Name: Procedimiento de mama epiteliales de Trasplantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a trasplantar epitelio mamario en ratones para estudiar el desarrollo glandular. Este método permite analizar el crecimiento del árbol ductal y comprender la biología del tejido mamario en modelos animales.

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1. Preparación del epitelio de Trasplantes Donantes de tejidos frescos o congelados epiteliales pueden ser trasplantados en la almohadilla de grasa despejado, pero la preparación previa del epitelio donante congelado es más conveniente, con una mínima disminución en la eficacia del trasplante (eficiencia&gt; 85%). El protocolo para la preparación del epitelio donante congelado es el siguiente: Antes de preparar el epitelio de trasplantes, preparar los medios de congelación para el epitelio y la alícuota de 1 ml en crioviales. Esto se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses hasta que sea necesario. Congelar los medios de comunicación contiene DMEM/F12 los medios de comunicación tamponado con HEPES y NaHCO 3, 10% de suero fetal bovino (SFB) y el 10% dimetilsulfóxido (DMSO). Cosecha de epitelio mamario de una hembra de ratón recién sacrificado. <ol><li> Lavar el ratón con un 70% EtOH. </li><li> Haga un corte sagital medio a través de la pared del cuerpo que se extiende desde el pubis hasta el esternón, sin perforar las membranas serosas de la cavidad ventral del cuerpo. Haga un corte oblicuo de la incisión inicial en el pubis hacia cada pata trasera (Figura 1). </li><li> Pele la pared del cuerpo lejos de las membranas serosas para exponer el 5 de glándula mamaria inguinal unido a la fascia en la parte inferior de la pared del cuerpo. La mejor manera de lograrlo es comprender las membranas serosas con cuidado con la parte curva de un par de pinzas curvas, teniendo cuidado de no perforar la cavidad ventral del cuerpo. Al mismo tiempo, sujete el borde del corte de la envoltura con la pinza dentada recta y tire de la pared del cuerpo lejos de las membranas serosas. </li><li> Identificar los ganglios linfáticos dentro de la glándula mamaria. El ganglio linfático se encuentra en la intersección de tres vasos sanguíneos prominentes en la glándula mamaria y se puede sentir como un nódulo denso dentro de la almohadilla de grasa (Figura 2). Con la punta de unas tijeras los ojos, cortar el tejido adiposo que rodea el nodo. Con un dedo índice en la parte epidérmica de la piel, aplique presión para sacar a los nodos de la capa de grasa y una pizca si fuera poco con un par de pinzas curvas. Deseche los ganglios linfáticos. </li><li> Mientras se mantiene al margen de la piel, sujete la almohadilla de grasa mamaria con el borde curvo de un par de pinzas curvas y poco a poco la cáscara de la almohadilla de grasa de la pared del cuerpo. Siga la dirección de la almohadilla de grasa hacia la superficie dorsal del ratón como se quita toda la glándula mamaria en una sola pieza. </li><li> Ponga la glándula mamaria en un bloque de plástico de corte estériles. Agregue una pequeña cantidad de medios de comunicación, cerca de 200 l, a la superficie de la glándula para mantenerlo húmedo. Picar la glándula en trozos de 1 mm con una cuchilla de afeitar nueva. Divide la glándula picada en cuatro partes y distribuir entre los cuatro crioviales de los medios de congelación con una pinza. Ponga el crioviales en un Nalgene "congelador de células Mr. Frosty que 250 ml de alcohol isopropílico en el compartimento exterior. Poner en el congelador Nalgene en un congelador de -70 º C durante 24 horas. Guarde los frascos congelados de fragmentos de mama en nitrógeno líquido hasta que sea necesario para trasplante. Cada criovial contendrá fragmentos de la glándula mamaria suficiente para el trasplante en las almohadillas de grasa despejado de 4 a 8 ratones de acogida. </li></ol> 2. Preparación de las células de Trasplantes Nuestro laboratorio ha trasplantado diferentes tipos de células, incluyendo inmortalizado líneas de células epiteliales mamarias de mama líneas de células tumorales o células primarias de mama en un ratón despejado almohadilla de grasa. El protocolo para la preparación de Coma-D para el trasplante de células es el siguiente: <ol><li> Coma-D células se cultivan en los medios de comunicación regulares MECL contiene DMEM: F12 suplementado con Adulto 2% de suero bovino (ABS), mEGF, insulina, antibióticos / antimicóticos (AB / AM). </li><li> Cosecha D comas las células cuando las células son un 85% -90% confluente. </li><li> Se centrifuga la suspensión celular a 1200rpm durante 5 minutos para que sedimenten las células. Resuspender las células en los medios de comunicación fresca MECL y ajustar la concentración de células a 5 x 10 6 / ml. </li></ol> Para el trasplante de células primarias de mama, la primaria de las células epiteliales mamarias están aislados de ratón 5 de las glándulas mamarias a través de la disociación mecánica y enzimática. Las células se resuspendieron en DMEM: medio F12 y se ajusta a la concentración deseada, por lo general 5 x 10 6 ml /. 3. Procedimiento estándar para la limpieza del ratón almohadilla de grasa mamaria <ol><li> Anestesiar el ratón de tres semanas de acogida de edad. Seleccione los ratones que son &lt;12 g para asegurar que el crecimiento ductal de mama no se ha iniciado. Usamos 200mg/kg de peso corporal de 2,2,2-tribromoetanol. </li><li> Después de que el ratón está anestesiado, con firmeza limitar el ratón, la parte ventral con las extremidades extendidas, en un tiempo quirúrgico, para que el abdomen se burla. Antes de la cirugía, administrar analgésicos, ya sea bupivacaína (1mg/kg &lt;) o la buprenorfina (0.05mg/kg), por vía subcutánea. </li><li> Sujete la piel con pinzas de unos pocos milímetros por encima de la pelvis y levántela desde el abdomen . Cortar la piel con unas tijeras y hacer un corte sagital medio a través de la pared del cuerpo que se extiende desde el pubis hasta el esternón. No perforar las membranas serosas de la cavidad ventral del cuerpo. No haga que su incisión inicial muy cerca de la uretra para que los clips de la herida no va a interferir con la capacidad del ratón para orinar. </li><li> De la incisión inicial, hacer cortes oblicuos a través de la piel de la línea media a través de la pelvis hacia cada pata trasera. </li><li> Utilice el área de la curva pinzas curvas para agarrar suavemente las membranas serosas. El uso de fórceps tejido de captar el margen de corte de la piel y tirar de la pared del cuerpo lejos de las membranas serosas y exponer el 5 de glándula mamaria inguinal situada en la fascia en la parte inferior de la pared del cuerpo. </li><li> Cauterizar el pezón, el nodo y dos arterias que van al nodo (Figura 2) </li><li> Separar las glándulas cuarto y quinto. Cauterizar el margen de la glándula quinto para prevenir el crecimiento interno de la glándula 6 ª. </li><li> Divide la almohadilla de grasa de la glándula mamaria cuarto cortando a través de la almohadilla de grasa con unas tijeras sólo ventral (lado hacia el pezón) del nodo. Use pinzas curvas para agarrar firmemente la porción ventral de la almohadilla de grasa y tire de ella fuera de la pared del cuerpo en una sola pieza. Presione la parte ventral de la capa de grasa entre dos diapositivas y poner en un recipiente de vidrio de tinción histológica que contiene el fijador de Carnoy. Este tejido se fijan y se tiñen después con solución de alumbre carmín para comprobar los márgenes de borrado (Figura 3). Limpie la fascia de la región de la porción eliminada de la almohadilla de grasa a eliminar todos los rastros de la glándula mamaria con las pinzas curvas. </li></ol> 4. Alternativa "procedimiento que preserve para la limpieza del almohadilla de grasa Después se ha convertido en un competente con el procedimiento estándar para limpiar el ratón almohadilla de grasa mamaria, es posible que prefieran realizar los procedimientos de preservación menos invasivo desarrollado por Brill et al. (2008) 2. <ol><li> Prepare el ratón como para el procedimiento estándar. </li><li> Sujete el pezón de la glándula mamaria inguinal cuarto y cortar un círculo de 3-5 mm circunferencia alrededor del pezón con la punta de unas tijeras. </li><li> Tire de la boquilla del cuerpo para separar la parte cortada de la piel y extraer la glándula mamaria inguinal cuarto por el agujero. </li><li> Identificar el nodo. Utilice el cauterio para cauterizar el nodo y la glándula mamaria 6 º a través del agujero. </li><li> Cortar y separar la parte más superficial de la glándula mamaria 5 º justo antes del nodo. Los pezones, la zona circular de la piel y la parte del epitelio de la almohadilla de grasa mamaria que contiene se eliminan en una sola pieza. </li></ol> 5. Tejido / Trasplante de células <ol><li> De los fragmentos de epitelio trasplante, descongelar un criovial del epitelio y la transferencia de los fragmentos epiteliales de una placa de Petri que contienen medio fresco para diluir el DMSO. Haz un pequeño agujero o en el bolsillo en la almohadilla de grasa despejó con la punta de tijera para el nuevo epitelio. Ponga un pedazo de 1 mm de epitelio de los donantes en el bolsillo con unas pinzas de aguja. Mantenga la bolsa cerrada con una pinza de tejidos al retirar la pinza de la aguja para que el tejido se mantiene en su lugar. </li><li> Para las células del trasplante, las células se inyectan 50.000 en 10 l de los medios de comunicación en cada capa de grasa con una jeringa Hamilton 50μl con una aguja de calibre 22s. </li></ol> 6. Cierre / Revival de ratón <ol><li> Organizar la piel para el cierre. Captar los márgenes opuestos de la piel, los mantienen unidos con unas pinzas, ascensor lejos de las membranas serosas de la cavidad ventral del cuerpo y cerrar con clips de la herida. Por lo general, es necesario utilizar dos clips para cerrar la incisión sagital medio y un clip para cada incisión oblicua para el procedimiento estándar. Evitar la obstrucción de la uretra. Puede que sea necesario para cerrar las brechas en la piel en la intersección de las incisiones sagital oblicuo y con una sutura. El procedimiento que preserve sólo requerirá un clip de la herida para cada lado. </li><li> . Coloque el ratón en su jaula y mantener la jaula con una lámpara de calentamiento hasta que el ratón ha revivido. </li><li> Los clips de la herida debe ser retirado después de 2 semanas. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Demostración de patrón de incisión. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Ubicación de los ganglios linfáticos, los vasos sanguíneos, el pezón y el epitelio endógeno. Cauterizar en los lugares indicados. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Montaje de la figura 3. Todo demuestra que el epitelio endógeno se limita a la zona dentro del círculo y por lo tanto, los márgenes son "claras". 7. Resultados representante _r.jpg "alt =" Figura 4 "/&gt; Figura 4. Todo el montaje de la almohadilla de grasa eliminado de ratón de 3 semanas de edad mostrando los márgenes de borrado. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Todo el montaje de un ratón de 10 semanas de edad muestran las almohadillas de grasa limpia de epitelio mamario endógeno. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Hematoxilina y eosina sección de una almohadilla de grasa despejado de un ratón de 10 semanas de edad. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Todo el montaje de un ratón de 10 semanas de edad muestren un funcionamiento normal del árbol ductal mamario desarrollado a partir de epitelio trasplantado. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Hematoxilina eosina y la sección de los conductos mamarios desarrollados a partir de epitelio trasplantado. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="Figura 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. Hematoxilina y eosina sección de un tumor mamario desarrollado a partir de epitelio trasplantado.

<ol><li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li>
<li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li>
<li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li>
<li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li>
<li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li>
<li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li>
<li>Wagner, K. -U., Boulanger, C. A., Henry, S. gagias, Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females%3A+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li>
<li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB%2Fc-Trp53%2B%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li>
</ol>

En este informe, se presentan dos métodos alternativos para la limpieza de la almohadilla de grasa mamaria de ratón en la preparación para los trasplantes de mama epiteliales. El procedimiento estándar ha estado en uso desde su desarrollo en 1959 por Enviaselo et al. 1 Mientras más invasivo, el método estándar es el método preferido para la formación de los principiantes, porque la estructura y la orientación de la glándula mamaria son fácilmente vistos. Sin embargo, el procedimiento que preserve pue...

procedimiento de mama epiteliales de trasplantes

Mammary Epithelial Transplant Procedure

En este artículo se describe y compara el procedimiento de autorización almohadilla grasa desarrollado por Enviaselo KB et al. 1 y el procedimiento que preserve desarrollado por Brill B et al. 2, seguido por el procedimiento de trasplante epiteliales mamarias. El procedimiento de trasplante de mama es ampliamente utilizado por los biólogos de mama, ya que se aprovecha del hecho de que un importante desarrollo del epitelio mamario no ocurre hasta después de la pubertad. A las 3 semanas de edad, el crecimiento del árbol epiteliales mamarias se limita a las cercanías del pezón y la almohadilla de grasa es en gran parte desprovista de epitelio mamario, pero por 7 semanas de edad del árbol epitelio ductal se extiende a lo largo de la almohadilla de grasa total. Por lo tanto, si esta pequeña porción de la almohadilla de grasa que contiene epitelio, la región entre el pezón y los ganglios linfáticos, se retira a las 3 semanas de edad, el epitelio endógeno nunca llenarán la almohadilla de grasa mamaria y la almohadilla de grasa que se describe como &quot;despejó &quot;. En este momento, el epitelio mamario de otra fuente pueden ser trasplantados en la almohadilla de grasa despejado en el que tiene el potencial para extender mama ductal árboles a través de la almohadilla de grasa. Este procedimiento ha sido utilizado en muchos modelos experimentales, incluyendo el examen del fenotipo tumoral en tejidos epiteliales mamarias transgénico sin los efectos de confusión del genotipo en el animal entero 3, en la identificación de células madre mamarias mediante el trasplante de células de la dilución 4,5 limitada, la determinación de si los nódulos hiperplásicos proceder a tumores mamarios 6, y para evaluar el efecto de la exposición hormonal previo sobre el comportamiento de el epitelio mamario 7,8. Tres semanas de edad, los ratones de acogida están anestesiados, limpia y contenida en una fase quirúrgica. Se hace una incisión sagital se realiza a través de la piel, pero no el peritoneo, que se extiende desde el pubis hasta el esternón. Cortes oblicuos se realizan a través de la piel de la incisión sagital a través de la pelvis hacia cada pierna. La piel se separa del peritoneo para exponer la cuarta glándula mamaria inguinal. La capa de grasa que se elimina mediante la eliminación de la anterior plataforma de tejido graso de los ganglios linfáticos. Fragmentos de epitelio o de las células epiteliales son trasplantadas en el resto de almohadilla de grasa y despejó el ratón está cerrado.

En este artículo se muestra el procedimiento desarrollado por Enviaselo KB<em&gt; Et al.</em&gt; (1959) y el procedimiento que preserve desarrollado por Brill B<em&gt; Et al.</em&gt; (2008) para limpiar el cuarto inguinal almohadilla de grasa mamaria de un ratón de la pubertad en la preparación para el trasplante de fragmentos de mama, las células epiteliales mamarias, o las células mamarias tumorales.

Procedimiento de mama epiteliales de Trasplantes

Este artículo describe y compara el procedimiento de eliminación del cojinete adiposo desarrollado por DeOme KB et al.1 y el procedimiento de preservación desarrollado por Brill B et al.2, ...

Este video demuestra los procedimientos para obtener memoria. Epitelio, elimine la almohadilla de grasa de la memoria y trasplante epitelio exógeno para estudiar el desarrollo de la memoria en ratones de tres semanas de edad. El crecimiento del árbol epitelial de la memoria está confinado a la vecindad del pezón, y la almohadilla de grasa carece en gran medida de epitelio de la memoria. A medida que el ratón madura, el árbol epitelial crece a través de la almohadilla de grasa.A las siete semanas de edad, el árbol ductal epitelial se extiende por todo el tejido adiposo. Si se elimina la pequeña porción del tejido adiposo que contiene epitelio a las tres semanas de edad, el epitelio endógeno nunca colonizará el tejido adiposo receptor y se dice que el tejido adiposo está despejado, permaneciendo así en la madurez. Los injertos de epitelio donante o células epiteliales, sin embargo, tienen la capacidad de extender árboles ductales por todo el tejido adiposo receptor despejado.Tejido adiposo. Luego, la histología puede utilizarse para monitorear la progresión del desarrollo de la memoria en tejidos trasplantados de animales transgénicos o de prueba. Hola, me llamo Joseph Jerry y estoy en el Departamento de Ciencias Veterinarias y de Animales de la Universidad de Massachusetts.Hola, mi nombre es Karen Dunphy. Trabajo en el laboratorio de Jerry. Hoy vamos a realizar un trasplante de epitelio mamario.Utilizamos este procedimiento para estudiar la base molecular y celular de la génesis de tumores de memoria y un modelo para el cáncer de mama. Comencemos. El primer paso del procedimiento de trasplante consiste en obtener tejido epitelial de memoria del ratón donante.Comience por lavar un ratón hembra recientemente sacrificado con etanol al 70% sin perforar las membranas de las URS de la cavidad corporal ventral. Realice un corte medio sagital a través de la piel que se extienda desde el pubis hasta el esternón. Luego, haga un corte oblicuo desde la incisión inicial en el pubis hacia cada pata trasera.Con pinzas curvas, sujete las membranas de los SRU. Luego, con pinzas rectas dentadas, sujete el borde cortado de la piel y retire cuidadosamente la pared corporal de las membranas de los S cs.Para exponer la cuarta glándula inguinal asociada a la cara inferior de la pared corporal, se localiza el ganglio linfático dentro de la glándula asociada en la intersección de tres vasos sanguíneos prominentes en la glándula asociada y puede percibirse como un nódulo denso dentro del tejido adiposo. Con la punta de un par de tijeras oftálmicas, corte el tejido adiposo que rodea el ganglio linfático. Luego, con un dedo sobre la cara epidérmica de la piel, aplique presión para elevar el ganglio fuera del tejido adiposo y extráigalo.Con un par de fórceps curvos, deseche el ganglio linfático. Ahora, sosteniendo los márgenes de la piel, agarre el cojín adiposo con el borde curvo de un par de fórceps curvos y desprenda gradualmente el cojín adiposo de la pared corporal. Siguiendo la dirección del cojín adiposo hacia la superficie dorsal del ratón, retire completamente la glándula adiposa en una sola pieza.Coloque la glándula mamaria sobre un bloque de corte plástico estéril con una pequeña cantidad de medio, aproximadamente 200 microlitros sobre la superficie de la glándula para mantenerla húmeda. Luego, pique la glándula en trozos de un milímetro de tamaño con una cuchilla nueva. Divida la glándula picada en cuatro porciones.Luego, utilizando pinzas, distribuya entre cuatro viales criogénicos con medio de congelación. Coloque los viales criogénicos en un congelador celular Nalgene con 250 mililitros de alcohol isopropílico en el compartimento exterior. A continuación, coloque el congelador celular a menos 70 grados Celsius durante 24 horas.Después de 24 horas, transfiera los viales congelados de fragmentos de memoria a nitrógeno líquido hasta que sean necesarios para el trasplante. Cada vial criogénico contiene fragmentos suficientes de glándulas de memoria para trasplantar en los tejidos adiposos vaciados de cuatro a ocho ratones huésped. Después de verificar la profundidad de la anestesia en un ratón huésped de tres semanas mediante una compresión firme del dedo del pie, sujete firmemente al ratón con el lado ventral hacia arriba y las extremidades extendidas sobre una plataforma quirúrgica, de modo que su abdomen quede tenso.Se debe administrar analgésico preoperatorio, bupivacaína o buprenorfina, por vía subcutánea. Desinfecte el área quirúrgica con alcohol y una solución antiséptica a base de yodo utilizando fórceps. Sujete la piel unos milímetros por encima de la pelvis y levántela del abdomen.Corte cuidadosamente la piel, asegurándose de que la incisión inicial no esté demasiado cerca de la uretra, ya que la colocación de clips quirúrgicos podría interferir con la capacidad del ratón para orinar. A continuación, teniendo cuidado de no perforar las membranas de las SRUs, realice un corte midsagital a través de la piel que se extienda desde el pubis hasta el esternón.Ahora, a partir de la incisión inicial, realice cortes oblicuos a través de la piel desde la línea media hacia cada pata trasera, atravesando la pelvis. Utilizando fórceps curvos, agarre suavemente las membranas serosas de la pared corporal ventral. Luego, use fórceps para tejidos para sujetar el borde cortado de la piel y tire de la pared corporal separándola de las membranas serosas.Para exponer la cuarta glándula inguinal mamaria, identifique la cuarta glándula mamaria. Identifique la quinta glándula mamaria, cauterice el nódulo del pezón y las dos arterias que conducen al nódulo. Separe la cuarta y la quinta glándulas, luego cauterice el margen de la quinta glándula.A continuación, utilizando tijeras, corte transversalmente el páncreas justo ventral al ganglio para dividir el páncreas de la cuarta glándula mamaria. Con pinzas curvas, sujete firmemente la porción ventral del páncreas y tire de ella alejándola de la pared corporal. Es recomendable presionar el tejido extirpado entre dos portaobjetos etiquetados y fijarlo en fijador de carnoy.Posteriormente, el tejido puede teñirse, montarse y evaluarse para determinar márgenes libres. Utilizando pinzas, retire todas las trazas de la glándula de la memoria alrededor de la región de la porción removida del tejido adiposo. El animal ya está listo para el trasplante de tejido o células.Se puede trasplantar tejido epitelial donante fresco o congelado rápidamente en la almohadilla grasa despejada. Alternativamente, se pueden trasplantar líneas celulares epiteliales inmortalizadas, líneas celulares de tumores epiteliales, o células primarias. Para detalles sobre la preparación de las células, consulte el protocolo escrito adjunto para el trasplante de fragmentos de epitelio. Preparado.Este video comienza descongelando un vial criogénico de epitelio y transfiriendo los fragmentos a una placa de Petri que contiene medio fresco. Para diluir el DMSO con tijeras, realice un bolsillo en el tejido adiposo epitelial despejado de la hembra receptora. Luego, utilizando fórceps de aguja, coloque un fragmento de epitelio donante de un milímetro dentro del bolsillo.Si es necesario, mantenga el bolsillo cerrado con pinzas para tejidos y retire las pinzas para aguja de modo que el tejido permanezca en su lugar. Sujete los márgenes opuestos de la piel. Manténgalos juntos con pinzas.Levántelos alejándolos de las membranas cerosas de la cavidad corporal ventral y cierre con clips quirúrgicos. Utilice dos clips para cerrar la incisión midsagital y un clip para cada incisión oblicua. Evite obstruir la uretra si es necesario.Cierre las heridas en la piel en el punto de intersección de las incisiones midsagital y oblicua con una sutura. Coloque el ratón en su jaula y mantenga la jaula bajo una lámpara de calor hasta que el ratón haya recuperado la conciencia. Los clips de la herida deben retirarse después de dos semanas.Las siguientes diapositivas muestran imágenes representativas de lo que se puede esperar encontrar en la glándula mamaria del hospedador tras eliminar el cojín alimentado y trasplantar el epitelio; esta imagen muestra el epitelio mamario endógeno extraído de un ratón de tres semanas de edad. En el procedimiento de eliminación del tejido glandular, observe los márgenes nítidos en el borde de corte. Se debe preparar una preparación completa como esta tras cada procedimiento para evaluar la presencia de márgenes limpios.Esta imagen muestra la almohadilla grasa aclarada del ratón siete semanas después del procedimiento de aclaramiento. Observe que toda la almohadilla grasa carece de memoria, epitelio, hematina y asina. La tinción de una almohadilla grasa aclarada siete semanas después del procedimiento de aclaramiento también demuestra que la glándula carece de epitelio memorioso.Se muestra un montaje completo representativo de una almohadilla grasa despejada trasplantada con epitelio memorioso donante de un ratón de 10 semanas de edad. Obsérvese que el epitelio trasplantado produjo árboles ductales epiteliales normales, hematina y asin. Tinción de una almohadilla grasa despejada y del epitelio memorioso.El trasplante epitelial a la misma edad revela la producción normal de conductos epiteliales a partir del epitelio exógeno. Aquí, la hematina y la asina, tinción de una almohadilla grasa despejada, muestran un trasplante epitelial que se desarrolló en un tumor mamario. Acabamos de mostrarle cómo cosechar el epitelio mamario y realizar un trasplante epitelial mamario.Al realizar este procedimiento, es importante recordar seccionar las conexiones entre la cuarta y la quinta glándula para cauterizar el nódulo y el pezón, y eliminar todos los rastros de epitelio endógeno. Se debe asegurar que no exista ninguna posibilidad de que el epitelio endógeno crezca dentro del lecho adiposo despejado. Además, es recomendable conservar la totalidad de la porción de la glándula mamaria removida para verificar márgenes despejados.Así es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Biología

En este informe, demuestran un sistema para aislar y cultivar células de donantes de la glándula mamaria de ratón, y ortotópicamente trasplante de estas células en ratones receptores para analizar estroma: interacciones epiteliales durante el desarrollo de tumores mamarios.

El trasplante de células del estroma mamario y células de carcinoma en los ratones C57BL/6J

Imagen de lapso de tiempo se utiliza para evaluar el comportamiento de las células mamarias preneoplásicas primarias epiteliales derivadas de los modelos de ratón genéticamente modificadas de riesgo de cáncer de mama para determinar si existen correlaciones entre los parámetros de comportamiento específicas y distintas lesiones genéticas.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Los modelos preclínicos que evalúan la terapia adyuvante dirigida a la metástasis del cáncer de mama están ausentes. Para tratar esto, se desarrolló un modelo murino de metástasis de adenocarcinoma mamario pulmonar de novo , en el que se pueden evaluar las terapias administradas en la configuración adyuvante (resección postquirúrgica de tumores primarios) en cuanto a eficacia en el impacto de metástasis pulmonares previamente sembradas.

Procedimientos quirúrgicos y metodología para un modelo murino preclínico De Novo Metástasis del cáncer mamario

Este protocolo describe métodos para purificar, cuantificar y caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exosomas de células epiteliales mamarias no adherentes / mesenquimales y para usarlas para transferir la capacidad de formación de glándulas mamarias a células epiteliales mamarias luminales. Los EVs / exosomas derivados de células epiteliales mamarias de tipo tallo pueden transferir esta propiedad celular a células que ingieren los EVs / exosomas.

Transferencia de la capacidad de formación de glándulas mamarias entre las células epiteliales basales mamarias y las células lumminales mamarias mediante vesículas extracelulares / exosomas

Este trabajo demuestra un nuevo enfoque para evaluar la proliferación, la diferenciación y el potencial de formación de vasos de células madre endoteliales vasculares (VESCs) a través de trasplante de almohadillas de grasa mamaria seguido de preparación de tejido de montaje completo para la observación microscópica. También se presenta una estrategia de seguimiento de linaje para investigar el comportamiento de VESCs in vivo .

Una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria para visualizar la generación de vasos de células madre endoteliales vasculares

El objetivo de este protocolo es describir un nuevo enfoque de modelado de cáncer de mama basado en la inyección intraductal de adenovirus Cre-expressing en las glándulas mamarias del ratón. Este enfoque permite la manipulación específica del tipo de célula y del órgano de los eventos oncogénicos de una manera controlada temporalmente.

Modelar el cáncer de mama a través de una inyección intraductal de Adenovirus C-expreso en la Glándula Mamaria del Ratón

Este artículo describe un método de trasplante para injertar células epiteliales mamarias de ratas de donantes en la almohadilla de grasa blanca interescapular de los animales receptores. Este método se puede utilizar para examinar los efectos del huésped y/o del donante en el desarrollo del epitelio mamario y elimina la necesidad de pre-clearing, extendiendo así la utilidad de esta técnica.

Trasplante de células epiteliales de rata mamaria en la almohadilla de grasa blanca interescapular

Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) y los modelos de ratón genéticamente modificados trasplantables recapitulan fielmente la enfermedad humana y son modelos preferidos para la investigación básica y traslacional del cáncer de mama. Aquí, se describe un método para trasplantar ortotópicamente fragmentos de tumores de mama en la almohadilla de grasa mamaria para estudiar la biología del tumor y evaluar la respuesta al fármaco.

Trasplante ortotópico de tumores de mama como modelos preclínicos para el cáncer de mama

El método de imágenes intravitales descrito aquí utiliza la segunda generación armónica de colágeno y la fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H para segmentar de forma no invasiva un microambiente tumoral no etiquetado en compartimentos tumorales, estromales y vasculares para un análisis en profundidad de imágenes intravitales 4D.

Un enfoque de segmentación sin etiquetas para imágenes intravitales del microambiente tumoral mamario

Aquí, presentamos procedimientos quirúrgicos detallados para la mastectomía endoscópica bilateral con preservación del pezón a través de una sola incisión axilar con reconstrucción mamaria prepectoral inmediata. Este procedimiento es un método seguro y viable para las pacientes con cáncer de mama.

Mastectomía endoscópica bilateral con preservación del pezón a través de una sola incisión axilar con reconstrucción mamaria prepectoral inmediata basada en implantes

El presente estudio informa de un protocolo más fácil, económico y que ahorra tiempo para aislar y cultivar de manera eficiente células epiteliales mamarias humanas primarias (HMEC) a partir de pequeñas cantidades de tejido mamario. Este protocolo es adecuado para producir rápidamente HMEC primarios tanto para aplicaciones de laboratorio como clínicas.

Aislamiento y cultivo de células epiteliales mamarias humanas primarias

Aprenda a trasplantar epitelio mamario en ratones para estudiar el desarrollo glandular. Este método permite analizar el crecimiento del árbol ductal y comprender la biología del tejido mamario en modelos animales.

Procedimiento de mama epiteliales de Trasplantes

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