Aislamiento y enriquecimiento de las células de rata madre mesenquimales (MSC) y la separación de una sola colonia Derivado MSC

Las células madre mesenquimales, abreviadas como CMM, se aíslan de una rata hembra de seis a ocho semanas de edad y se cultivan en una placa de Petri de 10 centímetros hasta que alcancen aproximadamente un 80 % de confluencia. Para enriquecer las CMM, las células se tiñen con anticuerpos primarios conjugados con biotina, seguidos de microesferas magnéticas conjugadas con estreptavidina. Las células marcadas luego se separan en dos fracciones, la fracción negativa y la fracción positiva, mediante clasificación magnética activada de células.

Posteriormente, se utiliza el análisis de citometría de flujo para confirmar la expresión de marcadores de superficie. Finalmente, se emplean cilindros de clonación para obtener MSC derivadas de colonias individuales. Hola, soy Lee del laboratorio de Christina Chang en el Departamento de Ingeniería Química y Ciencia de Materiales de la Universidad Estatal de Michigan.

Hoy les mostraremos un procedimiento para el aislamiento y enriquecimiento de células madre quiméricas, así como para la obtención de células derivadas de colonias individuales. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los comportamientos de proliferación y diferenciación de las células madre rojas. Así que comencemos.

Las células madre mesenquimales o CMM se aislarán de una rata hembra spra dolly de seis a ocho semanas de edad. Para comenzar este procedimiento, corte los fémures y las tibias de las extremidades traseras del animal sacrificado. Retire la piel y los músculos, coloque los fémures y tibias diseccionados en isopropanol al 70 % durante unos segundos, y luego transfiéralos a un X-D-P-B-S.

Los siguientes pasos deben realizarse en una cabina de seguridad biológica. Primero, transfiera el fémur y la tibia a una placa de 10 centímetros que contenga DMEM. Luego, mientras sostiene cada hueso con pinzas, corte los dos extremos con tijeras.

Coloque una aguja de calibre 22 en una jeringa de tres mililitros y llénela con DMEM. Introduzca la aguja en uno de los extremos abiertos del hueso y lave la médula hacia un tubo de 50 mililitros. Repita dos a tres veces por cada hueso hasta obtener toda la médula.

Re-suspender las células, luego pasar la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micrómetros para eliminar los restos óseos y los agregados sanguíneos. Centrifugar las células a 200 GS a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Después de eliminar el sobrenadante por aspiración, re-suspender las células en 25 mililitros de medio de siembra para CEM.

10 mililitros de suspensión celular en cada una de dos placas de cultivo de 10 centímetros. Incubar las placas de cultivo en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante una a dos semanas. Una vez que los MSC aislados previamente de rata alcancen una confluencia de aproximadamente el 80%, aspire el medio y agregue de cuatro a cinco mililitros de tripsina-EDTA a cada placa.

Devuelva las placas al incubador e incube durante aproximadamente cinco minutos. Para permitir la disociación celular, agregue una cantidad igual de medio de cultivo para inactivar la tripsina. Recoja las suspensiones celulares en un tubo de 15 mililitros y centrifugue las células a 200 GS a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.

Ahora demostraremos el enriquecimiento de las CMM mediante dos marcadores de superficie, CD 54 y CD 90. Utilizando el imán de separación celular BD I de BD Biosciences, comience por resuspender el botón celular en tampón de tinción para células a 20 millones de células por mililitro.

A continuación, agregue el anticuerpo biotinilado contra CD54 y un anticuerpo biotinilado contra CD90 a la suspensión celular y mezcle suavemente. Incube en hielo durante 15 minutos, luego lave las células marcadas con un volumen excesivo de tampón BD IMAG 1X. Centrifugue las células marcadas a 200 × g y 4 grados Celsius durante cinco minutos. Prepare las partículas de estreptavidina BD IMAG agitando vigorosamente por vórtex y luego agregue 40 microlitros de partículas por cada 10 millones de células.

Mezcle las partículas con las células marcadas completamente e incube las células a entre seis y 12 grados Celsius durante 30 minutos. Durante este tiempo de incubación, etiquete un tubo de ensayo de fondo redondo para recolectar la fracción positiva. Una vez finalizada la incubación, ajuste el volumen de marcado a 20 millones de células por mililitro.

Con un tampón Expedia I mag. Transfiera las células marcadas al tubo de recolección de la fracción positiva. Coloque el tubo de la fracción positiva sobre el imán BDI y déjelo reposar durante seis minutos.

Luego, con el tubo de la fracción positiva aún en el imán BDI, retire el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio. A continuación, retire el tubo de la fracción positiva del imán BDI y colóquelo en hielo. Añada un mililitro de buffer mágico BDI 1X frío y resuspenda las células mediante mezcla suave.

Coloque el tubo nuevamente sobre el imán BDI y déjelo durante dos a cuatro minutos. Retire el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio nueva. Repita el lavado como se describió anteriormente.

Una vez más. Finalmente, retire el sobrenadante con una nueva pipeta Pasteur de vidrio. A continuación, retire el tubo del imán BDI reus.

Suspenda las células en un mililitro de medio de cultivo y transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de medio semilla. 1 matraz de 75 centímetros cuadrados para el mantenimiento de las células y un plato de 10 centímetros para citometría de flujo.

Para comenzar el procedimiento de separación de MSC derivadas de colonias individuales, siembre las células a aproximadamente 50 a 100 células por placa de 10 centímetros e incube en un incubador a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante una a dos semanas. Durante este período de una a dos semanas, examine colonias bien aisladas con un microscopio invertido. Una vez que las colonias hayan alcanzado un tamaño suficiente de más de 100 células por colonia, marque las colonias con un rotulador permanente en la parte inferior de la placa.

Al seleccionar una colonia para marcarla, asegúrese de que no haya colonias cercanas alrededor. Aspire el medio y lave el recipiente una vez con X-D-P-B-S utilizando pinzas. Tome un cilindro de clonación estéril y colóquelo suavemente alrededor de la colonia marcada.

Repita esto hasta que cada colonia marcada tenga un cilindro de clonación colocado sobre ella. Añada 100 microlitros de tripsina EDTA a cada cilindro de clonación y devuelva la placa al incubador. Después de cinco minutos, revise las células bajo el microscopio para ver si están redondeándose.

Cuando las células se hayan desprendido, agregue una cantidad igual de medio de cultivo para inactivar la tripsina. Mezcle la suspensión celular con una micropipeta de 200 microlitros y transfiera la suspensión celular a una placa de 60 milímetros que contenga tres mililitros de medio de cultivo precalentado. Etiquete las placas y devuélvalas al incubador Bader tras su aislamiento por adherencia plástica.

Las MSC deberían ser visibles al día siguiente después del siembra. A medida que las células continúan proliferando, las células confluentes deben tener el aspecto de las células mostradas en esta imagen de contraste de fase, donde la mayoría tienen forma de huso o estrellada. El cultivo es apropiado cuando las células alcanzan aproximadamente un 80 % de confluencia.

Después de que la tripsinización desprenda las células, estas deben verse redondeadas y flotando en el medio. Una vez que las MSC se enriquecen mediante clasificación magnética de células, se realiza citometría de flujo para verificar la expresión de marcadores superficiales. Si el enriquecimiento es bueno, las células deben mostrar tinción positiva frente a los marcadores de MSC, CD54 y CD90, pero negativa frente al marcador de HSC CD45; como controles negativos se utilizan los isotipos IgG2a e IgG1.

Cuando las células se siembran a una densidad clonal adecuada, deben formarse colonias a partir de células individuales, como se muestra en este ejemplo. Luego, se pueden utilizar cilindros de clonación para separar las colonias, y las células derivadas de dichas colonias pueden cultivarse por separado. En estos dos ejemplos, las células derivadas de una colonia tienen forma alargada, mientras que las células derivadas de otra colonia son redondas.

Así que les hemos mostrado cómo aislar y enriquecer células madre comunes y aleatorias, y también cómo obtener células derivadas de colonias individuales. Durante este procedimiento, es importante recordar eliminar los coágulos sanguíneos y los restos óseos durante el aislamiento. Utilice la cantidad óptima de anticuerpo durante el enriquecimiento y marque bien las colonias aisladas durante la separación de colonias.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.