instrumento se ha detenido, y un círculo rojo indica que el canal ha fallado. Las tensiones aplicadas y las corrientes se muestran a la derecha de los círculos de estado del canal. Fracciones sólo deben ser retirados cuando el estado de los círculos se han vuelto de color amarillo y una alerta de texto en la pantalla del instrumento s. </li><li> Para eliminar las fracciones, abra la tapa del instrumento y el uso de una pipeta de 8 canales para retirar 150 l de cada una de las cámaras de colección. </li><li> Una vez que las fracciones se han retirado, lavar la cámara de recolección dos veces con tampón GELFREE Correr por la adición de 100 l por canal y pipeteando arriba y abajo dos veces. </li><li> Después del lavado, añadir 100uL de GELFREE funcionamiento de amortiguación de nuevo en las cámaras de recolección, cierre la tapa y pulse el botón Reanudar. </li><li> El GELFREE 8100 se extenderá hasta el siguiente intervalo de tiempo. El tiempo total que queda en el experimento se muestra en la parte derecha de la pantalla. Para alternar entre el tiempo restante, el tiempo transcurrido y el tiempo para hacer una pausa, pulse el botón encima de la caja que muestra la hora. </li><li> Una vez que todas las fracciones se han collected, inmediatamente se puede utilizar para la preparación de más abajo, tales como el isoelectroenfoque y electroforesis en gel, o para el análisis mediante espectrometría de masas cromatografía líquida o de inmunoafinidad. </li></ol> 4. Resultados representante A 200 mg de homogenado de hígado de bovino fue dividida en 12 fracciones cada uno, utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE. 6 l de cada fracción se ejecutan en un gel PAGE 1D SDS y tinción de plata. Como se muestra en la Figura 1, la muestra de proteína se fraccionó en 12 fracciones distintas, que abarcan el rango de peso molecular de 3.5kDa a 150kDa. Un estándar de peso molecular (ColorBurst, Sigma) se muestran también en las calles 1 y 14. El gel se muestra aquí destaca el elevado índice de recuperación de lograr mediante el sistema de GELFREE 8100 para el fraccionamiento de proteínas. El gel se muestra aquí representa el 4% de la proteína recuperada a partir de 200 mg. <img src="/files/ftp_upload/1842/1842fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0"> Figura 1. Proteínas a partir de hígado de bovino homogenado separado utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE. 6 l de cada fracción de 150 l se carga y se ejecuta en un gel PAGE 1D SDS y tinción de plata. Un peso molecular (MW) estándar se ha cargado también, como se indica. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1842/1842fig1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1.

<ol><li>Tran, J. C., Doucette, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Size+Separation+of+Intact+Proteins+in+Solution+Phase+for+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem.%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry.</a> Anal Chem.. , (2009).</li>
</ol>

Los autores de este artículo trabajan para Protein Discovery, empresa que produce reactivos e instrumentos utilizados en este artículo.

El sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 proporciona un método rápido, simple y reproducible para la partición de muestras complejas de proteínas en función del peso molecular fracciones discretas. Este nuevo método de fraccionamiento elimina la necesidad de la banda o el corte in situ, por lo que es posible aislar las proteínas en un rango amplio de masas en 90 minutos. La capacidad de carga de cantidades relativamente grandes de la muestra y se recuperan las fracciones en la fase líquida es particularmente útil en el aislamiento y el análisis de proteínas de baja abundancia, que suelen ser más difíciles de detectar. Las fracciones resultantes se pueden utilizar en una amplia gama de aplicaciones, tales como LC-MS, MALDI-TOF, y la inmunotransferencia.

utilizando el sistema de fraccionamiento gelfree 8100 de peso molecular basado en fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

El sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 es un sistema de fraccionamiento de proteínas novedoso diseñado para maximizar la recuperación de proteínas durante el fraccionamiento en peso, basado molecular. El sistema se compone de un solo uso, de 8 muestras de cartuchos de capacidad y un Instrumento de sobremesa GELFREE fraccionamiento. Durante la separación, una tensión constante se aplica entre el ánodo y el cátodo de embalses, y cada mezcla de proteínas por electroforesis es impulsado a partir de una cámara de carga en un gel en columna de gel especialmente diseñado. Las proteínas se concentran en una banda estrecha en un gel de apilamiento, y separados en función de su movilidad electroforética respectivos en un gel de resolución. Como las proteínas se eluyen de la columna, se encuentran atrapados y se concentra en fase líquida en la cámara de recolección, sin el gel. El instrumento se detuvo en intervalos de tiempo específicos, y las fracciones se recogen con una pipeta. Este proceso se repite hasta que todas las fracciones deseadas se han recogido. Si menos de 8 muestras se realizan en un cartucho, sin usar ninguna cámara se puede utilizar en la separación posterior. Esta nueva tecnología facilita la separación rápida y sencilla de hasta 8 mezclas complejas de proteínas simultáneamente, y ofrece varias ventajas en comparación con los métodos de fraccionamiento previamente disponibles. Este sistema es capaz de fraccionar hasta 1 mg de proteína total por canal, para un total de 8 mg por cartucho. Las proteínas intactas sobre un rango amplio de masas se separan en función del peso molecular, conservando importantes propiedades fisicoquímicas de la sustancia analizada. El atrapamiento fase líquida permite la recuperación de alta al tiempo que elimina la necesidad de una banda de corte o lugar, haciendo que el proceso de fraccionamiento altamente reproducible 1.

El video que acompaña describe el uso del sistema de fraccionamiento GELFREE 8100, las particiones que las muestras de proteínas complejas sobre la base del peso molecular y se recupera la fracción en fase líquida. El video describe cómo funciona la tecnología, cómo se utiliza, y proporciona los datos resultantes, con el análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida de homogeneizado fraccionada hígado de bovino.

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

El sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 es un sistema de fraccionamiento de proteínas innovador diseñado para maximizar la recuperación de proteínas durante el fraccionamiento basado en el peso molecular...

Hola, mi nombre es Jay Harkins. Soy científico investigador en Protein Discovery. Hoy demostraré lo fácil que es utilizar el nuevo sistema de fraccionamiento sin geles 8, 100 para lograr un fraccionamiento basado en peso molecular con alta recuperación.Usando el sistema libre de geles, puede cargar hasta un miligramo de proteína total por canal y fraccionar de forma reproducible hasta ocho muestras en aproximadamente 90 minutos. El sistema incluye un instrumento, un cartucho desechable y todos los tampones necesarios para realizar el experimento. Comencemos.Comience este procedimiento preparando y etiquetando hasta ocho tubos de 500 microlitros cada uno. Añada hasta un miligramo de la muestra de proteína en un volumen de hasta 112 microlitros. La cantidad de proteína en la muestra depende de la complejidad de la misma.Para muestras más complejas, como el homogenato de tejido utilizado en esta demostración, de 150 a 200 microgramos por canal generarán los mejores resultados. A continuación, agregue 30 microlitros de tampón de muestra al cinco x, que se proporciona en el kit del cartucho libre de geles. A cada muestra de proteína, añada ocho microlitros de DTT uno molar.Luego, ajuste cada muestra con agua hasta un volumen final de 150 microlitros. A continuación, caliente los viales durante cinco minutos a 95 grados Celsius para desnaturalizar la muestra. Deje que las muestras calentadas se enfríen a temperatura ambiente mientras se enfrían.Retire el cartucho libre de gel 8, 100 del sobre de aluminio. Retire y deseche el sellador de placa. Retire el tampón de almacenamiento de los compartimentos del cartucho utilizando una pipeta.Si se van a utilizar las ocho cámaras del cartucho, invierta el cartucho para drenar el tampón de almacenamiento de los compartimentos. A continuación, se añaden ocho mililitros de tampón de electroforesis libre de gel a cada uno de los depósitos de tampón del ánodo. Se añaden seis mililitros a cada uno de los depósitos de tampón del cátodo, y se pipetean 100 microlitros en cada una de las cámaras de recolección.Utilizando un pipetador multicanal de 100 a 200 microlitros, retire y deseche cualquier tampón que haya pasado desde el depósito de tampón catódico hacia la cámara de carga de la muestra, y cargue inmediatamente las muestras en las cámaras de carga. Una vez cargadas las muestras, coloque el cartucho en la estación de fraccionamiento gel free 8 de 100. Luego, baje las matrices de electrodos y cierre la tapa utilizando la interfaz gráfica de usuario de fácil programación en la pantalla táctil del instrumento; vaya a la lista de métodos preprogramados disponibles.Seleccione el método adecuado pulsando el botón de método. Pulse el botón de recuperar y introduzca el número del método preprogramado deseado utilizando el teclado en pantalla; luego pulse aceptar. A continuación, pulse el botón aplicar.El método que se haya aplicado aparecerá en la parte inferior de la pantalla principal. Cada uno de los métodos preprogramados consiste en voltajes definidos y pausas basadas en el tiempo, diseñados para separar proteínas dentro de un rango específico de pesos moleculares. Una vez que se haya seleccionado el método adecuado, presione el botón de canal en la pantalla principal.Luego, seleccione los canales que se utilizarán en la corrida. Para seleccionar los ocho canales, presione seleccionar todo. A continuación, presione listo.Para regresar a la pantalla principal, asegúrese de que la tapa de seguridad esté cerrada y de que la luz indicadora en la parte inferior de la pantalla sea verde. Ahora presione inicio para comenzar el experimento; mientras el sistema está en funcionamiento, los círculos mostrados en el cuadro del lado izquierdo de la pantalla representan el estado de cada canal. Un círculo verde indica que el canal está activo.Los voltajes y corrientes aplicados se muestran a la derecha de los círculos de estado del canal. El sistema 8, 100 sin gel pausará automáticamente la recolección de fracciones al intervalo especificado en el método. Cuando el instrumento se detenga para recolectar fracciones, aparecerá un cuadro de texto notificando que se ha producido una pausa y los círculos de estado se volverán amarillos.Dentro del cartucho, se aplica un voltaje constante entre los depósitos del ánodo y del cátodo. Bajo este potencial, la mezcla de proteínas es impulsada electroforéticamente desde la cámara de carga y hacia el gel de precisión especialmente diseñado. Primero, las proteínas se apilan en una banda nítida dentro del gel de apilamiento y luego se separan según sus pesos moleculares respectivos en el gel de separación.A medida que las proteínas eluyen del gel, se retienen y concentran en fase líquida. En la cámara de recolección, libre de gel. Luego, se detiene el instrumento.Basándose en intervalos de tiempo y fracciones preseleccionados, se recolectan las fracciones utilizando una pipeta. Luego, se vuelve a aplicar el potencial para atrapar al final la segunda fracción de peso molecular de interés. Este proceso se repite hasta que se han recolectado todas las fracciones deseadas.Cada cartucho contiene ocho canales electroforéticos independientes, por lo que el usuario puede utilizar tantos canales como necesite y guardar los canales no utilizados para usarlos en una fecha posterior. Para retirar las fracciones, abra la tapa del instrumento y luego utilice la pipeta de canal integrada. Transfiera los 150 microlitros de líquido de cada cámara de recolección a tubos de recolección o a una placa de múltiples pocillos.Una vez que se hayan eliminado las fracciones, lave la cámara de recolección dos veces con tampón de corrida sin gel añadiendo 100 microlitros por canal y pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos veces. Después del lavado, agregue 100 microlitros de tampón de corrida sin gel nuevamente en las cámaras de recolección. Cierre la tapa y presione el botón de reanudar.El gel libre 8, 100 funcionará hasta el próximo intervalo de tiempo. El tiempo total restante en el experimento se muestra en el lado derecho de la pantalla. Presione el botón encima del cuadro que muestra el tiempo para alternar entre tiempo restante, tiempo transcurrido y tiempo para pausar.Una vez que se han recogido todas las fracciones, estas pueden utilizarse inmediatamente para preparaciones posteriores, como el enfoque isoeléctrico o la electroforesis en gel, o para análisis mediante cromatografía líquida, espectrometría de masas o afinidad inmunoquímica. En esta demostración, ocho muestras de proteínas, cada una con 200 microgramos, se fraccionaron en 12 fracciones cada una, para un total de 96 fracciones. Para visualizar los resultados de la fraccionación, se analizó una alícuota de cada una de las 12 fracciones procedentes de la muestra de homogenato de hígado bovino en un gel estándar unidimensional y se tiñó con plata.Como se muestra en esta figura, la muestra de proteína se fraccionó en 12 fracciones distintas que abarcan el rango de peso molecular desde 3,5 kilodalton hasta 150 kilodalton. El gel mostrado aquí resalta la capacidad del sistema sin gel 8, 100 para fraccionar una gran cantidad de proteína en fracciones distintas según su peso molecular. Esta es una herramienta sumamente poderosa para la proteómica de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba mediante espectrometría de masas, así como para experimentos de afinidad inmuno donde se requiere una fracción de peso molecular de proteína intacta y purificada individualmente.Ha sido un placer mostrarle lo fácil que es utilizar el sistema de fraccionamiento sin geles 8, 100 para particionar de forma reproducible su muestra en fracciones discretas de peso molecular y lograr una alta recuperación en fase líquida. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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