La fertilización de Oocitos de Xenopus Utilizando el método de transferencia de acogida

El objetivo general de este procedimiento es obtener embriones en desarrollo derivados de sitios OO que fueron manipulados en cultivo. Esto se logra primero aislado los sitios donantes de OO de una hembra y manipulándolos según se desee en cultivo. El segundo paso del procedimiento consiste en estimular estos citos para que maduren utilizando progesterona y en inyectar hembras huésped potenciales con gonadotropina para estimular la puesta de huevos.

El tercer paso del procedimiento consiste en teñir los citocitos donadores con tintes vitales y preparar una hembra para que sirva como huésped. El paso final del procedimiento es transferir quirúrgicamente los citocitos donadores a la cavidad corporal del huésped, y varias horas después recuperar y fertilizar los óvulos transferidos. En última instancia, embriones que se dividen normalmente derivados de los citocitos donadores manipulados experimentalmente.

Las cito pueden obtenerse y analizarse de la misma manera que los embriones normales. Hola, soy Doug Houston de la Universidad de Iowa. Hoy estamos en el curso Xap de Cold Spring Harbor para mostrarles cómo realizar el procedimiento de transferencia a hospedador.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los papeles de los productos génicos maternos y determinar sus funciones en el desarrollo temprano del embrión. Comencemos. Antes de iniciar la cirugía, asegúrese de que el área quirúrgica esté desinfectada y de que los medios frescos y las herramientas estériles estén preparados.

Sujete una aguja de sutura con el portaagujas en la orientación deseada. Coloque una rana hembra anestesiada sobre su espalda sobre una toallita quirúrgica húmeda. Utilizando pequeñas tijeras de iris, realice una incisión de un centímetro de longitud en la piel en la parte inferior del abdomen, lateral a la línea media.

No corte el músculo abdominal. Utilice pinzas para levantar la capa muscular y la fascia de color blanco circundante. Use tijeras de iris para realizar un único corte rápido y recto hacia abajo a través del músculo.

Extienda la incisión hasta un centímetro para exponer el ovario. Utilice pinzas para sujetar el ovario y extraer un lóbulo. Use tijeras para cortar el lóbulo a nivel de la pared corporal.

Coloque el tejido en una placa de 90 milímetros que contenga medio de cultivo de ovocitos o MCO e inmediatamente evalúe la calidad del ovario bajo un microscopio estereoscópico. Algunos ovocitos pueden ser defoliados con pinzas. Si los ovocitos son firmes y tienen tamaño y coloración uniformes, retire la cantidad deseada de tejido ovárico de la rana y colóquela en una placa de Petri de 90 milímetros con MCO.

Cierre la incisión. Introduzca la aguja unos milímetros laterales a la incisión, asegurándose de atravesar tanto el músculo como la fascia. Utilice pinzas para manipular la aguja, teniendo cuidado de no tirar del extremo del hilo de sutura completamente a través del tejido.

Cierre la herida con un patrón de puntos simples interrumpidos y nudos cuadrados de cirujano. La técnica se describe en detalle en el texto adjunto. Repita la sutura con la capa de piel.

Lave a la hembra con agua desionizada y colóquela en un recipiente de recuperación lleno con agua fría. Inmediatamente después de finalizar la cirugía, use tijeras para subdividir el ovario. Corte los lóbulos individuales, ábralos, aplánelos y córteles en trozos cuadrados de dos centímetros de lado.

Lave con medio limpio y use pinzas. Transfiera cinco o seis fragmentos a una placa fresca de 90 milímetros con medio OCM para aislar los citoídos individuales. Comience transfiriendo uno de los fragmentos a una placa pequeña con medio y llévelo al microscopio de disección.

Utilice pinzas de relojero para extraer manualmente entre tres y 500 ovocitos. Sujete la capa de tejido conectivo que rodea un ovocito en estadio seis completamente desarrollado cerca del tallo con un segundo par de pinzas. Sujete el ovario adyacente al ovocito con el primer par de pinzas.

Tire suavemente sobre el ovocito para rasgar la capa folicular. Extrae con cuidado el ovocito del tejido con éxito. Los ovocitos defoliculados no tienen vasos sanguíneos visibles y son más flexibles que los ovocitos con folículos intactos.

Utilice una pipeta de punta de fuego con tapón de algodón para transferir grupos de 100 a 150 células a placas de cultivo de 60 milímetros que contengan ocho mililitros de MCO. Almacene los ovocitos en sus placas a 18 grados Celsius. Ahora los ovocitos pueden ser microinyectados según se desee con oligonucleótidos antisentido o ARNm siguiendo cualquiera de varios protocolos, y luego cultivados en MCO en un incubador a 18 grados Celsius.

Utilice ovocitos para la transferencia dentro de las 96 horas posteriores al aislamiento, realizado la tarde anterior a la realización de la transferencia. Incube los ovocitos necesarios con progesterona para madurarlos, añadiendo 16 microlitros de progesterona unimolar al medio que contiene los ovocitos, para obtener una concentración final de dos micromolar. Incube durante 10 a 12 horas a 18 grados Celsius la misma tarde, e inyecte de tres a cinco hembras con 1000 unidades de gonadotropina coriónica humana por rana para inducir la puesta de huevos.

Deje a las hembras a temperatura ambiente o a 18 grados Celsius durante la noche por la mañana del traslado. Revise bajo el microscopio estereoscópico para asegurarse de que las citoes cultivadas hayan completado la maduración. Incube con los colorantes vitales y centrifugue a más de 10.000 G durante cinco minutos.

Para reducir el fondo proveniente de los residuos, agregue 80 microlitros del colorante vital apropiado a cada grupo experimental de ovocitos. Incube a temperatura ambiente durante 15 minutos en un agitador. Transfiera los huevos teñidos a una placa de 90 milímetros con o cm fresca y agite brevemente para lavarlos.

Prepare una pipeta para usar en la transferencia de los citozoides. Utilice un lápiz de diamante para marcar una línea en su pipeta aproximadamente dos centímetros por debajo de la porción cónica y quiebrela limpiamente. Esto debería crear una pipeta con un orificio de 1,5 milímetros, lo suficientemente grande como para acomodar un ovocito ígneo.

Pulir la punta hasta que los bordes estén lisos sin cerrar la punta. Trasplante de ovocito. La cirugía debe realizarse lo más rápidamente posible.

Realice una incisión como antes en una hembra anestesiada que esté poniendo huevos de buena calidad. Esta incisión debe tener la longitud mínima necesaria para que apenas entre el orificio de la transferencia. Use una pipeta de menos de un centímetro.

Gire suavemente el platillo con los ovocitos experimentales para reunirlos en el centro del recipiente. Utilice la pipeta de pastoreo preparada para aspirar la mayor cantidad posible. Permita que los ovocitos se asienten en la punta de la pipeta para minimizar la cantidad de líquido transferido a la rana.

Utilice pinzas para agarrar y elevar una aleta de músculo y fascia. Introduzca la punta de la pipeta en la incisión y permita lentamente que las células fluyan hacia la cavidad corporal. Repita el proceso hasta que todos los ovocitos hayan sido transferidos.

No libere la capa muscular para evitar que los ovocitos salgan por la incisión. Use pinzas para sujetar ambos lados de la incisión y acérquelos, permitiendo que las citoos se asienten en la cavidad corporal. Comience a suturar la capa muscular y la fascia como antes, teniendo cuidado de mantener tensión hacia arriba hasta que se ate el primer nudo.

Suture la piel. Enjuague la rana con agua desionizada y permita que se recupere como antes. La rana debería comenzar a poner huevos normalmente después de la operación, empezando de dos a tres horas después de la cirugía.

Recupere los huevos mediante compresión normal cada media hora hasta que la hembra deje de ponerlos, en un recipiente con huevos recolectados. Añada cuatro mililitros de una suspensión de espermatozoides recién recolectados en un XMMR e incube a temperatura ambiente durante cuatro minutos. Inunde y enjuague ampliamente los huevos con agua a temperatura ambiente.

Punto uno: incubar XMMR a temperatura ambiente para permitir la activación y escisión. Utilice cisteína en cualquier momento para eliminar los códigos de gelatina. Los embriones transferidos luego pueden clasificarse en platos separados según el color y cultivarse como embriones normales.

Típicamente, más de dos tercios de los huevos transferidos se activarán en cuestión de minutos tras la fertilización, mostrando una contracción cortical robusta en el polo animal. En la mayoría de los experimentos, más de la mitad de los huevos transferidos experimentarán una primera división normal. A veces, la división se retrasará unos 20 minutos aproximadamente en relación con los huevos huésped en nuestras manos.

Del 30 al 60 % de los embriones transferidos progresan normalmente hasta la gastrulación y sobrevivirán más allá de la etapa neural. Los embriones transferidos conservarán su colorante vital durante muchos días de desarrollo. Los embriones derivados de células control no inyectadas aparecerán normales, como se espera.

Por el contrario, los embriones derivados de ovocitos inyectados con beta catenina y oligonucleótidos antisentido, por ejemplo, tendrán una apariencia centralizada. Acabamos de mostrarle cómo obtener embriones de citozoados manipulados en cultivo.

Al realizar este procedimiento, es importante comenzar con ovocitos donantes sanos y completamente desarrollados, y utilizar hembras receptoras con óvulos de alta calidad. Asimismo, el éxito del método tiende a correlacionarse con la rapidez con que se aíslan los ovocitos y se realizan las cirugías. Por lo tanto, puede ser necesario practicar varias veces antes de obtener resultados consistentes.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.