Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

Hola, mi nombre es Jay Harkins. Soy científico investigador en Protein Discovery. Hoy demostraré lo fácil que es utilizar el nuevo sistema de fraccionamiento sin geles 8, 100 para lograr un fraccionamiento basado en peso molecular con alta recuperación.

Usando el sistema libre de geles, puede cargar hasta un miligramo de proteína total por canal y fraccionar de forma reproducible hasta ocho muestras en aproximadamente 90 minutos. El sistema incluye un instrumento, un cartucho desechable y todos los tampones necesarios para realizar el experimento. Comencemos.

Comience este procedimiento preparando y etiquetando hasta ocho tubos de 500 microlitros cada uno. Añada hasta un miligramo de la muestra de proteína en un volumen de hasta 112 microlitros. La cantidad de proteína en la muestra depende de la complejidad de la misma.

Para muestras más complejas, como el homogenato de tejido utilizado en esta demostración, de 150 a 200 microgramos por canal generarán los mejores resultados. A continuación, agregue 30 microlitros de tampón de muestra al cinco x, que se proporciona en el kit del cartucho libre de geles. A cada muestra de proteína, añada ocho microlitros de DTT uno molar.

Luego, ajuste cada muestra con agua hasta un volumen final de 150 microlitros. A continuación, caliente los viales durante cinco minutos a 95 grados Celsius para desnaturalizar la muestra. Deje que las muestras calentadas se enfríen a temperatura ambiente mientras se enfrían.

Retire el cartucho libre de gel 8, 100 del sobre de aluminio. Retire y deseche el sellador de placa. Retire el tampón de almacenamiento de los compartimentos del cartucho utilizando una pipeta.

Si se van a utilizar las ocho cámaras del cartucho, invierta el cartucho para drenar el tampón de almacenamiento de los compartimentos. A continuación, se añaden ocho mililitros de tampón de electroforesis libre de gel a cada uno de los depósitos de tampón del ánodo. Se añaden seis mililitros a cada uno de los depósitos de tampón del cátodo, y se pipetean 100 microlitros en cada una de las cámaras de recolección.

Utilizando un pipetador multicanal de 100 a 200 microlitros, retire y deseche cualquier tampón que haya pasado desde el depósito de tampón catódico hacia la cámara de carga de la muestra, y cargue inmediatamente las muestras en las cámaras de carga. Una vez cargadas las muestras, coloque el cartucho en la estación de fraccionamiento gel free 8 de 100. Luego, baje las matrices de electrodos y cierre la tapa utilizando la interfaz gráfica de usuario de fácil programación en la pantalla táctil del instrumento; vaya a la lista de métodos preprogramados disponibles.

Seleccione el método adecuado pulsando el botón de método. Pulse el botón de recuperar y introduzca el número del método preprogramado deseado utilizando el teclado en pantalla; luego pulse aceptar. A continuación, pulse el botón aplicar.

El método que se haya aplicado aparecerá en la parte inferior de la pantalla principal. Cada uno de los métodos preprogramados consiste en voltajes definidos y pausas basadas en el tiempo, diseñados para separar proteínas dentro de un rango específico de pesos moleculares. Una vez que se haya seleccionado el método adecuado, presione el botón de canal en la pantalla principal.

Luego, seleccione los canales que se utilizarán en la corrida. Para seleccionar los ocho canales, presione seleccionar todo. A continuación, presione listo.

Para regresar a la pantalla principal, asegúrese de que la tapa de seguridad esté cerrada y de que la luz indicadora en la parte inferior de la pantalla sea verde. Ahora presione inicio para comenzar el experimento; mientras el sistema está en funcionamiento, los círculos mostrados en el cuadro del lado izquierdo de la pantalla representan el estado de cada canal. Un círculo verde indica que el canal está activo.

Los voltajes y corrientes aplicados se muestran a la derecha de los círculos de estado del canal. El sistema 8, 100 sin gel pausará automáticamente la recolección de fracciones al intervalo especificado en el método. Cuando el instrumento se detenga para recolectar fracciones, aparecerá un cuadro de texto notificando que se ha producido una pausa y los círculos de estado se volverán amarillos.

Dentro del cartucho, se aplica un voltaje constante entre los depósitos del ánodo y del cátodo. Bajo este potencial, la mezcla de proteínas es impulsada electroforéticamente desde la cámara de carga y hacia el gel de precisión especialmente diseñado. Primero, las proteínas se apilan en una banda nítida dentro del gel de apilamiento y luego se separan según sus pesos moleculares respectivos en el gel de separación.

A medida que las proteínas eluyen del gel, se retienen y concentran en fase líquida. En la cámara de recolección, libre de gel. Luego, se detiene el instrumento.

Basándose en intervalos de tiempo y fracciones preseleccionados, se recolectan las fracciones utilizando una pipeta. Luego, se vuelve a aplicar el potencial para atrapar al final la segunda fracción de peso molecular de interés. Este proceso se repite hasta que se han recolectado todas las fracciones deseadas.

Cada cartucho contiene ocho canales electroforéticos independientes, por lo que el usuario puede utilizar tantos canales como necesite y guardar los canales no utilizados para usarlos en una fecha posterior. Para retirar las fracciones, abra la tapa del instrumento y luego utilice la pipeta de canal integrada. Transfiera los 150 microlitros de líquido de cada cámara de recolección a tubos de recolección o a una placa de múltiples pocillos.

Una vez que se hayan eliminado las fracciones, lave la cámara de recolección dos veces con tampón de corrida sin gel añadiendo 100 microlitros por canal y pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos veces. Después del lavado, agregue 100 microlitros de tampón de corrida sin gel nuevamente en las cámaras de recolección. Cierre la tapa y presione el botón de reanudar.

El gel libre 8, 100 funcionará hasta el próximo intervalo de tiempo. El tiempo total restante en el experimento se muestra en el lado derecho de la pantalla. Presione el botón encima del cuadro que muestra el tiempo para alternar entre tiempo restante, tiempo transcurrido y tiempo para pausar.

Una vez que se han recogido todas las fracciones, estas pueden utilizarse inmediatamente para preparaciones posteriores, como el enfoque isoeléctrico o la electroforesis en gel, o para análisis mediante cromatografía líquida, espectrometría de masas o afinidad inmunoquímica. En esta demostración, ocho muestras de proteínas, cada una con 200 microgramos, se fraccionaron en 12 fracciones cada una, para un total de 96 fracciones. Para visualizar los resultados de la fraccionación, se analizó una alícuota de cada una de las 12 fracciones procedentes de la muestra de homogenato de hígado bovino en un gel estándar unidimensional y se tiñó con plata.

Como se muestra en esta figura, la muestra de proteína se fraccionó en 12 fracciones distintas que abarcan el rango de peso molecular desde 3,5 kilodalton hasta 150 kilodalton. El gel mostrado aquí resalta la capacidad del sistema sin gel 8, 100 para fraccionar una gran cantidad de proteína en fracciones distintas según su peso molecular. Esta es una herramienta sumamente poderosa para la proteómica de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba mediante espectrometría de masas, así como para experimentos de afinidad inmuno donde se requiere una fracción de peso molecular de proteína intacta y purificada individualmente.

Ha sido un placer mostrarle lo fácil que es utilizar el sistema de fraccionamiento sin geles 8, 100 para particionar de forma reproducible su muestra en fracciones discretas de peso molecular y lograr una alta recuperación en fase líquida. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.