Name: La disección del Organizador y explantes Animal Polo de Xenopus laevis embriones y de la Asamblea de un ensayo de adhesión celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Aprende la disección de explantes del polo animal y del organizador de embriones de Xenopus laevis junto con un ensayo de adhesión celular para estudiar la migración y el comportamiento celular en biología del desarrollo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Preparación de Cámaras de adhesión (el día antes de la inyección / disección) Cámaras de ensayo de adhesión Si usted tiene un microscopio convencional (óptica localiza sobre el escenario), es ncecessary para hacer una baja altura de la cámara de la adhesión de la siguiente manera. Si se utiliza el microscopio invertido óptica, a continuación, &quot;NUNC Lab-Tek cubreobjetos Recamarado&quot; sólo se puede utilizar, y saltarse los pasos # 1 - 2. <ol><li> Conecte uno de los &quot;presione para sellar aislante de silicio&quot;, en una hoja de 40 x 24 mm cubierta. Presione firmemente el aislante de la cubierta antideslizante en la mesa de trabajo limpia y mira desde el otro lado para asegurarse de que el aislante está bien conectado, sin burbujas de aire. </li><li> Opcional: Ponga las cámaras de adhesión en una placa de Petri de vidrio con papel de filtro Whatman y autoclave en seco en el ciclo de esterilización. Enfriar hasta temperatura ambiente. </li></ol> Revestimiento de la Cámara <ol><li> Ponga una gota de 200 ml de solución de trabajo de la cadherina (10mg/ml) o la fibronectina (20mg/ml) en el centro de una cámara de adhesión en autoclave, con sigmacoated puntas amarillas. Incubar a temperatura ambiente durante 4 horas. </li><li> Tome la solución cadherina o la fibronectina y la transferencia a un tubo de 1,5 ml. Esta solución puede ser reutilizado para próximas dos semanas. </li><li> Dispensar 500 ml de 4% de BSA en 1 × MBS-H para bloquear la cámara. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Aspirar la solución de BSA. Lave la cámara con 500 ml de 1x MBS-H dos veces. Tras el segundo lavado, aspirado de la mayoría de los MBS-H (no completamente), y guárdelo en un recipiente hermético a 4 º C. Esta cámara es buena adherencia para los próximos 2 a 3 días. </li></ol> La disección y la disociación de los explantes Cap Animal <ol><li> Incubar los embriones inyectados en 0.1x MBS-H, se diluye en el autoclave 1x MBS-H, ya que no lleva a algún medio de autoclave pequeños gérmenes que pueden alterar las células animales disociada de la PAC. </li><li> Hacer agarosa 1x Barth platos y CMF-MBS placas de agarosa con platos de 60 mm, por lo menos tanto como el número de muestras. Vierta autoclave 1x MBS-H a las placas de 1 x Barth. Para CMF-MBS platos, verter 10 ml de CMF-MBS. </li><li> Cuando los embriones se la etapa 8.5, iniciar la disección de las tapas de los animales en un plato Barth 1x. 10 a 15 explantes por las muestras suelen ser suficientes para un experimento. </li><li> La transferencia de los explantes tapa de los animales a una placa de CMF-MBS. Incubar los explantes de 45 a 60 minutos hasta que los explantes están completamente disociados. Agitaciones suaves cada 15 minutos le ayudará a la disociación. </li></ol> Ensayo de adhesión celular <ol><li> La siembra de las células: Dispensar 500 ml de 1x MBS-H a la cámara de adherencia preparada en los pasos de los apartados anteriores, las Cámaras de ensayo de adhesión y de revestimiento de la Cámara. Transferencia de las células animales disociada tapa de la placa de CMF-MBS a la cámara de adherencia utilizando P200 con puntas amarillas sigmacoated y le cortó-. </li><li> Opcional: Si es posible, aspirar con cuidado el medio hasta aproximadamente 2 / 3 a la mitad, sin exponer las células a la atmósfera. Añadir aproximadamente la misma cantidad de agua dulce MBS-H, para asegurarse de que el medio contiene suficiente Ca 2 + y Mg 2 +. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 45 - 90 minutos. Comprobar que las células de vez en cuando para ver si están vinculados a la superficie inferior. </li><li> Ahora usted puede tomar la imagen de las células bajo un microscopio. </li><li> Ponga la cámara de adhesión en un portaobjetos de la red. Alinear una de las esquinas de la cámara de la adhesión a una esquina de la diapositiva red. Contar y anotar el número de células adheridas en varias redes diferentes. </li><li> Vierta 1 litro de MBS-H en un cubo de plástico de gran tamaño (por ejemplo, Tupperware, etc.) Coloque cuidadosamente la cámara de diapositivas adhesión al fondo de la cubeta. Gírelo en el agitador orbital durante cinco minutos a baja velocidad (50 - 60 RPM). </li><li> Ponga la cámara de adhesión de nuevo en la red de diapositivas, la alineación de la misma esquina de la cámara a la misma esquina de la diapositiva de la red, como se hizo en el paso 5 de este artículo, ensayo de adhesión celular. Cuente el número de células que permanecen unidos en la misma red que ha contado antes del lavado. Calcular el porcentaje de células que permanecen unidas después del lavado. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>1x MBS-H</td><td>Tampón</td><td></td><td></td><td>Barth modificado&amp;rsquo;s medio: receta para 1 L: 5,14 g de NaCl, 75 mg de KCl, 0,2 g de NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 0.2 g de MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 60 mg de CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 80 mg Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)2&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. 38 g de HEPES, ácido libre. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Autoclavar.</td></tr><tr><td>CMF-MBS</td><td>Tampón</td><td></td><td></td><td>Este es Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-versión libre de MBS-H. Receta de 500 mL: 2,57 g de NaCl, 37,5 mg de KCl, 0,1 g de NaHCO₃&lt;sub&gt;3/sub&gt; 1,19 g de HEPES, ácido libre. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Autoclavar.</td></tr><tr><td>agarosa al 1 %/Barth 1x&amp;rsquo;placas s</td><td></td><td></td><td></td><td>tantos como el número de muestras</td></tr><tr><td>placas de agarosa al 1 %/CMF-MBS</td><td></td><td></td><td></td><td>tantos como el número de muestras</td></tr><tr><td>Cádmherina E/Fc quimérica </td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2278</td><td>Disuelva 0,1 mg de E-cadherina sólida en 100 μl de MBS-H 1x que contenga 40 % de glicerol para obtener un stock maestro 100x (1,0 mg/ml). Almacénelo en &amp;#8211;20 &amp;deg;C. Realice una dilución 1/100 con MBS-H 1x para obtener una solución de trabajo de 10 μg/ml justo antes de usarla. Necesitará 200 μl por muestra de esta solución de trabajo.</td></tr><tr><td>Fibronectina, solución al 0,1 % </td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-1141</td><td>Esta solución preelaborada puede utilizarse como solución madre 50x. Realice una dilución 1/50 con MBS-H 1x para obtener 20 &amp;mu;solución de trabajo g/mL justo antes de usarla. Necesita 200 &amp;mu;L por muestras de esta solución de trabajo. NO recomiendo usar fibronectina sólida, porque es difícil disolverla a una concentración del 0,1 % para preparar la solución madre. Aunque es más costosa, esta solución preelaborada al 0,1 % es preferible para obtener resultados consistentes.</td></tr><tr><td>4% BSA / MBS-H</td><td>Tampón</td><td></td><td></td><td>BSA: fracción V de grado biología molecular</td></tr><tr><td>Puntas amarillas Sigmacoted </td><td>Herramienta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos n.º 1</td><td></td><td></td><td></td><td>40 mm x 24 mm o 60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Aislante de silicona de sellado por presión</td><td>Herramienta</td><td>Glace Bio-Labs</td><td>JTR20-2.5</td><td>2,5 mm de profundidad x 20 mm de diámetro</td></tr><tr><td>NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Herramienta</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-471</td><td>2 pocillos/placas</td></tr><tr><td>Lámina de vidrio con rejilla</td><td>Herramienta</td><td></td><td></td><td>o retículo de Finder para el recuento de células</td></tr></tbody></table>

la disección del organizador y explantes animal polo de xenopus laevis embriones y de la asamblea de un ensayo de adhesión celular

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Este video muestra la técnica utilizada para la preparación de organizador y explantes de animales polo de Xenopus laevis embriones, incluyendo el uso de la cuchilla de cejas - una herramienta especializada disección hecha de una de las cejas. El protocolo para el montaje de un ensayo de adhesión se da también, que las sondas para detectar la presencia de moléculas de adhesión clave presentes en el organizador de la superficie de las células animales o polos que son fundamentales para un desarrollo adecuado.

La disección del Organizador y explantes Animal Polo de Xenopus laevis embriones y de la Asamblea de un ensayo de adhesión celular

Hola, mi nombre es Sochi Agata. Soy científica posdoctoral en el laboratorio del Dr. Ken Cho, en el departamento de biología del desarrollo y celular de la Universidad de California en Irvine. Hoy demostraré la disección y el ensayo de adhesión del explante de casquete animal o del expandente organizador a partir del embrión de rana XUS.Este procedimiento puede utilizarse para estudiar las características de adhesión celular y la morfología celular de las células derivadas de tejido disecado. Este procedimiento implica la disección de un tejido determinado del embrión de rana Xenopus, su disociación en un medio libre de calcio y magnesio, y luego la transferencia de las células disociadas a una condición que contiene calcio y magnesio, sobre un portaobjetos recubierto con moléculas de adhesión celular. Y mediante este procedimiento, podemos estudiar el comportamiento celular, la migración celular y las características de adhesión de las células disecadas de Xenopus.Está bien, en todo este procedimiento de disección del embrión y ensayo de adhesión, utilizo primero herramientas especiales importadas. Este es un medio libre de calcio y magnesio, un x-bar, con 1 % de agar rociado. Y e

dissection-organizer-animal-pole-explants-from-xenopus-laevis-embryos

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este ensayo evalúa la capacidad de una molécula de señalización, la proteína morfogenética ósea 7 aquí (BMP7), para reorientar axones de la comisura. Un explante de la médula espinal dorsal de embriones se cultivaron junto a un conjunto de células secretoras de COS los factores de crecimiento candidato. Reorientado axones de la comisura de crecimiento en el explante se visualizan mediante técnicas de inmunohistoquímica.

Ensayo de la capacidad de difusible moléculas de señalización para reorientar embrionarias axones de la comisura espinal

Animales que sobreexpresan genes tapas de producto (s), se trasplanta al costado de...

Determinación del tejido Con el trasplante de Cap Animal (ACT) en el ensayo Xenopus laevis</em

Xenopus epitelios embrionarios son un sistema modelo ideal para estudiar los comportamientos celulares, tales como el desarrollo de la polaridad y cambiar de forma durante la morfogénesis epitelial. Histología tradicional de muestras fijas cada vez se complementa con células vivas de imagen confocal. Aquí se demuestra métodos para aislar los tejidos de rana y visualizar en directo las células epiteliales y su citoesqueleto utilizando células vivas, la microscopía confocal.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Ectodermo embrionario de Xenopus se ha convertido en un atractivo modelo para el estudio de la polaridad celular. Un ensayo se describe, en el que la distribución subcelular de las proteínas fluorescentes se evalúa en las células de ectodermo. Este protocolo ayudará a contestar preguntas relacionadas con el control espacial de la señalización.

Translocación polarizado de proteínas fluorescentes en Xenopus Ectodermo en respuesta a la señalización de Wnt

Los cultivos neuronales de explantes de<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus laevis proporciona un sistema modelo ideal para el estudio de la especificación del destino celular y la función fisiológica de las células individuales de la retina en cultivo de células primarias. Aquí se presenta una técnica para la disección de tejidos retinales y la generación de cultivos de células primarias que se toman imágenes de la actividad del calcio y se analizaron mediante hibridación in situ.

Disección, Cultura y Análisis de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tejido de la retina embrionaria

Este protocolo describe cómo diseccionar la cresta neural craneal premigratorio (NC) de neurulas Xenopus laevis. Estos explantes se pueden sembrar en fibronectina y cultivadas in vitro, o injertados en embriones de acogida. Esta técnica permite el estudio de los mecanismos de la NC transición epitelio-mesénquima, la migración y la diferenciación.

La disección de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest para<em&gt; In vitro</em&gt; Explante cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trasplante

El manuscrito que aquí ofrece un simple conjunto de métodos para el análisis de la secreción y la difusión de ligandos marcados con fluorescencia en Xenopus. Esto proporciona un contexto para probar la capacidad de otras proteínas para modificar la distribución de ligando y permitir que los experimentos que pueden dar información sobre los mecanismos que regulan los gradientes de morfogenes.

Uso del análisis confocal de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados

En los embriones de Xenopus, las células del techo del blastocelo son pluripotentes y pueden programarse para generar varios tejidos. Aquí, describimos los protocolos para usar explantes de techo de blastocoel de anfibios como un sistema de ensayo para investigar las características clave in vivo e in vitro del desarrollo neuronal temprano.

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Presentamos un protocolo de dos partes que combina imágenes fluorescentes de calcio con hibridación in situ, permitiendo al experimentador correlacionar patrones de actividad de calcio con perfiles de expresión génica a nivel de una sola célula.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Describimos un protocolo simple para desarrollar organoides epiteliales mucociliares a partir de células ectoderm profundas aisladas de embriones Xenopus laevis. Los progenitores multipotentes regeneran precursores de células de copa epitelial y permiten el seguimiento en vivo de la iniciación y progresión de las transiciones celulares en la superficie de los organoides.

Organoides epiteliales mucocilios de células embrionarias de Xenopus: generación, cultura e imágenes en vivo de alta resolución

Aprende la disección de explantes del polo animal y del organizador de embriones de Xenopus laevis junto con un ensayo de adhesión celular para estudiar la migración y el comportamiento celular en biología del desarrollo.

La disección del Organizador y explantes Animal Polo de Xenopus laevis embriones y de la Asamblea de un ensayo de adhesión celular (Video) | JoVE Journal

La disección del Organizador y explantes Animal Polo de Xenopus laevis embriones y de la Asamblea de un ensayo de adhesión celular

Explorar más videos