Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Una preparación de epitelio olfativo se monta en un plato y se coloca en una corriente de aire humidificado. Bajo un microscopio de disección, un electrodo de referencia se conecta eléctricamente al tejido a través de una solución tampón. Se coloca un electrodo registrador en la superficie del epitelio olfativo.

El epitelio olfativo es estimulado por inhalaciones odoríferas controladas por computadora administradas en una corriente de aire humidificado, que transporta los odorantes al epitelio olfativo. Las señales EOG se transmiten a través de un amplificador y un digitalizador a la computadora de grabación. Hola, soy Catherine Ciar del Laboratorio de Higiene XO del Departamento de Biología de la Universidad Johns Hopkins.

Hoy te mostraremos un procedimiento para registrar el gramo electro olf facto de ratones. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las respuestas de las neuronas sensoriales olfativas a los olores. Así que comencemos.

El aparato de registro consta de un electrodo de registro, un electrodo de referencia, un tubo de suministro de aire, una etapa de muestra y un microscopio de disección, todo anclado en una mesa de aire dentro de una jaula de Faraday. Los manipuladores Microm se utilizan para la colocación de los electrodos en el tubo de suministro de aire. Se burbujea una corriente de aire continua a través de agua destilada para agregar humedad antes de pasar a través del tubo de suministro de aire y sobre la muestra.

Una placa de cultivo de 60 milímetros llena de sardo para adaptar de seis a ocho milímetros se utiliza como superficie de montaje para el espécimen. Un pozo y un canal están ahuecados fuera de la protección en el plato de montaje. Proporcionar un medio para conectar eléctricamente el electrodo de referencia a la muestra a través de una solución de timbre modificada.

Los electrodos de registro y referencia están conectados a un amplificador. Las señales del amplificador se envían a un digitalizador y luego a una computadora. El software de gráficos XI se utiliza para controlar el protocolo de estimulación, registrar la señal y analizar las respuestas.

Un osciloscopio se conecta después del amplificador para monitorear el potencial eléctrico en tiempo real mientras se coloca el electrodo de registro. Y durante las grabaciones de EOG. La administración de los estímulos odorantes es controlada por un pico rociador, que está conectado a la misma computadora utilizada para la adquisición de señales justo antes de administrar un estímulo odorante.

La salida del pico spritzer está conectada a una botella de odorante que contiene odorante líquido. A continuación, la botella se conecta al tubo de suministro de aire. Ahora veamos cómo preparar los electrodos para registrar experimentos.

El electrodo de registro es un alambre de cloruro de plata en un capilar de vidrio estirado lleno de solución de timbre modificada. El electrodo de referencia es un alambre de cloruro de plata. Comience la preparación de ambos electrodos instalando un cable plateado en el soporte de electrodos.

Para el electrodo de registro, deben sobresalir de uno a dos centímetros de alambre del extremo del soporte del electrodo. Se puede dejar más cable para el electrodo de referencia. Para agregar el recubrimiento de cloruro de plata, coloque el cable en cloruro de sodio de 0.1 molar y conecte el portaelectrodos al terminal positivo de una fuente de alimentación de CC de 1.5 a nueve voltios.

El terminal negativo de la fuente de alimentación debe estar conectado eléctricamente a la solución de cloruro de sodio 0,1 molar. Deje que el cloruro en reacción proceda durante 10 minutos para igualar cualquier carga estática entre el registro y el electrodo de referencia. Toque brevemente los electrodos antes de instalarlos en el aparato de registro.

A continuación, extraiga un capilar de vidrio con un extractor de micropipetas. La abertura en la punta del capilar debe tener alrededor de cinco a 10 micras de diámetro. Use un lápiz de diamante para marcar y romper el extremo romo del capilar para que sea aproximadamente dos centímetros más largo que el alambre de plata.

Use un soplete de butano para pulir al fuego el extremo cortado, ahora derrita 0.5%agros en una solución de ringer modificada. Utilice una pipeta de transferencia para introducir una pequeña cantidad de solución agro fundida en la punta del electrodo utilizando una jeringa que haya sido calentada y tirada para tener un extremo largo y delgado. Llene el capilar extraído aproximadamente hasta la mitad.

Con la solución de timbre modificada, agite suavemente el capilar para desalojar las burbujas de aire. Guarde el electrodo lleno en el frasco de almacenamiento con una pequeña cantidad de solución de timbre modificada en el fondo hasta que esté listo para usar. Una vez que una muestra de tejido esté preparada y lista para el registro, instale un capilar lleno sobre el cable del electrodo de registro con los electrodos listos.

Veamos un experimento de grabación para comenzar a preparar el tejido para la grabación. Retire la piel que recubre el cráneo de un ratón sacrificado y divida la cabeza a lo largo de la línea media, monte la mitad de la cabeza, con el lado medial hacia arriba, en el plato de montaje. Retire con cuidado el tabique para exponer los cornetes.

Coloque el plato con el pañuelo de papel montado en la platina de grabación. Alinee la platina de modo que la ubicación de registro en los cornetes esté centrada bajo el microscopio. Ahora encienda el tanque de aire para entregar aire humidificado a alrededor de 600 mililitros por minuto a la superficie del cornete.

Coloque el tubo de suministro de aire de modo que esté a una distancia aproximada de 10 milímetros del lugar de grabación. Configure el amplificador en modo CC, ya que la amplificación de CA inducirá artefactos en la señal EOG. Adquirir con un filtro de paso bajo de un kilohercio y una ganancia de 100 x.

Ahora monte los electrodos de registro y referencia en los micromanipuladores. Baje el electrodo de referencia en el pocillo del plato de montaje y cúbralo con una solución de timbre modificada de modo que se conecte eléctricamente al tejido. Baje con cuidado el electrodo de registro sobre la superficie del cornete, dos B o tres.

El electrodo apenas debe tocar la superficie del epitelio olfativo. Cuando el electrodo entra en contacto con el epitelio, aparecerá una línea de base recta en el osciloscopio. Ahora, conecte una botella de odorante al puerto lateral del tubo de suministro de aire en la computadora.

Inicia un protocolo de estimulación. La frecuencia de muestreo para la adquisición de datos debe ser de dos kilohercios o más. El software activará un pulso de olor y comenzará a grabar.

Un protocolo de estimulación típico puede ser de 100 milisegundos de duración, pulso único emparejado, pulsos de 100 milisegundos separados por un intervalo de un segundo o un pulso sostenido de diez segundos. Para minimizar la adaptación, espere de uno a cinco minutos entre protocolos después de administrar altas concentraciones de olor. El olor residual puede permanecer en el tubo, lave el tubo de aire con etanol al 95% y seque antes de continuar con muestras de tejido adicionales.

El software de injerto Axo proporciona herramientas para medir los parámetros clave de la señal EOG. Dichos parámetros incluyen la amplitud de respuesta, la latencia, el tiempo hasta el pico y las constantes de tiempo de terminación. Varios parámetros del EOG son particularmente útiles para la comparación de respuestas normalizadas entre ratones, incluida la amplitud de respuesta, el tiempo de aumento de la latencia, el tiempo hasta el pico y la constante de tiempo de terminación.

Aquí se muestran OG de un ratón en respuesta a la estimulación con concentraciones crecientes de acetato de amilo líquido. La línea negra en la parte superior indica el momento y la duración de la estimulación odorífera. Aquí vemos una relación dosis-respuesta promediada a partir de cinco barras de error de ratones con intervalos de confianza del 95%.

A menudo se observa una disminución en la amplitud del pico a concentraciones de olor muy altas. Se muestra un ejemplo de un EOG en respuesta a una estimulación de pulso emparejada: un solo pulso corto de odorante provoca una adaptación que dura varios segundos. Aquí se muestra un EOG en respuesta a 10 segundos de estimulación odorífera sostenida.

El EOG muestra desensibilización durante la presentación continua del odorante. Acabamos de mostrarte cómo registrar el gramo del factor de electrodo de ratones. Al realizar este procedimiento, es importante recordar colocar el electrodo justo en la superficie del epitelio y no penetrar el electrodo por debajo de la superficie.

Siempre registre desde el mismo lado de la cabeza y evite modificaciones en la configuración para minimizar la variación, mantenga el tejido húmedo, pero sin acumular gotas de líquido, poner el tejido bajo el aire humidificado inmediatamente después de la disección mantendrá el tejido en el mejor estado para la grabación. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.