Name: Expresión de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia pastoris /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-25T16:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprende a expresar proteínas recombinantes en la levadura Pichia pastoris mediante transformación electrocompetente y Western blot. Este protocolo permite obtener proteínas de alta calidad para estudios funcionales.

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Nos gustaría agradecer a la Fundación Canadiense para la Innovación, el British Columbia Fondo de Desarrollo de conocimientos, y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) para apoyar este trabajo. MT fue apoyado por una beca de la Fundación Centro TULA financiado por la diversidad microbiana y la evolución (CMDE).

<ol><li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+yeast+in+biotechnology%3A+protein+production+and+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li>
<li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li>
<li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li>
<li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li>
</ol>

Expresión de la proteína con la levadura Pichia pastoris metilotrófica como sistema anfitrión se describe en este protocolo. La proteína puede ser secretada en el medio en función del vector de clonación usada. La secreción de la proteína recombinante hace más fácil la posterior purificación. Sin embargo, las condiciones que se muestran pueden tener que ser optimizado para la expresión de proteínas diferentes y los cambios en las condiciones y los tiempos de la expresión puede resultar en niveles de aumento de ...

expresión de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica pichia pastoris</em

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expresión de la proteína microbiana en el pastoris eucariotas Pichia anfitrión ofrece la posibilidad de generar grandes cantidades de proteínas recombinantes en un sistema de expresión rápida y fácil de usar. Como P. microorganismos unicelulares pastoris es fácil de manipular y crece rápidamente en los medios de comunicación de bajo costo en altas densidades de células. Ser una célula eucariota, P. pastoris es capaz de realizar muchas de las modificaciones posteriores a la traducción realizada por el aumento de las células eucariotas y las proteínas recombinantes obtenidas se someten plegamiento de proteínas, procesamiento proteolítico, la formación de enlaces disulfuro y glicosilación [1]. Como la levadura metilotrófica P. pastoris es capaz de metabolizar el metanol como única fuente de carbono. El gran promotor de la alcohol oxidasa, AOX1, está estrechamente regulada e inducidos por el metanol y se utiliza para la expresión del gen de interés. En consecuencia, la expresión de la proteína extraña puede ser inducida mediante la adición de metanol en el medio de cultivo [2, 3]. Otra ventaja importante es la secreción de la proteína recombinante en el medio de cultivo, utilizando una secuencia de señales para orientar la proteína extraña a la vía secretora de P. pastoris. Con bajos niveles de proteína endógena secretada a los medios de comunicación por la propia levadura y no proteínas añadidas a los medios de comunicación, una proteína heteróloga se basa la mayoría de las proteínas totales en el medio y facilita los siguientes pasos de purificación de proteínas [3, 4]. El vector utilizado (pPICZαA) contiene el promotor AOX1 para mejor regulado, metanol inducida por la expresión del gen de interés, la señal de secreción de α-factor de la secreción de la proteína recombinante, un gen de resistencia Zeocin para la selección, tanto en E. coli y Pichia y un péptido C-terminal que contiene el epítopo c-myc y polihistidina (6xHis) etiqueta para la detección y purificación de proteínas recombinantes. También muestra el análisis de Western blot de la proteína recombinante utilizando el específico anti-myc-HRP anticuerpo que reconoce el epítopo c-myc en el vector de los padres.

El protocolo describe la expresión de proteínas utilizando la levadura metilotrófica<em&gt; Pichia pastoris</em&gt;. La preparación de células de levadura electrocompetentes, la transformación del vector con el gen de interés en<em&gt; P. pastoris</em&gt; Y purificación del ADN de levadura también se realizan. Western blot y purificación de proteínas construir los últimos pasos en este protocolo expresión de la proteína.

Expresión de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia pastoris</em

La expresión de proteínas en el huésped eucariota microbiano Pichia pastoris ofrece la posibilidad de generar grandes cantidades de proteína recombinante de manera rápida y...

El siguiente protocolo describe la expresión de proteínas utilizando la levadura metilotrófica opus. Se muestra la preparación de células de levadura electrocompetentes y la transformación del vector que contiene el gen de interés en PPAs, seguida de un paso de purificación de ADN de levadura para verificar la integración adecuada del gen de interés en el genoma de la levadura. Al final, realizaremos la expresión de la proteína recombinante.Hola, soy María del laboratorio de Steven Hallam en el Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Columbia Británica. Soy Marcus, también del laboratorio Helm. Hoy les mostraremos un procedimiento para expresar proteínas recombinantes en la levadura TRO PQ.Past stories.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar proteínas de microorganismos no cedidos donde se ha extraído y archivado el ADN ambiental y bibliotecas metagenómicas. Así que comencemos. La expresión de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia pastoris requiere clonar su gen de interés en el marco correcto dentro de un vector PPA parental.En nuestro experimento, utilizamos el vector PPIC Z alpha A. Este vector contiene el promotor AO X uno para la expresión regulada por metanol del gen de interés, la señal de secreción del factor alfa para la secreción de la proteína recombinante, los genes zaas y de resistencia para selección tanto en e coli como en pic, y un péptido en el extremo C que contiene un epítopo acémico y una etiqueta de polihistidina para la detección y purificación de la proteína recombinante. Antes de la transformación, linealice el vector que contiene su gen de interés mediante digestión con enzimas de restricción. Utilizamos la enzima PME uno, pero pueden emplearse otros sitios de restricción siempre que su inserto no contenga dicho sitio de restricción.Para obtener suficiente ADN del vector linealizado, prepare tres o cuatro reacciones de digestión con restricción de 50 microlitros en tubos separados; después de la digestión, combine todas las soluciones y concentre su construcción. Utilizando una unidad de filtro centrífugo AmCon y una unidad de filtro centrífugo MicroCon, necesitará entre cinco y veinte microgramos de ADN linealizado en cinco a diez microlitros de agua estéril para la transformación en PPA dous. Para preparar PPA dous electrocompetentes, siembre las células en una placa A-Y-P-D-S sin SN cuatro días antes de la transformación prevista, incube a 30 grados Celsius durante uno o dos días o hasta que se formen colonias individuales dos días antes de la transformación.Cultive cinco mililitros del PPA o cepa en medio YPD en un tubo Falcon de 50 mililitros a 30 grados Celsius durante la noche. Coloque el tubo Falcon en un matraz para fijarlo en el agitador un día antes de la transformación. Use 0,25 mililitros de la cultura nocturna para inocular 500 mililitros de medio YPD fresco en un matraz de dos litros.Crecer nuevamente durante la noche en un agitador a 30 grados Celsius hasta un OD 600 de 1,3 a 1,5. El día de la transformación, tener hielo, agua fría estéril y sorbitol un molar a mano. Centrifugar las células a 1500 Gs durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.Después de la centrifugación, suspendemos el precipitado con 500 mililitros de agua estéril fría con hielo. Dependiendo de la capacidad de los tubos de centrifugación, puede ser necesario dividir el volumen en dos tubos separados o realizar varias centrifugaciones. Centrifugue las células nuevamente y resuspenda el precipitado con 250 mililitros de agua estéril fría con hielo.Dependiendo de la capacidad de los tubos de centrífuga, puede combinar los pellet celulares separados en un solo tubo. Al resuspender mediante centrifugación, esta vez vuelva a resuspender el pellet. En 20 mililitros de sorbitol helado y un molar, transfiera las células resuspendidas a un tubo falcón de 50 mililitros y centrifugue.Después de una centrifugación final, resuspenda el precipitado en un mililitro de sorbitol frío con hielo, una molar, hasta un volumen final de aproximadamente 1,5 mililitros. Las células resuspendidas en tubos de microcentrífuga se almacenan en hielo o a cuatro grados Celsius hasta que se utilicen para la transformación. Antes de transformar el constructo linealizado concentrado en células PPA stor, prepare los siguientes reactivos y dispositivos.Llene un tubo de microcentrífuga con un mililitro de sorbitol uno molar y colóquelo en hielo. Coloque una electroforesis de 0,2 centímetros en hielo.Etiquete un tubo de vidrio estéril de 15 mililitros y tenga a mano una varilla de vidrio estéril para pipetear. Transfiera 80 microlitros de las células electrocompetentes previamente preparadas al vial de electroporación de punto dos centímetros, frío sobre hielo.Agregue la solución de ADN plasmídico a las células y mezcle moviendo la punta de la pipeta de un lado a otro. En el vial de electro poración. Incube el vial con las células en hielo durante cinco minutos.A continuación, limpie el exterior del vete con el tejido e impulse las células según los parámetros para levadura brotante recomendados por el fabricante de su dispositivo específico de electroporación. En esta demostración se utiliza un gene Pulser de BioRad con las siguientes condiciones: voltaje de carga de 1500 voltios, capacitancia de 25 microfaradios y resistencia de 200 ohmios inmediatamente después del impulso.Añada un mililitro de sorbitol uno molar frío con hielo al vete. Transfiera el contenido del vete a un tubo estéril de 15 mililitros utilizando una pipeta de vidrio estéril. Incube el tubo a 30 grados Celsius sin agitación durante 1,5 horas.Después de 1,5 horas, las células electro poradas están listas para su siembra. Añada de cinco a diez perlas de vidrio esterilizadas a cada una de cuatro placas YPTS etiquetadas que contengan 100 microgramos por mililitro de Zain. Extienda 250 microlitros de la electro poración.Mezcle en cada placa y agite la placa horizontalmente para distribuir las células uniformemente. Deje secar las placas durante 15 minutos y luego retire las perlas del agro invirtiendo las placas. Envuelva las placas en plástico negro para evitar la degradación del Zain sensible a la luz e incube las placas boca abajo durante dos o tres días a 30 grados Celsius hasta que se formen colonias, una vez que se hayan formado las colonias.Seleccione 12 colonias. Purifíquelas mediante el aislamiento por rayado de los clones en placas frescas de YPDS que contengan 100 microgramos por mililitro de zeína. Para preparar las células PPA para la expresión de proteínas, seleccione una colonia individual de las colonias purificadas de Pichia e inocúlela en 25 mililitros de medio VMGY en un matraz estéril de 250 mililitros y cultive a 30 grados Celsius en un incubador con agitación hasta que el cultivo alcance una DO 600 de entre dos y seis.Cuando las células hayan alcanzado la DO 600 adecuada, prepare un stock de glicerol de las células para almacenamiento. Transfiera 800 microlitros del cultivo celular a un vial criogénico de dos mililitros y agregue 200 microlitros de glicerol esterilizado. Almacene el stock de glicerol a menos 80 grados Celsius.Además, transfiera 1.5 mililitros del cultivo celular a un tubo de microcentrífuga. Recopile las células mediante centrifugación a 1300 GS durante un minuto a temperatura ambiente. Almacene el precipitado a cuatro grados Celsius.Estas células se utilizarán para la purificación de ADN de levadura con el fin de analizar los pichia Irans tras la PCR con cebadores específicos del inserto en un gel agarosa para confirmar que el gen de interés se ha integrado en el genoma de pichia. Transfiera el resto del cultivo de 25 mililitros a un tubo Falcon de 50 mililitros y recupere las células mediante centrifugación a 3000 Gs durante cinco minutos a temperatura ambiente. Decante el sobrenadante y coloque el tubo boca abajo sobre un papel absorbente para eliminar cualquier medio residual. Lave el botón celular resuspendiéndolo mediante vortex o pipeteo repetido en 20 mililitros de medio BMMY y centrifugue.La suspensión celular nuevamente después de decantar, resuspenda el sedimento celular mediante vortex o pipeteo arriba y abajo hasta un OD 600 de 1,0 en BMMY. Medio para inducir la expresión. Transfiera el cultivo a un matraz bafleado de un litro y cubra el matraz con un embudo de 200 mililitros.Recomendamos encarecidamente el uso de matraces con aletas, ya que introducen más oxígeno en el cultivo. Para una expresión proteica eficiente durante la inducción con metanol, incube el matraz en el incubador para continuar el crecimiento a 30 grados Celsius. Es importante que la temperatura no supere los 30 grados Celsius si la temperatura de su incubador presenta fluctuaciones.Establezca la temperatura a 28 grados Celsius. Añada metanol puro esterilizado hasta una concentración final de 0,5 % de metanol cada 24 horas para mantener la inducción. En determinados puntos de tiempo tras el inicio de la expresión, transfiera un mililitro del cultivo a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y centrifugue a 1300 Gs durante 2,5 minutos. A temperatura ambiente, transfiera el sobrenadante a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros separado.Almacene el sobrenadante y los pellet celulares a menos 80 grados Celsius hasta su posterior análisis. Se analizarán las muestras de diferentes puntos temporales para establecer el período óptimo de expresión proteica tras la inducción. A continuación, se muestran algunos resultados representativos de la expresión exitosa de proteínas recombinantes utilizando PIA Pastis como sistema huésped.Esta imagen de inmunotransferencia muestra cuatro proteínas expresadas tras 24 horas de expresión. El anticuerpo utilizado para la inmunodetección fue el anticuerpo HRP acémico. La segunda banda es un control negativo y se cargó con sobrenadante de células que no expresan la proteína recombinante porque fueron transformadas con el vector parental.Acabamos de mostrarle cómo expresar proteínas recombinantes utilizando el huésped eucariota PQ.Plus. Al realizar este procedimiento, es importante tener secuenciado su constructo para confirmar que su gen de interés esté clonado y en la fase correcta, y tener listas todas sus placas y reactivos antes de comenzar. También es fundamental que prepare una cantidad suficiente de plásmido linealizado para obtener un alto número de transformantes antes de la expresión proteica mediante inducción con metanol. Asegúrese de lavar bien sus células para eliminar cualquier rastro residual de glicerol que pueda inhibir la expresión de su proteína.Así que eso es todo. Gracias por ver el video y buena suerte con los experimentos.

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