Aplicación de métodos de flujo detenido Cinética para investigar el mecanismo de acción de una proteína de reparación del ADN

Esta es una presentación de dos métodos de flujo detenido para medir la cinética de reacción de la proteína de reparación de errores de emparejamiento de ADN mush dos mush seis A. Mush dos mush seis reconoce errores de emparejamiento de pares de bases en el ADN y señala la reparación en una reacción impulsada por ATP. El primer método mide la unión de mush dos mush seis al ADN mediante el aumento de la fluorescencia de una base de dos amino purina colocada adyacente a un par GT con error en el ADN. Los reactivos se mezclan en un instrumento de flujo detenido y se monitorean a lo largo del tiempo para determinar la constante de velocidad.

El segundo método mide la actividad de mush dos mush seis en la TPA mediante un reportero de proteína fluorescente de unión a fosfato. Los reactivos se mezclan en un flujo detenido y se monitorean a lo largo del tiempo. Para determinar las constantes de velocidad de la hidrólisis de TPA y la liberación de fosfato, los datos cinéticos resultantes elucidan el mecanismo de acción de mush dos mush seis en la reparación de errores de emparejamiento del ADN.

Hola, soy Noah Biro del Laboratorio de MONI en el departamento de biología molecular y bioquímica de la Universidad Wesleyan. Hola, soy DJ J, también del Laboratorio de Man en la Universidad Wesleyan. Y yo soy Chris Dset, también del Laboratorio de JI'S.

Hoy les mostraremos dos ensayos basados en fluorescencia para monitorear la cinética de una reacción en la escala de tiempo de milisegundos. Utilizamos estos métodos en nuestro laboratorio para estudiar cómo la proteína de reparación DA, meh seis, reconoce pares de bases desemparejados en el ADN e inicia la reparación. Así que comencemos.

Antes de que pueda comenzar este procedimiento, deben estar disponibles fácilmente los reactivos proteicos y de ADN necesarios. Obtenga la proteína s visier mush two mush six que previamente se sobreexpresó en coli y se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico y afinidad. Para generar los reactivos de ADN, adquiera ADN de cadena sencilla modificado con el análogo nucleotídico fluorescente amino purina, purifique las cadenas mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida y empareje las cadenas para generar ADN bicatenario con desemparejamiento, conteniendo dos amino purinas adyacentes a un desemparejamiento GT.

De manera similar, prepare ADN sin etiquetar a partir de ADN de cadena sencilla no modificado. Las secuencias de ADN utilizadas aquí se pueden encontrar en la parte escrita de este protocolo. Durante todo este procedimiento, asegúrese de mantener una alta integridad experimental utilizando productos químicos de alta calidad para minimizar las impurezas fluorescentes.

También filtre todas las soluciones stock a través de una membrana de 0,2 micrómetros para eliminar partículas que podrían obstruir el instrumento de flujo detenido. Para preparar los experimentos de unión al ADN, prepare muestras con un volumen final de 400 microlitros por muestra, lo cual es suficiente para aproximadamente 10 trazas cinéticas. Mantenga las muestras en hielo.

Para mantener la actividad proteica, prepare la muestra de ADN a 0,12 micromolar y la muestra mush dos mush seis a 0,8 micromolar en tampón de unión a ADN. Esto dará como resultado concentraciones finales de 0,06 micromolar de ADN y 0,4 micromolar de mush dos mush seis tras la mezcla uno a uno en el flujo detenido.

Un instrumento de flujo detenido utiliza un motor de accionamiento para impulsar simultánea y rápidamente las soluciones de reactivos desde las jeringas de accionamiento hacia un dispositivo de mezclado. La solución mezclada fluye luego hacia una celda de observación para la recopilación de datos y la preparación del instrumento. Primero, asegúrese de que la computadora y el controlador estén apagados.

Luego encienda el baño de agua circulante para enfriar la lámpara y encienda la lámpara. Ajuste el monocromador a la longitud de onda de excitación deseada, que es 315 nanómetros. Para la dos amino purina, ajuste el ancho de SL al valor deseado.

Inserte un filtro de corte de 350 nanómetros en el tubo fotomultiplicador o PMT para recoger la señal fluorescente de las dos aminopurinas. Encienda el controlador y la computadora. A continuación, encienda el baño de agua circulante.

Esto llena la camisa de agua alrededor de las jeringas de accionamiento para mantener la reactancia a la temperatura deseada durante el experimento. Finalmente, ejecute el programa de flujo detenido en el menú de control P-M-T-H-V. Establezca el voltaje del PMT, que puede variar inicialmente para ajustar la sensibilidad del PMT, pero que debe mantenerse constante.

Durante el experimento, mida la corriente oscura para corregir el ruido eléctrico de fondo. A continuación, lave las jeringas del impulsor de flujo detenido y la celda de observación. Coloque la válvula de carga de la muestra en la posición de carga.

Llene una jeringa de un mililitro con agua desionizada filtrada. Conecte la jeringa al puerto de carga situado debajo de la jeringa motriz e introduzca agua entre las dos jeringas. Repita el proceso dos veces para cada una.

Llene la jeringa que se utilizará en el experimento. Luego, llene las jeringas de impulsión con agua para lavar la celda de observación. Cambie la válvula de carga de la muestra a la posición de fuego.

Utilice el comando de ajuste del impulsor de la jeringa para bajar la placa de impulso y empujar el agua a través de la celda de observación y hacia la línea de salida. Tenga cuidado de no empujar el émbolo hasta el extremo final de la jeringa de impulso. Finalmente, eleve la placa de impulso y cambie la válvula a la posición de carga.

Lave una vez con tampón de reacción y vacíe las jeringas. Para comenzar los experimentos de unión al ADN, transfiera cada muestra desde el tubo a una jeringa nueva de un mililitro. Conecte cada jeringa a un puerto de carga e impulse la solución hacia la jeringa motriz.

Elimine cualquier burbuja de aire empujando manualmente la solución entre las dos jeringas con pausas intermitentes. Luego, baje la placa de accionamiento hasta que haga contacto con la parte superior de las jeringas de accionamiento. Para la recopilación de datos, abra la ventana de canales de tiempo establecidos.

Seleccione el modo de canal de recopilación de datos para el análisis y el número de trazas que se recopilarán. Ingrese el tiempo de recopilación de datos durante el cual se recopilarán 1000 puntos de datos. A continuación, coloque la válvula en la posición de encendido y haga clic en el botón para recopilar datos.

Esta acción inicia la mezcla de mush dos, mush seis y ADN, seguida por el inicio de la reacción en la observación. Se monitorea la emisión fluorescente celular de dos amino purina durante un período. Recolecte al menos cinco trazas cinéticas para obtener un conjunto de datos de alta calidad y guarde el archivo cuando el experimento haya finalizado.

Abra cada archivo de datos y promedie múltiples trazas cinéticas. Luego guarde el archivo de datos promediado y expórtelo a un programa de graficación para su análisis. Finalmente, apague la lámpara, lave extensamente las jeringas y la celda de observación con agua.

Luego apague el resto del equipo, excepto el baño de agua circulante. Este se deja encendido durante 15 minutos adicionales para enfriar la lámpara. Los datos cinéticos de la unión de mush dos mush seis al ADN desemparejado se ajustan mejor mediante una función exponencial simple, que proporciona una velocidad rápida de asociación del orden de 10 a la séptima por molar por segundo. Experimentos análogos de flujo detenido arrojan la velocidad de disociación del complejo de mush dos mush seis con ADN desemparejado, que ocurre muy lentamente, entre 0,01 y 0,02 por segundo.

Estos resultados proporcionan una medida directa de la velocidad y afinidad con las que mush dos mush seis se une a un par de bases desemparejadas durante la reacción de reparación del ADN. A continuación, se realizará un experimento de flujo detenido para medir la actividad ATPasa de mush dos mush seis.

Bajo las condiciones del estado previo al estudio para este ensayo, es absolutamente esencial evitar el uso de vidrio en todas las etapas de la preparación de reactivos, incluida la purificación de proteínas y ADN, con el fin de minimizar los niveles de fosfato de fondo. La proteína fijadora de fosfato, o PBP, purificada de e coli y marcada con el fluoróforo MDCC, se utiliza como indicador para medir la liberación de fosfato tras la hidrólisis de A TP. M-D-C-C-P-B-P es un indicador robusto de la hidrólisis del estado previo al estudio de A TP y de la cinética de liberación de fosfato. Se une al fosfato previo rápidamente y con alta afinidad, lo que provoca un gran aumento en la fluorescencia de MDCC.

Prepare una muestra con cuatro micromolar de mush, dos mush seis proteína con o sin seis micromolar de ADN desemparejado. Prepare otra muestra con un milimolar de HEP recién disuelto y 20 micromolar de M-D-C-C-P-V-P para eliminar cualquier fosfato contaminante. Añada purina, nucleósido, fosforilasa y siete metil guanina a las muestras e incube en hielo durante al menos 20 minutos.

Prepare el instrumento de flujo detenido como se describió anteriormente. Además, elimine cualquier contaminante de fosfato de las jeringas de accionamiento con purina, nucleósido, fosforilo y siete metil guanina. Incube durante 20 minutos. Establezca la longitud de onda de excitación en 425 nanómetros y utilice un filtro de corte a 450 nanómetros con el PMT para la detección de la fluorescencia de M-D-C-C-P-B-P.

Cargue las jeringas de accionamiento con las muestras como se describió anteriormente. Establezca los parámetros de recopilación de datos y haga clic en recopilar datos para mezclar mush dos mush seis con un TP y monitorear la liberación de fosfato mediante M-D-C-C-P-B-P por mush dos mush seis y el aumento acoplado en la fluorescencia de M-D-C-C-P-P-P. Con el tiempo, recopile al menos cinco trazas cinéticas para obtener un conjunto de datos de alta calidad, promedie múltiples trazas cinéticas y exporte el archivo de datos para su análisis como se describió anteriormente. Prepare una curva de calibración para determinar la relación lineal entre la concentración de fosfato y la fluorescencia de M-D-C-C-P-P-P; primero mezcle M-D-C-C-P-P-P con diferentes concentraciones de fosfato bajo las mismas condiciones experimentales en el flujo detenido.

Luego, grafique la fluorescencia máxima M-D-C-C-P-P-P frente a cada concentración de fosfato para la curva de calibración y utilice la pendiente para determinar la concentración de fosfato en las reacciones mush dos mush seis. Represente la concentración de fosfato frente al tiempo y ajuste los datos a una función exponencial y a una función lineal. Esta función describe un estallido de hidrólisis de A TP y liberación de fosfato en el estado pre-estudio A, seguido de la fase lineal en estado estacionario de la reacción. Los datos cinéticos muestran que mush dos mush seis hidroliza A TP y libera fosfato rápidamente a 1,4 por segundo en el primer ciclo catalítico.

A continuación se produce una etapa lenta en la reacción que limita los ciclos subsiguientes a una constante catalítica en estado estacionario siete veces más lenta, de 0,2 por segundo. Sin embargo, cuando mush to mush seis se une al ADN con desemparejamiento, se suprime el estallido de hidrólisis de TP y la liberación de fosfato. Estos resultados demuestran directamente que, al unirse a un par de bases desemparejado, el ADN mush to mush seis cambia a un estado con TP unido.

Este cambio es un paso crítico en la reacción de reparación del ADN. Acabamos de mostrarle cómo utilizar un instrumento de flujo detenido para medir las velocidades de una reacción en tiempo real. Dichas mediciones han avanzado nuestro entendimiento del mecanismo de acción de MASH dos, MASH seis y de la reparación de errores de apareamiento en el ADN.

Al realizar este tipo de experimentos, es importante recordar el uso de reactivos de alta calidad, incluyendo ADN y proteína muy puros, y tener especial cuidado para detectar contaminación por fosfatos en el ensayo de ATP. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.