Expresión de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia pastoris

El siguiente protocolo describe la expresión de proteínas utilizando la levadura metilotrófica opus. Se muestra la preparación de células de levadura electrocompetentes y la transformación del vector que contiene el gen de interés en PPAs, seguida de un paso de purificación de ADN de levadura para verificar la integración adecuada del gen de interés en el genoma de la levadura. Al final, realizaremos la expresión de la proteína recombinante.

Hola, soy María del laboratorio de Steven Hallam en el Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Columbia Británica. Soy Marcus, también del laboratorio Helm. Hoy les mostraremos un procedimiento para expresar proteínas recombinantes en la levadura TRO PQ.Past stories.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar proteínas de microorganismos no cedidos donde se ha extraído y archivado el ADN ambiental y bibliotecas metagenómicas. Así que comencemos. La expresión de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia pastoris requiere clonar su gen de interés en el marco correcto dentro de un vector PPA parental.

En nuestro experimento, utilizamos el vector PPIC Z alpha A. Este vector contiene el promotor AO X uno para la expresión regulada por metanol del gen de interés, la señal de secreción del factor alfa para la secreción de la proteína recombinante, los genes zaas y de resistencia para selección tanto en e coli como en pic, y un péptido en el extremo C que contiene un epítopo acémico y una etiqueta de polihistidina para la detección y purificación de la proteína recombinante. Antes de la transformación, linealice el vector que contiene su gen de interés mediante digestión con enzimas de restricción. Utilizamos la enzima PME uno, pero pueden emplearse otros sitios de restricción siempre que su inserto no contenga dicho sitio de restricción.

Para obtener suficiente ADN del vector linealizado, prepare tres o cuatro reacciones de digestión con restricción de 50 microlitros en tubos separados; después de la digestión, combine todas las soluciones y concentre su construcción. Utilizando una unidad de filtro centrífugo AmCon y una unidad de filtro centrífugo MicroCon, necesitará entre cinco y veinte microgramos de ADN linealizado en cinco a diez microlitros de agua estéril para la transformación en PPA dous. Para preparar PPA dous electrocompetentes, siembre las células en una placa A-Y-P-D-S sin SN cuatro días antes de la transformación prevista, incube a 30 grados Celsius durante uno o dos días o hasta que se formen colonias individuales dos días antes de la transformación.

Cultive cinco mililitros del PPA o cepa en medio YPD en un tubo Falcon de 50 mililitros a 30 grados Celsius durante la noche. Coloque el tubo Falcon en un matraz para fijarlo en el agitador un día antes de la transformación. Use 0,25 mililitros de la cultura nocturna para inocular 500 mililitros de medio YPD fresco en un matraz de dos litros.

Crecer nuevamente durante la noche en un agitador a 30 grados Celsius hasta un OD 600 de 1,3 a 1,5. El día de la transformación, tener hielo, agua fría estéril y sorbitol un molar a mano. Centrifugar las células a 1500 Gs durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Después de la centrifugación, suspendemos el precipitado con 500 mililitros de agua estéril fría con hielo. Dependiendo de la capacidad de los tubos de centrifugación, puede ser necesario dividir el volumen en dos tubos separados o realizar varias centrifugaciones. Centrifugue las células nuevamente y resuspenda el precipitado con 250 mililitros de agua estéril fría con hielo.

Dependiendo de la capacidad de los tubos de centrífuga, puede combinar los pellet celulares separados en un solo tubo. Al resuspender mediante centrifugación, esta vez vuelva a resuspender el pellet. En 20 mililitros de sorbitol helado y un molar, transfiera las células resuspendidas a un tubo falcón de 50 mililitros y centrifugue.

Después de una centrifugación final, resuspenda el precipitado en un mililitro de sorbitol frío con hielo, una molar, hasta un volumen final de aproximadamente 1,5 mililitros. Las células resuspendidas en tubos de microcentrífuga se almacenan en hielo o a cuatro grados Celsius hasta que se utilicen para la transformación. Antes de transformar el constructo linealizado concentrado en células PPA stor, prepare los siguientes reactivos y dispositivos.

Llene un tubo de microcentrífuga con un mililitro de sorbitol uno molar y colóquelo en hielo. Coloque una electroforesis de 0,2 centímetros en hielo.

Etiquete un tubo de vidrio estéril de 15 mililitros y tenga a mano una varilla de vidrio estéril para pipetear. Transfiera 80 microlitros de las células electrocompetentes previamente preparadas al vial de electroporación de punto dos centímetros, frío sobre hielo.

Agregue la solución de ADN plasmídico a las células y mezcle moviendo la punta de la pipeta de un lado a otro. En el vial de electro poración. Incube el vial con las células en hielo durante cinco minutos.

A continuación, limpie el exterior del vete con el tejido e impulse las células según los parámetros para levadura brotante recomendados por el fabricante de su dispositivo específico de electroporación. En esta demostración se utiliza un gene Pulser de BioRad con las siguientes condiciones: voltaje de carga de 1500 voltios, capacitancia de 25 microfaradios y resistencia de 200 ohmios inmediatamente después del impulso.

Añada un mililitro de sorbitol uno molar frío con hielo al vete. Transfiera el contenido del vete a un tubo estéril de 15 mililitros utilizando una pipeta de vidrio estéril. Incube el tubo a 30 grados Celsius sin agitación durante 1,5 horas.

Después de 1,5 horas, las células electro poradas están listas para su siembra. Añada de cinco a diez perlas de vidrio esterilizadas a cada una de cuatro placas YPTS etiquetadas que contengan 100 microgramos por mililitro de Zain. Extienda 250 microlitros de la electro poración.

Mezcle en cada placa y agite la placa horizontalmente para distribuir las células uniformemente. Deje secar las placas durante 15 minutos y luego retire las perlas del agro invirtiendo las placas. Envuelva las placas en plástico negro para evitar la degradación del Zain sensible a la luz e incube las placas boca abajo durante dos o tres días a 30 grados Celsius hasta que se formen colonias, una vez que se hayan formado las colonias.

Seleccione 12 colonias. Purifíquelas mediante el aislamiento por rayado de los clones en placas frescas de YPDS que contengan 100 microgramos por mililitro de zeína. Para preparar las células PPA para la expresión de proteínas, seleccione una colonia individual de las colonias purificadas de Pichia e inocúlela en 25 mililitros de medio VMGY en un matraz estéril de 250 mililitros y cultive a 30 grados Celsius en un incubador con agitación hasta que el cultivo alcance una DO 600 de entre dos y seis.

Cuando las células hayan alcanzado la DO 600 adecuada, prepare un stock de glicerol de las células para almacenamiento. Transfiera 800 microlitros del cultivo celular a un vial criogénico de dos mililitros y agregue 200 microlitros de glicerol esterilizado. Almacene el stock de glicerol a menos 80 grados Celsius.

Además, transfiera 1.5 mililitros del cultivo celular a un tubo de microcentrífuga. Recopile las células mediante centrifugación a 1300 GS durante un minuto a temperatura ambiente. Almacene el precipitado a cuatro grados Celsius.

Estas células se utilizarán para la purificación de ADN de levadura con el fin de analizar los pichia Irans tras la PCR con cebadores específicos del inserto en un gel agarosa para confirmar que el gen de interés se ha integrado en el genoma de pichia. Transfiera el resto del cultivo de 25 mililitros a un tubo Falcon de 50 mililitros y recupere las células mediante centrifugación a 3000 Gs durante cinco minutos a temperatura ambiente. Decante el sobrenadante y coloque el tubo boca abajo sobre un papel absorbente para eliminar cualquier medio residual. Lave el botón celular resuspendiéndolo mediante vortex o pipeteo repetido en 20 mililitros de medio BMMY y centrifugue.

La suspensión celular nuevamente después de decantar, resuspenda el sedimento celular mediante vortex o pipeteo arriba y abajo hasta un OD 600 de 1,0 en BMMY. Medio para inducir la expresión. Transfiera el cultivo a un matraz bafleado de un litro y cubra el matraz con un embudo de 200 mililitros.

Recomendamos encarecidamente el uso de matraces con aletas, ya que introducen más oxígeno en el cultivo. Para una expresión proteica eficiente durante la inducción con metanol, incube el matraz en el incubador para continuar el crecimiento a 30 grados Celsius. Es importante que la temperatura no supere los 30 grados Celsius si la temperatura de su incubador presenta fluctuaciones.

Establezca la temperatura a 28 grados Celsius. Añada metanol puro esterilizado hasta una concentración final de 0,5 % de metanol cada 24 horas para mantener la inducción. En determinados puntos de tiempo tras el inicio de la expresión, transfiera un mililitro del cultivo a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y centrifugue a 1300 Gs durante 2,5 minutos. A temperatura ambiente, transfiera el sobrenadante a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros separado.

Almacene el sobrenadante y los pellet celulares a menos 80 grados Celsius hasta su posterior análisis. Se analizarán las muestras de diferentes puntos temporales para establecer el período óptimo de expresión proteica tras la inducción. A continuación, se muestran algunos resultados representativos de la expresión exitosa de proteínas recombinantes utilizando PIA Pastis como sistema huésped.

Esta imagen de inmunotransferencia muestra cuatro proteínas expresadas tras 24 horas de expresión. El anticuerpo utilizado para la inmunodetección fue el anticuerpo HRP acémico. La segunda banda es un control negativo y se cargó con sobrenadante de células que no expresan la proteína recombinante porque fueron transformadas con el vector parental.

Acabamos de mostrarle cómo expresar proteínas recombinantes utilizando el huésped eucariota PQ.Plus. Al realizar este procedimiento, es importante tener secuenciado su constructo para confirmar que su gen de interés esté clonado y en la fase correcta, y tener listas todas sus placas y reactivos antes de comenzar. También es fundamental que prepare una cantidad suficiente de plásmido linealizado para obtener un alto número de transformantes antes de la expresión proteica mediante inducción con metanol. Asegúrese de lavar bien sus células para eliminar cualquier rastro residual de glicerol que pueda inhibir la expresión de su proteína.

Así que eso es todo. Gracias por ver el video y buena suerte con los experimentos.