Name: Recuperación de los ovocitos de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda a recuperar ovocitos y embriones tempranos de ratones Peromyscus mediante disección del tracto reproductivo e inyección de medio FHM en el infundíbulo. Este protocolo optimiza la obtención de células reproductivas para estudios de expresión génica e investigación transgénica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Me gustaría dar las gracias a Mike Dewey del Centro de Genética de archivo Peromyscus por su ayuda, paciencia y conocimiento.

Los ovocitos / embriones de recuperación <ol><li> Al menos dos horas antes de la recuperación de ovocitos / embriones, KSOM se coloca en el 37 º C incubadora de CO 2 y FHM se deben descongelar a partir de -20 º. Un plato de vidrio que contiene tres pozos de poca profundidad cóncava se utiliza a las caídas de la casa de KSOM en la incubadora. Para prevenir la deshidratación, la KSOM y el plato se colocan en un recipiente con tapa que tiene el agua en la parte inferior. Este aparato evita la evaporación sin el uso de aceite mineral. </li><li> Los oviductos de una hembra ovula se colocan en los medios de FHM. Para garantizar una orientación y un infindibulum intacta, una pequeña sección del ovario se corta a lo largo de la sección del oviducto y pequeñas del útero. Un contundente 30 aguja se utiliza para expulsar a los ovocitos / embriones del oviducto mediante la inserción de la aguja de punta roma en el infindibulum. El infindibulum debe ser utilizado para recuperar los embriones desde el tubo de oviducto es demasiado pequeño para una aguja de pasar. En el caso de que el infindibulum se destruye, el oviducto debe ser tajo o embriones expulsados. </li><li> Ovocitos / embriones se encuentran en los medios de FHM, centrándose en el microscopio las gotas de grasa que se han hundido en la parte inferior de la placa de Petri. Los ovocitos / embriones aislamiento se puede lograr a 20x, ya que proporciona una mayor área de visualización de gran aumento. Embriones / ovocitos parecen ronda gotitas de grasa que tienen un claro anillo a su alrededor. Pipetear con la boca, con un vaso tirado capilar, se utiliza para mover ovocitos / embriones de KSOM para la incubación y su posterior manipulación. </li></ol> Procedimiento para la recuperación de los ovocitos Preparación <ol><li> Descongele FHM y preparar KSOM. </li><li> Unas horas antes, KSOM colocarlo en un recipiente la extracción de óvulos y el lugar en el cuadro de la punta con agua en el fondo, lugar en incubadora de CO 2. </li><li> Traiga jaulas para el laboratorio y matar a las hembras de la cosecha. </li><li> Cortar el oviducto, teniendo cuidado de cortar algunos de los ovarios y algunos del útero para asegurarse de que no se cortó parte de oviducto. </li><li> Lugar en los medios de FHM en pequeña placa de Petri. </li><li> Vierta un par de placas de Petri FHM los medios de comunicación que se utilizarán para el lavado. </li></ol> Flushing <ol><li> Use una aguja de lavado (30 calibre romo) conectado a una aguja de 1 ml con final en espiral. </li><li> Tome un oviducto a la vez y con la aguja, insertar en infundíbulo encuentra cerca de la parte del ovario izquierdo adjunto. Si el infundíbulo se destruye y no se puede utilizar, luego tomar dos pinzas y sostener un extremo del oviducto. Con la pinza de otros, apriete suavemente, como un tubo de pasta de dientes, para expulsar el embrión. Nota: Esto creará una gran cantidad de desorden en la placa de Petri, ya que una gran cantidad de tejido se vienen con él, por lo que es posible que desee utilizar otra placa de Petri después. </li><li> Para ver los embriones, se centran en el microscopio de las piezas de grasa y buscar todo &quot;pedazo de grasa&quot; con el círculo claro que lo rodea. Nota: Los embriones tienen el mismo aspecto que la grasa, lo que puede ser difícil de encontrar. Los embriones se hunden hasta el fondo, a fin de buscar allí. </li><li> Hacer frotis vaginal de las hembras receptoras. En esta etapa, deben ser pseudopreñadas. </li></ol>

En este artículo, se demuestra la recuperación de los ovocitos de la ovulación inducida (superovuladas) Peromyscus. El uso de superovulación (en comparación con el ciclo estral natural) es común debido a un número mucho mayor resultado. Sin embargo, se debe tener cuidado al interpretar los resultados de la utilización de ovocitos como / embriones, ya que tanto las hormonas utilizadas para inducir la ovulación y el cultivo puede tener efectos. Cuando estro ha sido confirmado, las mujeres son euthenized y los oviductos se recuperó con...

<table><tbody><tr><td>Aguja de lavado</td><td>Herramienta</td><td>Zephyrtronics</td><td>ZT5-130-L</td><td>30 G roma</td></tr><tr><td>Pinzas (2)</td><td>Herramienta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>Peromyscus</td><td>Animal</td><td>Peromyscus Genetic Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Herramienta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Medio tamponado con HEPES FHM</td><td>Reactivo</td><td>Specialty Media</td><td>MR-025-d</td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo embrionario KSOM (5x 10 mL)</td><td>Reactivo</td><td>Specialty Media</td><td>MR-020P-5F</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de boca</td><td>Herramienta</td><td></td><td></td><td>Extraída de capilares de vidrio y conectada a tubo de goma</td></tr><tr><td>Plato para oocitos</td><td>Herramienta</td><td></td><td></td><td>Recipiente de vidrio con depresiones cóncavas</td></tr></tbody></table>

recuperación de los ovocitos de ratón

Retrieval of Mouse Oocytes

Hasta la fecha, sólo unos pocos estudios han informado de manipulaciones éxito de la embriogénesis Peromyscus o la biología reproductiva. Junto con el archivo Peromyscus Centro Genético (http://stkctr.biol.sc.edu), estamos caracterizando las diferencias relevantes necesarios para desarrollar este sistema. Un objetivo principal ha sido optimizar los ovocitos / recuperación temprana del embrión.

Este protocolo se muestra la técnica para la extracción de los ovocitos o embriones en estadio temprano fertilizados del oviducto de los ratones. La capacidad de identificar la infindibulum e insertar una aguja de punta roma en que es esencial para la correcta realización del procedimiento.

Recuperación de los ovocitos de ratón

Hasta la fecha, solo unos pocos estudios han informado manipulaciones exitosas de la embriogénesis o la biología reproductiva de Peromyscus. Junto con el Peromyscus...

Mi nombre es Amanda dli. Soy del laboratorio del Dr. Paul Verana en la Universidad de California en Irvine. Hoy les mostraré el procedimiento para la recuperación de ovocitos.Esto implica aislar el videx de la hembra. Una vez que los ovex están aislados, inyectaremos medio FHM a través del videx, y luego las cytes deberían salir del útero. Una vez realizado esto, aislaremos las cytes en el medio y utilizaremos este material para experimentos futuros.Lo que quizás desee usar este procedimiento para, además de aislar cito, es aislar embriones en puntos temporales específicos. Una razón por la que podría desear ver este procedimiento en formato de video es porque las diferentes partes del oviducto pueden ser muy difíciles de reconocer. En este video, señalaré el infundíbulo, donde inyectará el medio FHM.Las herramientas de disección que utilizará consisten en dos juegos de pinzas finas y un par de tijeras afiladas. Los conductos ovígeros extraídos de la hembra se colocarán en medio FHM, el cual se encuentra en una placa de cultivo tisular de 35 milímetros. Los óvulos se recuperarán utilizando una aguja de extremo romo de 30 milímetros acoplada a una jeringa de un mililitro, y el uc se estabilizará con una pinza fina.El medio de mantenimiento FHM se utiliza para recolectar los ovocitos. KSOM es el medio empleado para permitir el desarrollo de los ovocitos en el interior del incubador, en caso de que sean fertilizados. Una vez recuperados los óvulos y embriones del oviducto, utilizaremos una pipeta de transferencia de vidrio, elaborada a partir de un tubo capilar, que lleva acoplado un tubo flexible, para aspirar mediante pipeta de boca y transferirlos a un medio de mantenimiento.Se utiliza un recipiente de vidrio cóncavo para sostener los embriones y los huevos. Estos pueden colocarse en cada círculo cóncavo de manera que queden en una ubicación definida, lo que facilita su localización. Este recipiente se coloca dentro de este contenedor para poder introducirlo en una incubadora de CO2 sin necesidad de usar aceite.Encima del medio FHM o KSOM, dependiendo del medio, se coloca agua en la base, se cierra la llave y el líquido permanece en su lugar. Se utiliza etanol al 70 % para asegurarse de que el pelo no interfiera. Se realizará una pequeña incisión en la región abdominal y otra incisión en la cavidad abdominal.Aumentaremos un corte para exponer la región abdominal. Una vez hecho esto para exponer el útero, moveremos los intestinos, por cierto, y luego el útero está bastante por debajo. El útero tiene forma de Y y rotan salvajemente tomando parte del útero.Cuando se corta, el oviducto tiene aspecto de espagueti. Voy a intentar tomar una parte del oviducto. Tomaré la UCT y una parte de los ovarios, que está rodeada de grasa.El otro lado va a ser tomado. En este momento, nuevamente, vamos a tomar el ovario o el útero. Tome el útero aquí, corte por debajo de nuestro punto de fijación. En este punto se encuentran los conductos vid. Voy a llevar una parte del ovario OV con nosotros. Esto luego se colocará en medio. El útero sigue contrayéndose.El útero está compuesto de músculo liso, por lo que, aunque esté separado del cuerpo, las neuronas siguen disparándose. Aquí se muestra el útero. Mientras que el conducto OV parece espagueti y el ovario se encuentra por encima, el conducto OV no está realmente unido al ovario.Aunque hasta este momento solo hemos mostrado una porción del ovario, mi mano dominante es la derecha, con la que sostengo la aguja de calibre 30 con extremo romo. Utilizo esta aguja como una pinza para aislar el in fibula. Una vez que se ha aislado, inyectaré la aguja roma en el in fibula e introduciré un líquido que saldrá a través del útero.Mi mano izquierda sostiene una pinza fina. Esta se utiliza para aislar la amígdala fibular y mantener todo en su lugar. La amígdala tiene forma de trompeta y está aislada aquí.La punta de mi aguja está en la fíbula, que atravesaba la capa de tejido. Bien. Para asegurarme de que he aislado todos los embriones y óvulos, me gusta presionar como si fuera un tubo de pasta dental sobre el útero. Una vez que te concentras en las almohadillas de grasa, debes buscar lo que parece gotas de grasa que son perfectamente simétricas.Hay uno ahora mismo justo a la izquierda de esa grasa larga. Ese es un solo huevo. Entonces, lo que voy a hacer es tomar la boca de la pipeta, recoger el huevo y colocarlo en más medio de mantenimiento para poder aislar los huevos mismos.Hoy les he mostrado cómo aislar citocitos del tracto reproductivo femenino. Además, les he mostrado las diferentes estructuras de la trompa de Falopio. En particular, el infundíbulo, que es la única estructura en la cual se puede inyectar el medio FHM.Con una aguja de calibre 30. Con esta técnica, he aislado células y cualquier embrión que haya estado presente en el tracto reproductivo femenino. Puedo utilizar estos materiales para estudios de expresión génica o trabajos transgénicos.

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Los ovocitos son propensos a la aneuploidía debido a errores en la segregación cromosómica durante la maduración meiótica. Huevos aneuploides puede causar infertilidad, abortos involuntarios o trastornos del desarrollo como el síndrome de Down. Aquí se describen los métodos para introducir los materiales de elección en los ovocitos y los métodos para estudiar la maduración meiótica y evaluar la ploidía.

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

Este video describe el aislamiento de ovocitos antrales de ovarios de ratón recién recolectados. Estos ovocitos antrales se pueden utilizar para estudios posteriores de caracterización y desarrollo.

Aislamiento de ovocitos antrales de ratón: un método para aislar ovocitos antrales de ovarios de ratón recién recolectados

A continuación, presentamos un protocolo para el agotamiento de ARNm siRNA mediada específico seguido por análisis de inmunofluorescencia para evaluar ensamblaje del huso meiótico y la organización de los ovocitos de ratón. Este protocolo es adecuado para el agotamiento de las transcripciones in vitro y la evaluación funcional de los diferentes husillo y / o factores MTOC asociada en ovocitos.

Evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento siRNA mediada

Aquí se presenta un protocolo para la caracterización de los ovocitos antrales ratón sobre la base de la organización nucleolar.

Aislamiento y caracterización de ratón antral Los ovocitos Sobre la base de organización de la cromatina nucleolar

Ovogénesis en mamíferos es conocido por ser errores, particularmente debido a protooncogenes del cromosoma. Este manuscrito describe métodos de preparación de cromatina extensión de profase de ratón, metafase I y II etapas ovocitos. Estas técnicas fundamentales permiten el estudio de las proteínas de la cromatina-limite y morfología cromosómicas en mamíferos Oogénesis.

Cromatina difundir preparados para el análisis de progresión de ovocitos de ratón de profase a metafase II

Se presenta un protocolo optimizado que permite el agotamiento de los centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón durante la metafase I utilizando un láser de femtosegundo de infrarrojo cercano.

Ablación con láser multifotón de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón

El error en la segregación cromosómica es una característica común en los ovocitos. Por lo tanto, estudiar el punto de control de ensamblaje del husillo da pistas importantes sobre los mecanismos necesarios para producir óvulos sanos. El presente protocolo describe tres ensayos complementarios para evaluar la integridad del punto de control del ensamblaje del huso en ovocitos de ratón.

Evaluación de la integridad del punto de control del ensamblaje del husillo en ovocitos de ratón

Este protocolo proporciona un marco experimental para documentar el impacto físico del citoesqueleto en la forma nuclear y los orgánulos internos sin membrana en el sistema de ovocitos de ratón. El marco se puede adaptar para su uso en otros tipos de células y contextos.

Captura de la agitación basada en el citoesqueleto del núcleo del ovocito de ratón a través de escalas espaciales

Este protocolo describe procedimientos para la maduración in vitro de ovocitos de ratón, la fertilización in vitro y el posterior cultivo embrionario hasta la etapa de blastocisto.

Maduración in vitro, fertilización y cultivo de embriones preimplantacionales de ovocitos de ratón

Esta película y el protocolo se pretende ayudar al aprendizaje de la transferencia nuclear.

Transferencia nuclear en ovocitos de ratón

Aprenda a recuperar ovocitos y embriones tempranos de ratones Peromyscus mediante disección del tracto reproductivo e inyección de medio FHM en el infundíbulo. Este protocolo optimiza la obtención de células reproductivas para estudios de expresión génica e investigación transgénica.

Recuperación de los ovocitos de ratón

Explorar más videos